靶核酸的自折叠扩增的制作方法

专利名称：靶核酸的自折叠扩增的制作方法
靶核酸的自折叠扩增
1.发明领域本申请涉及一种用于选择性扩增ー个或多个靶多核苷酸序列(通常在较长的多核苷酸模板内)的试剂盒和方法以及由该方法所获得的扩增反应混合物。具体地讲，所述试剂盒包含用于引发引物延伸(超过靶序列的长度)以形成单链DNA产物的复合引物(composite primer),和任选地,用于确定产生引物延伸的单链DNA产物的3’末端(defined 3’ end)序列区域的工具(means)。所述复合引物包含5’启动子部分和与革巴序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分。所述用于确定产生单链DNA产物的3’末端序列区域的工具可以是通过限制酶(或其它酶)切割或阻断紧邻靶序列的5’末端上游多核苷酸模片K区域(immediately upstream of the 5’ end of the target sequence),或者是阻断紧邻靶序列的5’末端上游进行杂交的核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸(blockingoligonucleotide)或模板转换寡核苷酸(template switching oligonucleotide, TSO))。 单链DNA产物的3’末端部分与同一单链DNA产物中的互补序列通过自折叠(self-folding)杂交，形成柄- -环结构(handle-stem-loop structure),该结构包含(i) 一包含启动子部分的5’单链柄；(ii) 一包含彼此杂交形成互补的单链DNA产物的3’末端部分的双链茎；和任选地，(iii) 一介于该杂交序列之间的序列的单链环。柄-茎-环结构的3’末端以5’单链柄为模板被进ー步延伸以形成双链启动子，该双链启动子进而引发靶序列的转录。所述扩增反应混合物包含扩增的核糖核苷酸靶序列、复合弓I物和自折叠单链DNA产物。2.
背景技术：
核酸扩增技术可通过少量核苷酸进行多拷贝扩増。扩增技术已广泛应用于，包括例如诊断、药物开发、法医调查、环境分析和食品检验中。有许多熟知的用于体外扩增核酸序列的方法，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、复制酶介导的扩增、链-置换扩增(SDA)、“滚环(rolling circle) ”型扩增和各种基于核酸序列的扩增(NASBA)和转录介导的扩增(TMA)方法。这些方法使用不同的技术产生扩增的序列，这些扩增的序列可通过多种方法来检测。PCR扩增使用DNA聚合酶、寡核苷酸引物和热循环来合成双链DNA(dsDNA)或由cDNA形成的dsDNA的多拷贝(參见例如Mullis等人的美国专利第4，683，195,4, 683，202和4，800，159号)。LCR扩增使用过量的与邻接(contiguous)祀序列杂交并连接形成与原始祀互补的融合探针的单链探针的两个互补对，其在杂交、连接和变性的多个循环中融合探针可作为模板进行进一歩融合(參见例如Backman等人的美国专利第5，516，663号和EP 0320308B1)。复制酶介导的扩增使用与被分析序列相连的自复制RNA序列和复制酶(例如Q β -复制酶)，来合成对所选复制酶有特异性的自复制序列(例如QP病毒序列)的多拷贝(參见例如Kramer等人的美国专利第4，786，600号)。扩增的序列可作为被分析序列的替代或报道分子被检测出。SDA扩增使用含有限制性内切核酸酶的识别位点的引物，使得该内切核酸酶在包括靶序列的化学修饰dsDNA链上打开缺ロ，然后进行一系列引物延伸和链置换步骤(參见例如Walker等人的美国专利第5，422，252A号和Nadeau等人的美国专利第5，547，861号)。“滚环”型扩增通过环状或连环的(concatenated)核酸结构为模板，复制形成多个单链拷贝(參见例如Kool的美国专利第5，714，320号和Ste_er等人的美国专利第5，834，252号)。TMA扩增是指通过从核酸模板产生多个转录物来扩增序列的方法。这样的方法一般使用ー种或多种寡核苷酸(其中ー种提供启动子序列)和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶以靶序列附近形成功能性启动子序列，然后从启动子转录靶序列(參见例如Kacian等人的美国专利第5，399，491和5，554，516号、Burg等人的美国专利第5，437，990号、Gingeras等人的WO88/010315,Malek等人的美国专利第5，130, 238号、Urdea等人的美国专利第4，868，105和5，124，246号和Becker等人的US 2006-0046265A1)。核酸扩增方法可扩增特定的靶序列(例如基因序列)、一组可作为标签或报道序列相关的靶序列或替代(surrogate)序列，，替代被分析序列进行扩增和检測。如果在反应期间的某个点上存在有被分析靶序列，那么替代序列是唯一被扩增的。以上所述的技术经常需要使用两种或更多种引物进行靶扩增。需要对每个靶的引物进行设计和优化。这是既昂贵又耗时的，常常富有挑战性和困难的过程，尤其是在为了扩增两种或更多种不同的靶序列的多重測定中，其中引物对的交叉反应对于測定的可靠性来说可能是ー个严峻的挑战。设计和优化两种引物用于小靶标(例如微小RNA，仅含有18-25个核苷酸)的扩增也是极其困难的(如果不是不可能的话)。本发明描述了使用一种复合引物的扩增方法，从而克服了上述困难。·3.发明概述本发明的第一个方面涉及选择性扩增和任选检测一个或多个靶多核苷酸序列(可与“靶序列”互換使用)的方法。在有些实施方案中，靶序列是在较长的多核苷酸模板内。具体地讲，该方法可用于转录介导的扩增(TMA)系统中ー个或多个靶序列的选择性扩增和任选检測。更具体地讲，该方法使用复合引物来引发引物延伸(超过靶序列的长度)以产生单链DNA产物，并且在靶序列存在于较长的多核苷酸模板内的情况下，该方法可在引物延伸的单链DNA产物中产生确定的3’末端的工具。所述复合引物包含5’启动子部分和与靶序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分。在引物延伸的单链DNA产物中产生确定的3’末端的工具通过确定靶序列的5’末端来工作在一个实施方案中，使用酶(例如限制酶)对紧接靶序列的5’末端上游进行切割或产生切ロ ；在另ー个实施方案中，使用核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板转换寡核苷酸(TSO))对紧接靶序列的5’末端上游进行杂交。单链DNA产物的3’末端部分与同一单链DNA产物中的互补序列通过自折叠杂交，形成柄-茎-环结构，该结构包含(i) 一包含启动子部分的5’单链柄，；(ii) 一包含彼此互补杂交的单链DNA产物的3’末端部分的双链茎，；和任选地，(iii) 一包含介于杂交序列之间的序列的单链环，。柄-茎-环结构的3’末端以5’单链柄为模板被进ー步延伸以形成双链启动子，该双链启动子进而弓I发靶序列的转录。在某些实施方案中，靶序列的5’末端对应于没有与启动子部分或靶-识别部分重叠的复合引物部分。在某些其它的实施方案中，靶序列的5’末端与复合引物部分(例如靶-识别部分)互补并且不与启动子部分重叠。在某些其它的实施方案中，靶序列的5’末端与靶序列部分互补，该靶序列部分不与复合引物的靶-识别部分互补。在靶序列是在较长的多核苷酸模板内的那些实施方案的有ー些中，例如，通过使用与预计紧接靶序列5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交的模板转换寡核苷酸(TSO)，在引物延伸期间引入靶序列的5’末端。典型地，本发明的方法涉及至少ー个靶多核苷酸序列(T)的选择性扩增，所述方法包括以下步骤(a)靶多核苷酸序列与第一复合引物杂交，所述第一复合引物包含5’启动子部分(P)和与靶多核苷酸序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分；(b)确定靶多核苷酸序列的5’末端部分；(c)延伸第一复合引物的3’末端并产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第一单链DNA模板，所述第一单链DNA模板包含彼此互补的第一对自折叠区段(self-folding segment),其中所述启动子部分(P)是在第一单链DNA模板的5’末端，而所述自折叠区段中的一个是在第一单链DNA模板的3’末端；(d)第一单链DNA模板自折叠并形成第一柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第一对自折叠区段的双链茎；(e)延伸第一柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和(f)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列⑴。在有些实施方案中，该对自折叠区段是彼此分隔开的。在有些实施方案中，该对自折叠区段是彼此相邻或靠近的。