286g/ L，反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中MgCl2S0.lg/L 时，NY101的产量最高。
[0050] 实施例4:
[0051] 最佳反应温度的确定
[0052] 取实施例1中的M301菌体沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管 中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，底物甜菊苷为2. 70g/L，UDP-葡萄糖 为2. 70g/L。按上述方法取平行样，分别于20、25、30、37°C，150rpm进行催化反应，反应24h 后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中温度为30°C时，NY101的产量 最尚。
[0053] 实施例5:
[0054] 最佳反应pH的确定
[0055] 取实施例1中的M301菌体沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管 中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液，底物甜菊苷为2. 70g/L，UDP-葡萄糖为2. 70g/ L。按上述方法取平行样，其中pH分别调至5. 0、6. 0、7. 0、7. 5、8. 0、9. 0。于30°C，150rpm进 行催化反应，反应24h后，取样品离心，将上清样品进行HPLC分析。其中pH为8. 0时，NY101 的广量最尚。
[0056] 实施例6 :
[0057] 最佳缓冲液的确定
[0058] 取实施例1中的菌体M301沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管 中，加入终浓度为2. 70g/L的底物甜菊苷，UDP-葡萄糖为2. 70g/L。按上述方法，取平行样， 并分别加入PH8. 0的Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液。反应24h后，取样 品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中在Tris-HCl缓冲液中反应时，NY101 的广量最尚。
[0059] 实施例7 :
[0060] 以甜菊苷（stevioside)为底物利用再生循环系统酶法制备NY101 (路线二）
[0061] 在本实施例中，使用蔗糖、蔗糖合成酶M302以及UDP-葡萄糖组成的UDP-葡萄糖 再生循环体系作为葡萄糖基供体。
[0062] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例2中的方法，转移 至5ml离心管中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，底物甜菊苷为2. 70g/ L，UDP-葡萄糖为2. 70g/L，蔗糖为34. 23g/L。加入粗酶液后，起始反应。37°C恒温摇床以 150rpm振荡24h，100°C煮沸终止反应。13000g离心lOmin，取上清作为样品。HPLC方法检 测反应体系中NY101的含量。实验结果表明，NY101的产量最高。
[0063] 实施例8:
[0064] M301酶添加量的选择
[0065] 取实施例1中的菌体M301沉淀和M302菌体沉淀35mg，按照实施例7中的方法，转 移至5ml离心管中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，底物甜菊苷为2. 70g/ L，UDP-葡萄糖为2. 70g/L，蔗糖为34. 23g/L。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为 18. 92、37. 84、113. 51、170. 27、227. 03g/LM301的粗酶液。反应24h后，取样品煮沸终止后 离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加227. 03g/LM301粗酶液反应时，NY101的产量 最尚。
[0066] 实施例9:
[0067] 最佳底物添加量
[0068] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例7中的方法，转移至 5ml离心管中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，蔗糖为34. 23g/L，及UDP-葡 萄糖为0. 676g/L，及底物甜菊苷。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为0. 676、 0· 901、1· 35、2· 70、5· 41、13· 51、27· 03、54· 05g/L的甜菊苷（stevioside)。反应 24h后，取 样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加2. 70g/L底物时，NY101的产 量最尚。
[0069] 实施例10 :
[0070] 最佳辅酶添加量
[0071] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例7中的方法，转移至 5ml离心管中，加入终浓度为0. 1M的Tris-HCl缓冲液（pH8. 0)，底物甜菊苷为2. 70g/L，蔗 糖为34. 23g/L，及UDP-葡萄糖。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为5. 41、2. 70、 1. 35、0· 676、0· 270、0· 135、0· 0541、0· 0270、(X0135g/L的辅酶。反应 24h后，取样品煮沸终 止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加0. 676g/L辅酶时，NY101的产量最高。
[0072] 实施例11 :
[0073] NY101结构分析
[0074] 取适量NY101，溶于氘代吡啶中，设置参数，进行氢、碳及二维核磁共振谱分析，根 据核磁谱图中碳氢相互关系解析NY101结构。
[0075] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及其特点，旨在让本领域的技术人员能够 容易理解本发明的内容并据以实施，并不能以此来限制本发明的保护范围。但凡根据本发 明精神实质所做的等效变化或者修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物，其特征在于：结构式如下：2. 根据权利要求1所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特征在 于：以甜菊苷为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶的催化 作用下反应生成甜菊糖衍生物。3. 根据权利要求1所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特征在 于：所述的葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再 生循环体系。4. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：所述的UDP-葡萄糖基转移酶，蔗糖合成酶，都由南京诺云生物科技有限公司发酵 生产部提供。5. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：所述的UDP-葡萄糖的用量为0. 0135~5. 41g/L ;蔗糖的用量为34. 23~68. 46g/ L ;蔗糖合成酶的用量按湿菌体计为18. 92~94. 59g/L。6. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：在微生物宿主中表达UDP-葡萄糖基转移酶，所述微生物宿主选自大肠杆菌、芽胞 杆菌、酵母、曲霉菌或毕赤酵母。7. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：所述反应在MgCl2浓度为0~0. 286g/L，温度为20~37°C，pH5. 0~9. 0的水相 体系中进行，反应时间为0. 5~72h。8. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：所述反应在pH8. 0的Tris-HCl缓冲液中进行。9. 根据权利要求2或3所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法，其特 征在于：所述反应的糖基转移酶的添加量为18. 92~227. 03g/L，底物起始浓度为0. 676~ 54. 05g/L，辅酶的添加量为0· 0135~5. 41g/L。10.根据权利要求1所述的甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的应用，其特征在于： 可应用于食品，饮料，烟草产品，调味品，日用化工产品，药物组分，营养保健产品，口腔卫生 产品或化妆品。
【专利摘要】本发明涉及一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用，属于食品化工领域。该方法以甜菊苷为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，利用UDP-葡萄糖基转移酶，在适当的温度、pH、盐浓度、底物浓度等条件下，通过酶催化得到了全新结构的甜菊糖衍生物NY101。本发明提供的甜菊苷生物转化制备甜菊糖衍生物NY101的方法，操作简便，成本低，转化效率高，可达>90％；提纯容易且纯度高，可达>95％，可用于食品与饮料业，具有巨大的潜在应用价值。
【IPC分类】A61K47/26, A23L2/60, C07H15/256, C12P19/18, C07H1/00, A23L27/30, A23L29/30
【公开号】CN105348337
【申请号】CN201510807932
【发明人】朱惠霖, 丁雪峰, 张永正
【申请人】南京诺云生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月19日