在有些实施方案中，所述柄-茎-环结构还包含单链环，该单链环包含介于该对自折叠区段之间的序列。在介于该对自折叠区段之间的序列中的碱基数目可以为介于O和1000之间、优选介于O和200之间和更优选介于5和100之间的任何地方(anywhere)。在有些实施方案中，所述单链RNA产物在其3’末端包含启动子部分的互补序列(Pc)。在某些方法中，所述靶多核苷酸序列是RNA，和步骤(C)包括延伸第一复合引物的3’末端以产生第一 RNA/DNA杂交体并去除第一 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板。在某些方法中，所述靶多核苷酸序列是DNA，和所述方法包括在步骤(a)之前的一个变性步骤，和步骤(c)包括延伸复合引物的3’末端以产生第一 DNA/DNA杂交体和使第一DNA/DNA杂交体变性以产生第一单链DNA模板。在某些实施方案中，所述靶多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和步骤(b)包括通过酶切紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域来确定靶多核苷酸序列的5’末端。在某些实施方案中，所述靶多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和步骤(b)包括通过核苷酸序列例如阻遏寡核苷酸或模板转换寡核苷酸(TSO)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端。在ー个具体 的实施方案中，步骤(b)包括通过阻遏寡核苷酸与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步骤(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻断复合引物的延伸。在另ー个具体实施方案中，步骤(b)包括通过TSO与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端，和其中步骤(C)包括延伸复合引物的3’末端至所述TSO部分。优选地，所述阻遏寡核苷酸或TSO是长度为6-100个碱基。用于该方法的阻遏寡核苷酸和TSO可以是本领域众所周知的那些。例如，为了增强杂交亲和カ，所述阻遏寡核苷酸或TSO可包含修饰碱基，例如锁(locked)核酸(LNA)、2’ -O-甲基(2’ -OMe)碱基等。在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些实施方案的有ー些中，第一复合引物还包含，在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤(g)单链RNA产物与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体；(h)去除第二 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板；和 继续步骤(d)、(e)和(f)ο在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些实施方案的有ー些中，第一复合引物的3’靶-识别部分包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤(g)单链RNA产物与第一复合引物杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生第二RNA/DNA杂交体；(h)去除第二 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第ニ对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端；(i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎；(j)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和(k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物。在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些实施方案的有ー些中，第一对自折叠区段包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段及其位于靶多核苷酸序列独立部分的互补序列，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤(g)单链RNA产物与第一复合弓I物杂交并延伸第一复合弓I物的3’末端以产生第二RNA/DNA杂交体；(h)去除第二 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第ニ对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端；(i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎；(j)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和
(k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物。在涉及使用TSO的那些实施方案的有ー些中，第一复合引物还包含，从5’到3’端，并在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，和模板转换寡核苷酸(TSO)包含，从5’到3’端，通用部分(U)和与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域互补的部分，其中所述第一对自折叠区段包含通用部分(U)及其互补序列，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤(g)单链RNA产物与第一复合引物或第二复合引物杂交并延伸第二复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体，其中所述第二复合引物包含5’启动子部分(P)和通用部分⑶；(h)去除第二 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板；和
继续步骤(d)、(e)和(f)。或者，在步骤(g)中可以使用包含5’启动子部分(P)和通用部分(U)的第二复合引物。在一个优选的实施方案中，第二复合引物从5’到3’端由启动子部分(P)和通用部分(U)组成，或者更优选基本上由启动子部分(P)和通用部分(U)组成。上述方法中的任何ー个，或者単独或者以不同组合，可用于选择性扩增多个靶多核苷酸序列，和优选同时选择性扩增多个靶多核苷酸序列。例如，该方法可通过不同第一复合引物选择性扩增各靶多核苷酸序列，其中每个第一复合引物处于5’到3’且在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间还包含在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，和对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤(g)单链RNA产物与第一复合引物或第二复合引物杂交并延伸第二复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体，其中所述第二复合引物包含5’启动子部分(P)和通用部分⑶；(h)去除第二 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板，所述第二单链DNA模板包含彼此互补和分隔开的第二对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端；(i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎和含介于第二对自折叠区段之间的序列的单链环；(j)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和(k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物。或者，在步骤(g)中可以使用包含5’启动子部分(P)和通用部分(U)的第二复合引物。在一个优选的实施方案中，第二复合引物从5’到3’端由启动子部分(P)和通用部分(U)组成，或者更优选基本上由启动子部分(P)和通用部分(U)组成。任选地，以上描述的方法还可以包括检测步骤，该检测步骤包括用于检测单链RNA产物的工具。在ー个方面，检测工具选自杂交保护测定(ΗΡΑ)、分子信标、TaqMan探针、荧光共振能量转移(FRET)探针、诱导型FRET(iFRET)探针、小沟结合物(MGB)探针、分子火矩(torch)和杂交转换(switch)探针。优选地，所述检测工具包含与靶多核苷酸序列部分互补的序列，且所述序列在复合引物或其互补序列中不存在。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列是正义链(或加(+)_链)，而复合引物是负义链(或减(-)_链)，因此单链RNA产物是正义(+)的。在某些其它的实施方案中，靶多核苷酸序列是负义(_)的，而复合引物是正义(+)的，因此单链RNA产物是负义(-)的。本发明的第二个方面涉及用于ー个或多个靶多核苷酸序列(可与“靶序列”互換使用)的选择性扩增和任选检测的试剂盒。在有些实施方案中，所述靶序列不是在较长的多核苷酸序列(例如下文定义的微小RNA、siRNA、rasiRNA、piRNA、tnc RNA和smRNA)内。在这些情况下，对于姆一个祀序列，试剂盒包含至少ー种复合引物，该复合引物包含5’启动子部分和与靶序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分。复合引物是用于引发引物延伸(超过靶序列的长度)以产生单链 DNA产物。在有些实施方案中，所述靶序列是在较长的多核苷酸序列内。在这些情况下，对于每ー个靶序列，试剂盒包含至少ー种复合引物，该复合引物包含5’启动子部分和与靶序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分；和用于确定靶序列5’末端部分的工具；和任选检测工具。所述工具为可引物延伸形成单链DNA产物的确定的3’末端。在某些实施方案中，所述复合引物、任选的确定工具和任选的检测工具被置于试剂盒的同一容器装置中。在某些实施方案中，所述复合引物、任选的确定工具和任选的检测工具被置于试剂盒的独立容器装置中。任选地，本发明的试剂盒还包含说明手册，该手册记载了例如各容器装置内的成分、ー个或多个容器装置的使用顺序等内容。本发明的第三个方面涉及组合物，其包含ー个或多个靶序列、一种或多种复合引物和一种或多种扩增反应产物(包括但不限于扩增的核糖核苷酸靶序列和自折叠单链DNA产物)。所述自折叠单链DNA产物包括柄-茎-环结构和茎-环结构。所述柄-茎-环包含(i)包含启动子部分的5’单链柄(P) ；(ii)双链茎，包含至少ー对彼此杂交的自折叠区段，其中自折叠区段中的一个是靶多核苷酸序列的5’末端部分或其互补序列；和任选地，
(iii)包含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环，。所述茎-环结构与柄-茎-环结构不相同，因为5’单链柄在引物延伸之后已变成了双链。3. I缩写和术语除非另外有解释，否则本文所用的所有科技术语都具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述相类似或等同的方法和材料都可以用于本公开的实施或检验，但是下文还是描述了合适的方法和材料。本文描述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。术语“3’ ” 一般指一条多核苷酸或寡核苷酸中的ー个区域或位置是在同一条多核苷酸或寡核苷酸中的另ー个区域或位置的3’(下游)。术语“5’ ” 一般指一条多核苷酸或寡核苷酸中的ー个区域或位置是在同一条多核苷酸或寡核苷酸中的另ー个区域或位置的5’(上游)。术语“3’末端部分”和“3’末端区域” 一般指位于多核苷酸或寡核苷酸靠近3’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或区域，并且可以包括或者可以不包括与同一多核苷酸或寡核苷酸的3’最末端核苷酸(3’ most nucleotide)相连的3’最末端核苷酸(ー个或多个)或部分。3’末端部分或区域可包含优选约I至约20个、更优选约3至约18个、甚至更优选约5至约15个核苷酸。术语“5’末端部分”和“5’末端区域” 一般指位于多核苷酸或寡核苷酸5’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或区域，并且可以包括或者可以不包括与同一多核苷酸或寡核苷酸的5’最末端核苷酸相连的5’最末端核苷酸(ー个或多个)或部分。5’末端部分或区域可包含优选约I至约20个、更优选约3至约18个、甚至更优选约5至约15个核苷酸。允许某一事件(例如杂交、链延伸等)发生的条件或“适合”某一事件(例如杂交、链延伸等)发生的条件，或“合适的”条件是不阻止这类事件发生的条件。因此，这些条件容许、增强、有利于和/或有助于该事件。本领域已知的和本文描述的这类条件取决于例如核苷酸序列的性质、温度和缓冲液条件。这些条件也取决于什么事件是所需要的，例如是杂交、切割、链延伸还是转录。
术语“扩增”一般指产生多拷贝的所需序列的过程。“多拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”不一定指与模板序列的完美序列互补性或同一性。例如，拷贝可包括核苷酸类似物，例如脱氧肌苷、故意的序列改变(例如通过引物引入的序列改变包含可与模板杂交但不互补的序列)，和/或在扩增期间发生的序列错误。在本文中可互换使用的术语“阻遏寡核苷酸(blocking oligonucleotide) ”、“阻遏序列(blocking sequence) ”、“阻断序列(blocker sequence) ” 或“阻遏物(blocker)”，是一般以高亲和力与模板核酸在位置5’到終止位点结合并且使得通过DNA聚合酶实现的相对于包含靶序列的模板的DNA复制停止的多核苷酸或寡核苷酸。它的3’末端可以或不可以被DNA聚合酶阻断延伸。阻遏寡核苷酸一般是本领域已知的。在优选的实施方案中，在与模板杂交的区域中，阻遏寡核苷酸包含修饰，其中，在一组给定的条件下，与没有修饰的阻遏物相比，阻遏物能更牢固地与该区域結合。合适修饰的实例包括但不限于锁核酸(LNA)、2’-0_甲基(2’-0Me)碱基等，以及在例如Kurn的美国专利第7，294，461号中描述的那些。术语“检測”包括任何检测方式，包括直接和间接检測。例如，“可检测较少的”产物可直接或间接观察到，并且该术语表示任何減少(包括无产物)。同样地，“可检测较多的”产物意指任何増加，无论是直接还是间接观察到的。本文所用的“确定靶多核苷酸序列的5’末端部分”是指定位或产生靶多核苷酸序列的5’末端用于指导引物延伸过程的終止或模板转换(相对于靶多核苷酸序列)。用于确定靶多核苷酸序列的5’末端部分的工具包括但不限于紧接靶序列5’末端上游的模板中的区域进行切割或产生切ロ的酶(例如限制酶)，和与紧接靶序列5’末端上游的模板中的区域杂交的核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板转换寡核苷酸(TSO))。在某些实施方案中，短的靶序列不是在较长的多核苷酸模板内，因此，没有主动步骤參与确定短的靶序列的5’末端部分，因为5’末端部分是短的靶序列的天然5’末端部分，且不需要分离(例如通过酶作用进行切割、裂解或产生切ロ)或产生(例如在引物延伸过程之前通过阻遏寡核苷酸或TSO杂交)。短的RNA靶的实例包括但不限于微小RNA(miRNA: Lee等人，1993，Cell75:843-854 ；Reinhart 等人，2000, Nature 403:901-906)、小干扰 RNA (siRNA:HamiIton等人，1999，Science 286:950-952 ;Hammond 等人，Nature 404:293-296)、重复相关小干扰 RNA (rasiRNA:Reinhart 和 Barrel, 2002，Science 297:183 ；Volpe 等人，2002，Science 297:1833-1837)和 PIWI-相互作用的 RNA(piRNA:Grivna 等人，2006，Genes Dev. 20:1709-1714)，如描述于Chiang等人的 US 2009-0220969A1 ;和极小的非编码(tiny non-coding) RNA (tnc RNA)和小调节RNA (smRNA),如描述于Wang等人的US2009-0325813A1。术语“寡核苷酸” 一般指短的，一般为单链的，一般为合成的多核苷酸，一般而言(但是不一定)是长度小于约200个核苷酸。在本发明中，寡核苷酸包括例如复合引物、阻遏寡核苷酸和TS0。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不是相互排斥的。下面对多核苷酸的描述等于和完全适用于寡核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的在本文中可互换使用的“部分”或“区域”，是2个或更多个碱基的连续(contiguous)序列。在其它的实施方案中，部分或区域是3、5、10、15、20、25个连续核苷酸中的至少大约任何ー个。术语“启动子序列”一般指以双链形式能够介导RNA转录的单链DNA序列区域。在某些情形下，“启动子序列”和“启动子”可互換使用。启动子序列的实例包括但不限于可被T7、T3、SP6、Ml3 RNA聚合酶等识别的序列。·反转录酶，也称为依赖RNA的DNA聚合酶，是ー种将单链RNA转录成双链DNA的DNA聚合酶。反转录酶的实例包括但不限于MMLV反转录酶、AMV反转录酶等。在本文中可互換使用的“靶多核苷酸序列”或“靶序列”，是需要扩增的目标多核苷酸序列。靶序列可以是已知的或未知的，当提到其实际序列吋。一般而言，在本文中可互換使用的“多核苷酸模板”或“模板”，是含有靶序列的多核苷酸。在有些情况下，术语“靶序列”、“模板”、“多核苷酸模板”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其各种变体在本文中都可互換使用。术语“模板转换寡核苷酸(templateswitch oligonucleotide, TSO) ”一般指包含与模板在引物延伸的位置5’到終止位点进行杂交的部分(或区域)并能够在引物的延伸过程中通过DNA聚合酶实现模板转换的多核苷酸或寡核苷酸。一般而言，TSO是本领域已知的。“模板转换”是指模板核酸中的变化，在单轮引物延伸的过程当中，一般从靶核酸变成TSO的未杂交部分。TSO的实例包括但不限于Kurn等人的WO 00/070095中描述的那些。在本文中可互換使用的术语“終止多核苷酸序列”和“終止序列”，是指使得通过DNA聚合酶实现的相对于包含靶序列的模板的DNA复制停止的多核苷酸序列。終止序列包含一般与模板在位置5’到終止点(位点)进行杂交的部分(或区域)。本文提供了合适终止多核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸和TS0)的多个实例。在本文中可互換使用的术语“終止位点”和“終止点”，是指在聚合(一般是引物延伸)或模板转换的终止之前通过DNA聚合酶最后复制的模板的位点、点或区域。例如，对于TS0,它是在模板从模板多核苷酸转换成TSO的未杂交部分之前,与引物延伸产物3，末端互补的靶序列中的位置或区域。本文所用的术语“变化”意指在某个方面变得不相同，例如被改变，例如増加或减少。可检测变化是可以被检测出来的变化，例如信号(例如荧光)的強度、频率或存在中的变化。在具体的实例中，可检测变化是荧光強度的降低。本文所用的术语“互补”意指ー个核酸分子的碱基与另ー个核酸分子的碱基形成氢键时发生的结合。在正常情况下，碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互补，而胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)互补。例如，一条单链(SS)DNA分子的序列5’ ATCG 3’可与另ー条ssDNA的3’ TAGC 5’键合形成双链(ds)DNA。在这个例子中，序列5’ ATCG 3’是3’ TAGC5’的反向互补序列。核酸分子可以彼此互补，甚至在没有各分子的所有碱基完全形成氢键的情况下。例如，与互补核酸序列杂交可以发生在不同严格性的条件下，在此条件下，互补序列将在有些而不是所有的核苷酸位置結合。本文所用的术语“荧光团(fluOTophore) ”意指因暴露于光的特定波长而激发时发出光(发突光)的化合物，例如在光的不同波长时。不例性的突光团包括但不限于6_羧基荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM) ;ニ吡咯甲烷ニ氟化硼(BODIPY) ；N, N，N’，N’ -四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA);卩丫唆、芪(stilbene)、-6-羧基-荧光素(HEX)、TET (四甲基荧光素)、6_羧基-X-罗丹明(ROX)、得克萨斯红(Texas Red)、2’，7’ -ニ甲氧基-4’，5’ -ニ氯_6_羧基荧光素(JOE)、Cy3、Cy5、VIC. RTM. (Applied Biosystems)、LC Red 640,LC Red 705,Yakimayellow及其衍生物。术语“荧光团”也包括有发光分子，发光分子是不需要暴露于光的特定波长才发出荧光的化合物；发光分子天然发出荧光。因此，发光信号的使用可以消除对电磁 辐射的外部来源(例如激光)的需求。本文所用的短语“[核酸分子的]杂交”意指当两个互补核酸分子彼此经历适量的氢键键合时发生的结合。杂交的严格性可以根据围绕核酸分子的环境条件、杂交方法的性质及所用核酸分子的组成和长度而变化。有关需要达到严格性特定程度的杂交条件的计算在以下文献中有论述Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual (Cold Spring Haroor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. , 2001)；和 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2(Elsevier, N. Y.，1993) 0Tm是核酸给定链的50%与其互补链杂交的温度。本文所用的术语“严格条件”包括仅在杂交核酸分子和靶序列间小于25%错配的情形下才发生杂交的条件。“中等严格”的条件是在具有大于25%序列错配的核酸分子将不杂交下的条件。“中间(medium)严格性”的条件是在具有大于15%错配的核酸分子将不杂交下的条件；“高严格性”的条件是在具有大于10%错配的核酸分子将不杂交下的条件；和“非常高严格性”的条件是在具有大于5%错配的核酸分子将不杂交下的条件。中等严格杂交条件包括在例如约42° C，在含有25mM KPO4(pH7. 4)、5XSSC、5XDenhart氏溶液、50 μ g/mL变性的超声处理的鲑鱼精DNA、50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和l-15ng/mL探针(约5X107Cpm/l·! g)的杂交液中进行杂交的条件，尽管洗涤是在约50° C用含有2XSSC和O. 1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。高严格杂交条件包括在例如约42° C，在含有25mM KP04(pH7. 4)、5XSSC、5XDenhart氏溶液、50 μ g/mL变性的超声处理的鲑鱼精DNA、50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和l-15ng/mL探针(约SXlOYpm/yg)的杂交液中进行杂交的条件，尽管洗涤是在约65° C用含有O. 2XSSC和O. 1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。本文描述的互补核酸序列可以在严格、中等严格和/或高严格条件下进行杂交。本文所用的术语“分离的[生物成分]”意指已基本上从其它生物成分中分离、产生或纯化的生物成分(例如核酸分子)。已经“分离”的核酸分子包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子，以及化学合成的那些。“分离的”不需要绝对的纯度，并且可包括至少50%分离的，例如至少75%、80%、90%、95%、98%、99%或甚至100%分离的核酸分子。本文所用的术语“标记物”意指能够检测、例如通过分光光度測定法、流式细胞术或显微镜术检测的物质(agent)。例如，标记物可以与核苷酸相连，从而容许核苷酸的检测，例如核苷酸是其中一部分的核酸分子的检测。标记物的实例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。适用于不同目的的用于标记的方法和标记物选择的指导在例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)和 Ausubel 等人(In Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)中有论述。本文所用的术语“核酸分子”或“多核苷酸序列”意指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合体，其可包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸分子杂交的天然核苷酸的类似物。在ー个具体实例中，核酸分子或多核苷酸序列是单链(Ss) DNA或RNA分子，例如引物。在另ー个具体实例中，核酸分子或多核苷酸序列是双链(ds) DNA,例如靶多核苷酸序列。DNA 的主要核苷酸是脱氧腺苷5’ -三磷酸(dATP或A)、脱氧鸟苷5’ -三磷酸(dGTP或G)、脱氧胞苷5’ -三磷酸(dCTP或C)和脱氧胸苷5’ -三磷酸(dTTP或T)。RNA的主要核苷酸是腺苷5’ -三磷酸(ATP或A)、鸟苷5’ -三磷酸(GTP或G)、胞苷5’ -三磷酸(CTP或C)和尿苷5’-三磷酸(UTP或U)。核苷酸包括含有修饰碱基、修饰糖部分和修饰磷酸主链的那些核苷酸，例如描述于Nazarenko等人的美国专利第5，866, 336号中的那些。可用于在任何位置在其结构上修饰核苷酸的修饰碱基部分实例包括但不限于5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、こ酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、ニ氢尿嘧啶、β -D-半乳糖基Q核苷、肌苷、Ν-6-异戊烯基腺嘌呤、I-甲基鸟嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-ニ甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β -D-甘露糖基Q核苷、5’ -甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-Ν6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基こ酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2_硫代胞嘧啶、5-甲基_2_硫代尿嘧啶、2_硫代尿嘧啶、4_硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基こ酸甲酷、尿嘧啶-S-氧基こ酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6- ニ氨基嘌呤。本文所用的术语“引物”意指短的单链多核苷酸，一般具有游离3’-OH基团，当与其互补IE核酸杂交时，允许通过聚合酶例如反转录酶进行链延伸。属于(bracketing)扩增子的引物对可用于例如通过TMA、PCR或其它核酸扩增方法扩增核酸序列。在优选的实施方案中，使用一种复合引物，所述复合引物包含(i)5’启动子部分，和(ii)3’靶-识别部分，其与靶多核苷酸序列3’末端部分互补，并且长度不超过30、40、50、60、70或80个，优选不超过60个碱基。本文所用的短语“定量[核酸分子]”意指測定或測量存在的核酸分子的数量(例如相对数量)，例如样品中存在的核酸分子数目。在具体的实例中，它是测定样品中存在的核酸分子的相对量或实际数目。本文所用的术语“荧光的猝灭”意指荧光的減少。例如，当猝灭剂分子(例如鸟苷)以足够接近荧光团存在时，就发生序列上荧光团的荧光被猝灭，在互补链合成期间，它減少报道分子的荧光信号。本文所用的术语“实时TMA”意指用于检测和測量在TMA过程中产生的产物的方法，该产物是与TMA开始前靶核酸量成比例。所获得的信息(例如扩增曲线)可用于定量测定靶核酸的起始数量。本文所用的术语“重组[核酸分子]”是具有不是天然存在的序列或通过两种别的不同序列区段的人工组合产生的序列的核酸分子。这种人工组合可以例如通过化学合成或通过核酸分子的分离区段的人工操作，例如通过遗传工程技术来完成。本文所用的术语“样品”意指生物样品，例如含有核酸分子(例如基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA或其组合)的样品。样品可以得自受治疗者的细胞，例如外周血、尿液、唾液、组织活检样品、手术样本、细针穿刺抽吸物、羊膜腔穿刺术样品和尸检材料中存在的细胞。本文所用的术语“靶-识别部分”意指例如在严格、中等严格或高严格条件下可与 靶核酸基本上杂交的核苷酸序列。在具体的实例中，这样的靶-识别部分是长至少5、10、
15、20、30、40或更多个核苷酸。优选，靶-识别部分是长约15-35个核苷酸。本文所用的术语“信号”意指指示物，例如可从所得信息获知的可检测物理数量。在一个实例中，标记物发出能够检测的信号，例如荧光信号。本文所用的术语“[核酸分子]的合成”意指从其组分零件构建核酸分子，例如通过复制核酸分子或多核苷酸序列。实例包括但不限于使用反转录酶进行DNA合成和依赖RNA的DNA合成。本文所用的术语“靶[核酸分子]”意指其检测、定量、定性检测或其组合是预计的核酸分子。该核酸分子不需要呈纯化形式。各种其它核酸分子也可以与靶核酸分子一起存在。例如，靶核酸分子可以是细胞中的特定核酸分子(其可包括宿主RNA (例如mRNA)和DNA (例如基因组DNA或cDNA)以及其它核酸分子例如病毒、细菌或真菌的核酸分子)，其扩增是可预计的。靶核酸分子的纯化或分离，如果需要，可以通过本领域技术人员已知的方法进行，例如通过使用市售的纯化试剂盒等来进行。 本文所用的术语“上游”和“下游”是DNA或RNA中的相对位置。DNA或RNA的每一条链都具有5’末端和3’末端，所以根据脱氧核糖环上的碳予以命名。相对于链上的位置，下游是朝向链的3’ -末端的区域，而上游是朝向链的5’末端的区域。由于DNA链按相反的方向排列，因此一条链的下游就是另一条链的上游。4.附图简述图I.使用本发明的复合引物、阻遏寡核苷酸和检测工具(detection means)的单个短的RNA靶多核苷酸序列扩增和检测。图2.使用本发明的复合引物、阻遏寡核苷酸和检测工具的单个RNA靶多核苷酸序列扩增和检测。图3.使用本发明的复合引物和阻遏寡核苷酸的单个RNA靶多核苷酸序列扩增。图4.使用本发明的复合引物和阻遏寡核苷酸的单个RNA靶多核苷酸序列扩增。图5.使用本发明的复合引物、阻遏序列、包含通用序列的启动子引物和检测工具的单个RNA靶多核苷酸序列扩增和检测。图6.使用本发明的复合引物和模板转换寡核苷酸(TSO)的单个RNA靶多核苷酸序列扩增。图7.使用本发明的复合引物、阻遏序列和检测工具的单个DNA靶多核苷酸序列扩增和检測。图8.使用本发明方法进行多个RNA靶多核苷酸序列扩增和检测的复合引物、阻遏序列、RNA/DNA杂交体和检测工具的通用序列格式(formula)。图9.无靶(阴性对照)或Ipg的HCV RNA用本发明的复合引物扩增的扩增原始曲线。

图10. HCV RNA用具有不同长度折叠序列的复合引物扩增的扩增原始曲线。图11.无靶(阴性对照)或IOpgUpg或O. Ipg的HCV RNA用本发明的复合引物 扩增的扩增原始曲线。5.发明详述下面第5. I小节详细描述了本发明的复合引物和方法。下面第5. 2小节详细描述了包含本发明的复合引物和扩增产物的组合物和试剂盒。5. I本发明的复合引物和方法转录-介导的扩增(TMA)是使用两种酶(即RNA聚合酶和反转录酶)和两种引物来驱动反应的RNA转录扩增系统。其中一种引物含有RNA聚合酶的启动子序列。在第一个步骤中，启动子-引物与靶RNA在确定的位点杂交。反转录酶(RT)通过从启动子-引物的3’末端延伸产生具有与靶RNA互补的序列的单链DNA模板。所得RNA/DNA杂交体中的RNA被反转录酶的RNA酶H活性降解。然后，第二引物与单链DNA模板结合。通过反转录酶从第二引物的末端合成了一条新的DNA链，从而产生双链DNA分子。RNA聚合酶识别双链DNA分子中的启动子序列并起始转录。新合成的RNA扩增子中的每ー个都重新进入TMA过程并充当新ー轮复制的模板，导致RNA扩增子的指数扩充。由于每ー个双链DNA分子都可以产生100-1000拷贝的RNA扩增子，因此该扩充可导致在I小时以内产生100亿个扩增子。TMA是等温的；整个反应都在水浴或加热块中在相同的温度下进行。这与需要热循环仪器快速改变温度以驱动反应的聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)等其它扩增反应相汉。如上所论述的，常规的TMA需要使用引物对，其中第一启动子-引物包含与靶核酸区杂交的靶-识别部分，而第二非启动子引物包含不与启动子-引物所杂交的靶核酸区重叠并在其上游的靶核酸区。因此，TMA通常在引物设计和优化时需要使用至少两种靶特异性序列。当扩增和检测包括超过ー个靶核酸时，对于每个靶，需要对每种引物和探针进行设计和优化。这些是既昂贵又耗时的，常常富有挑战性和困难的过程。当具体靶的有用序列有限时，设计两种序列特异性引物是很困难的。相反，本发明只需要使用ー种引物，由于种种理由，这是有优势的。首先，ー种序列特异性引物的需求有利于引物的设计，尤其是在具体靶的有用序列有限的情况下。此外，当扩增过程仅使用ー种引物时，计划外的扩增产物几乎很少形成。另外，由于每个靶仅需要一种引物，反应系统的优化要容易得多，尤其是在多重扩增和检测吋。有时，在靶序列的某些区域内存在ニ级结构，使得这样的区域在引物设计中是不需要使用的。例如，在TMA系统中，将需要辅助寡核苷酸来打开这些ニ级结构以便提高扩增效率。然而，这些区域可包括在本发明的复合引物中，因为ニ级结构可用于促进自折叠柄-茎-环产物的形成。本 发明在扩增过程中使用ー种引物，即复合引物。该复合引物包含(i)5’启动子部分(P)和(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分互补的3’靶-识别部分，靶多核苷酸序列(T)有时是在较长的多核苷酸模板内。在第一个步骤中，该复合引物与靶多核苷酸序列杂交。在同时或紧接其后，对靶多核苷酸序列的5’末端进行确定。如果靶多核苷酸序列是如上所述的短靶序列，那么靶多核苷酸序列的5’末端就是天然的5’末端。如果靶多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，那么或者使用酶在多核苷酸模板区切割、产生切ロ或裂解，或者通过使核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板转换寡核苷酸(TSO))与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端。然后，反转录酶(RT)通过从复合引物的3’末端延伸产生具有其序列与靶多核苷酸序列互补的单链DNA模板。所得RNA/DNA杂交体中的RNA被反转录酶的RNA酶H活性降解。剩余的单链DNA模板包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)。具体地说，单链DNA包含彼此互补和有时彼此分隔开的ー对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的ー个是在单链DNA模板的3’末端。单链DNA模板自折叠并形成柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。然后，反转录酶延伸柄-茎-环结构的3’末端，产生具有启动子序列的双链柄。RNA聚合酶识别该启动子序列并起始转录，产生多拷贝的单链RNA产物，包含靶多核苷酸序列(T)和有时在3’末端也包含启动子部分的互补序列(Pc)。新合成的单链RNA产物(也称为“RNA扩增子”)中的每ー个重新进入TMA过程并充当新ー轮复制的模板。具体地说，同一种复合引物(或有时是其较短的形式，优选包括在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用序列)与单链RNA产物杂交。然后，反转录酶通过从复合引物的3’末端延伸来产生单链RNA产物的单链DNA模板。所得RNA/DNA杂交体中的RNA被反转录酶的RNA酶H活性降解。剰余的单链DNA模板包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)，并同样包含彼此互补和分隔开的该对自折叠区段。一旦单链DNA模板自折叠并形成柄-茎-环结构，反转录酶就延伸柄-茎-环结构的3’末端，产生具有被RNA聚合酶识别以起始转录的启动子序列的双链柄，从而产生多拷贝的单链RNA。如图1-7所示，在TMA系统中，一种复合引物就足以满足靶多核苷酸序列(图1_6中的RNA和图7中的DNA)的扩增。在某些实施方案中，所述方法用于不在较长的多核苷酸模板内的短的祀多核苷酸序列的扩增(见图I)。图I中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互补的3’靶-识别部分(Be)，和(iii)在启动子部分(P)和3’靶-识别部分(Be)之间，对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段，其中该区段及其互补序列(Ac)形成ー对自折叠区段，在第一个步骤(I)中，靶多核苷酸序列⑴与复合引物㈠杂交，且靶多核苷酸序列的5’末端㈧是靶多核苷酸序列的天然5’末端。然后，复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的单链DNA模板(_)，所述单链DNA模板也包含该对自折叠区段(即A和Ac)，其中所述启动子部分(P)是在单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的ー个(即Ac)是在单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，单链DNA模板自折叠并形成柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段(即A和Ac)的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，转录从双链启动子开始以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤￠)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第七个步骤(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤⑶中，从第二 RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生单链DNA模板。继续进行步骤(3)、(4)和(5)以便指数产生多拷贝的单链RNA产物。单链RNA产物可以使用例如包含与靶多核苷酸序列部分互补的序列的分子信标进行检测，其中所述序列在复合引物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或它们的相应互补序列中不存在。在某些实施方案中，所述方法包括使用阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)来确定靶多核 苷酸序列的5’末端。图2-4说明使用本发明的复合引物和阻遏寡核苷酸进行的单个RNA靶多核苷酸序列的扩增和检测。图2中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，(ii)与靶多核苷酸序列⑴的3’末端部分⑶互补的3’靶-识别部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在较长的多核苷酸模板内，和(iii)在启动子部分(P)和3’靶-识别部分(Be)之间，对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段，其中该区段及其互补序列(Ac)形成ー对自折叠区段。在第一个步骤(I)中，靶多核苷酸序列(+)与复合引物(-)杂交，且通过阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端(A)上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的单链DNA模板(_)，所述单链DNA模板也包含该对自折叠区段(即A和Ac)，其中所述启动子部分(P)是在单链DNA模板的5’末端，而所述自折叠区段中的ー个(即Ac)是在单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，单链DNA模板自折叠并形成柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段(即A和Ac)的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤(6)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第七个步骤(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤⑶中，从第二 RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生单链DNA模板。继续进行步骤(3)、(4)和(5)以便指数产生多拷贝的单链RNA产物。单链RNA产物可以使用例如包含与靶多核苷酸序列部分互补的序列的分子信标进行检测，其中所述序列在复合弓I物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或它们的相应互补序列中不存在。图3中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，和(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互补的3’靶-识别部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在较长的多核苷酸模板内，其中3’靶-识别部分(Be)包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段，并且合在一起，所述区段及其互补序列形成第一对自折叠区段。在第一个步骤(I)中，靶多核苷酸序列(+)与复合引物(_)杂交，且通过阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第一单链DNA模板(-)，所述第一单链DNA模板也包含第一对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第一单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的一个是在第一单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，第一单链DNA模板自折叠并形成第一柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第一对自折叠区段的双链茎、和含介于第一对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，第一柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤￠)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第七个步骤
(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤⑶中，从第二·RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(-)，所述第二单链DNA模板也包含彼此互补和分隔开的第二对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端。在第九个步骤(9)中，第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎、和含介于第二对自折叠区段之间的序列的单链环。在第十个步骤(10)中，第二柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物。图4中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，和(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互补的3’靶-识别部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在较长的多核苷酸模板内。靶多核苷酸序列包含第一对自折叠区段，其包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段及其位于靶多核苷酸序列独立部分的互补序列(Ac)。在第一个步骤⑴中，靶多核苷酸序列⑴与复合引物㈠杂交，且通过阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端。然后，复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第一单链DNA模板(_)，所述第一单链DNA模板也包含第一对自折叠区段(即A和Ac)，其中所述启动子部分(P)是在第一单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的一个是在第一单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，第一单链DNA模板自折叠并形成第一柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)和3’靶-识别部分(Be)的5’单链柄、含彼此杂交的第一对自折叠区段(即A和Ac)的双链茎、和含介于第一对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，第一柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其从5’到3’端包含复合引物的3’末端靶-识别部分(Be)、靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤￠)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第七个步骤(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤(8)中，从第二 RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(-)，所述第二单链DNA模板也包含彼此互补和分隔开的第二对自折叠区段(即B和Be)，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端。在第九个步骤(9)中，第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎、和含介于第二对自折叠区段之间的序列的单链环。在第十个步骤(10)中，第二柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物。图5中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互补的3’靶-识别部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在较长的多核苷酸模板内，和从5’到3’端，并在启动子部分(P)和3’靶-识别部分(Be)之间，(iii)在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，和(iv)对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段，其中该区段及其互补序列(Ac)形成第一对自折叠区段。在第一个步骤(I)中，靶多核苷酸序列(+)与复合引物(_)杂交，且通过阻遏序列(“阻遏物”)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端(A)上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后,复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生包含启动子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第一单链DNA模板(-)，所述第一单链DNA模板也包含第一对自折叠区段(即A和Ac)，其中所述启动子部分(P)是在单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的ー个(即Ac)是在单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，第一单链DNA模板自折叠并形成第一柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)和通用部分(U)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段(即A和Ac)的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤出)中，单链RNA产物与复合引物杂交。或者，单链RNA产物与由启动子部分(P)和通用部分(U)组成、优选基本上由启动子部分(P)和通用部分(U)组成的较短复合引物 杂交。在第七个步骤(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤(8)中，从第二 RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生第二单链DNA模板。在第九个步骤(9)中，第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第二对自折叠区段(即U和Uc)的双链茎、和含介于第二对自折叠区段之间的序列的单链环。在第十个步骤(10)中，第二柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物。单链RNA产物可以使用例如包含与靶多核苷酸序列部分互补的序列的分子信标进行检测，其中所述序列在复合引物、靶多核苷酸序列的5’末端部分、通用部分或其相应的互补序列中不存在。在某些实施方案中,所述方法包括在祀多核苷酸序列的5’末端使用模板转换寡核苷酸(TSO)引入确定的序列(參见例如图6)。在序列的一端引入确定的序列的方法是本领域技术人员众所周知的(參见例如Laney等人的美国专利第5，679，512号；和Kurn的美国专利第6，251，639号)。图6中举例说明的方法使用复合引物，其包含(i)5’启动子部分(P)，(ii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互补的3’靶-识别部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在较长的多核苷酸模板内，和(iii)在启动子部分(P)和3’靶-识别部分(Be)之间，在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，其中通用部分(U)及其互补序列(Uc)形成ー对自折叠区段。在第一个步骤(I)中，靶多核苷酸序列(+)与复合引物(_)杂交，且通过包含通用部分(U)的模板转换寡核苷酸(TSO)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端 (A)上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，复合引物的3’末端延伸以产生第一 RNA/DNA杂交体。在第二个步骤(2)中，RNA部分被去除以产生单链DNA模板(_)，其从5’到3’端包含启动子部分(P)、靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)和通用部分(U)的互补序列，所述单链DNA模板也包含该对自折叠区段(即U和Uc)，其中所述启动子部分(P)是在单链DNA模板的5’末端，而自折叠区段中的ー个(即Uc)是在单链DNA模板的3’末端。在第三个步骤(3)中，单链DNA模板自折叠并形成柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段(即U和Uc)的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。在第四个步骤(4)中，柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第五个步骤(5)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第六步骤(6)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第七个步骤(7)中，复合引物的3’末端延伸以产生第二 RNA/DNA杂交体。在第八个步骤(8)中，从第二 RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生单链DNA模板。继续进行步骤(3)、(4)、(5)和(6)以便指数产生多拷贝的单链RNA产物。如图7所示，本发明的方法也可用于ー种或多种DNA靶多核苷酸序列的扩增。在第一个步骤⑴中，使双链DNA双链体变性以产生包含靶多核苷酸序列⑴的单链DNA多核苷酸模板。在第二个步骤⑵中，复合引物㈠从5’到3’端包含⑴5’启动子部分(P)，
(ii)对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段，和(iii)与靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分互补且与靶多核苷酸序列杂交的3’靶-识别部分，且通过阻遏寡核苷酸与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交来确定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，靶多核苷酸序列的3’末端延伸以产生DNA/DNA杂交体。在第三个步骤(3)中，使DNA/DNA杂交体变性以产生单链DNA模板(-)，其从5’到3’端包含启动子部分(P)、对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的区段和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)。在第四个步骤(4)中，单链DNA模板自折叠并形成茎-柄-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的该对自折叠区段(即A和Ac)的双链茎、和含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。在第五个步骤(5)中，柄-茎-环结构的3’末端延伸以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子。在第六步骤出)中，从双链启动子开始转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和启动子部分的互补序列(Pc)，其中启动子部分的互补序列(Pc)是在单链RNA产物的3’末端。在第七个步骤(7)中，单链RNA产物与复合引物杂交。在第八个步骤(8)中，复合引物的3’末端延伸以产生RNA/DNA杂交体。在第九个步骤(9)中，从RNA/DNA杂交体中去除RNA部分以产生单链DNA模板。继续进行步骤(4)、(5)和(6)以便指数产生多拷贝的单链RNA产物。单链RNA产物可以使用例如包含与靶多核苷酸序列部分互补的序列的分子信标进行检测，其中所述序列在复合弓I物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或其相应的互补序列中不存在。包含通用部分(U)的复合引物或模板转换寡核苷酸的使用为多重核酸检测，例如在多种性传播疾病检测和血库的病毒筛查中，提供了ー种非常简单的系统。例如，ー种含有通用部分的引物可以用于HIV、HCV和HBV的血库多重扩增。
任选地，本发明的方法还包括检测单链RNA产物产生的检测步骤。在ー个方面，该检测步骤包括使检测工具例如包含位于靶多核苷酸序列的3’和5’末端之间的靶-识别部分的分子信标杂交。尽管图1-7通过使用负义(_)复合引物说明正义(+)靶多核苷酸序列的扩增，但是同样的步骤可以接着通过使用正义(+)复合引物来扩增负义(_)靶多核苷酸序列。本发明的方法也可用于超过一个靶多核苷酸序列的选择性扩增和检测。图8提供使用本发明的方法，针对多个RNA靶多核苷酸序列的复合引物、阻遏序列、RNA/DNA杂交体和检测工具的通用序列格式。5. 2试剂盒和扩增反应混合物本发明也涉及用于ー个或多个靶多核苷酸序列的选择性扩增和任选检测的试剂盒，以及包含一个或多个靶多核苷酸序列、一种或多种复合引物和一种或多种扩增反应产物的组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒包含对于每一个靶多核苷酸序列，至少ー种复合引物，其包含α)5’启动子部分和(ii)与靶多核苷酸序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分；和任选用于确定靶多核苷酸序列的5’末端的工具；和任选检测工具。在某些实施方案中，复合引物、任选的鉴定工具和任选的检测工具置于试剂盒的同一个容器装置中。在某些实施方案中，复合引物、任选的鉴定工具和任选的检测工具置于试剂盒的独立容器装置中。任选地，本发明的试剂盒还包含说明手册，该说明手册记载例如各容器装置中的组分、ー个或多个容器装置的使用顺序，等等。在某些实施方案中，所述组合物包含上述复合引物和扩增反应产物例如柄-茎-环结构或茎-环结构。柄-茎-环结构包含α)5’单链柄，包含启动子部分(P)；( )双链茎，包含至少ー对彼此杂交的自折叠区段，其中自折叠区段中的一个是靶多核苷酸序列的5’末端部分或其互补序列；和(iii)单链环，包含介于该对自折叠区段之间的序列。茎-环结构与柄-茎-环结构不同，因为5’单链柄在引物延伸之后已变成了双链。6.实施例下面提供实施例来举例说明本发明的某些方面和实施方案。相信下面的实施例能准确反映出实际进行过的实验的细节，然而，在实际进行过的工作和以下公开的不影响这些实验的结论或技术人员实践它们的能力的实验细节之间可能存在有ー些微小的差异是有可能的。技术人员将会理解这些实施例并不是用来把本发明限制到本文描述的具体实施方案。另外，本领域技术人员使用本文描述的技术、材料和方法能够容易地想出和优化用于实现这些方法和相关方法且同时仍在本发明的精神和范围之内的替代扩增系统。6. I实施例I :用本发明方法的靶-特异性扩增进行了下面的实验以用本发明的复合引物评价等温扩增。使用本发明的方法扩增了 HCV RNA。6. I. I材料与方法I.寡核苷酸I.复合引物复合引物具有以下序列并按10pmol/rxn使用5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGGCA ATTCC GGTGT ACTCA3’ (SEQ ID NO:I)。第1-27位的核苷酸构成了 T7启动子序列；下划线部分是折叠序列；和3’序列的其余部分与HCV RNA部分互补。2.检测探针检测探针(分子信标)具有以下序列并按5pmol/rXn使用5’ Fam-CGUUC CGCAG ACCAC UAUGA ACG-Dabcyl 3’ (SEQ ID NO:2)。第5-19位的核苷酸与HCV RNA部分互补并且可以与扩增的产物杂交。3.阻遏序列阻遏序列具有以下序列并按2. 5pmol/rxn使用5，AUGGC UAGAC GCUUU CUGCG UGAAG 3，(SEQ ID NO:3)II.试剂I.扩增缓冲液“扩增缓冲液”包含 26mM Trizma 碱(pH 8. O)、25mM MgCl2,23. 3mM KCl2,3. 33%(v/v)甘油、0. 05mM こ酸锌、0. 76mM dATP、0. 76mM dCTP、0. 76mM dGTP、0. 76mM dTTP、6. OmMATP,6. 0mMCTP、6. OmM GTP 和 6. OmM UTP，pH 7. 81-8. 0，在 22。C。2.酶混合物“酶混合物”包含 70mM N-こ酰基-L-半胱氨酸、10% (v/v) TRITON X_102、16mMHEPESUmM EDTA、20mM Trizma 碱缓冲液、50mM KC12、20%(v/v)甘油、165. 6mM 海藻糖(pH 7和含有 224RTU/μ L 莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus, “MMLV”)反转录酶和140U/ μ L T7 RNA聚合酶)。III.机器使用Mx3005P 实时 PCR 系统(Strategene，La Jolla, Ca)作为检测机器。IV.详细方案、
采用以下步骤完成实验步骤(I):将75“1含有10 11101复合引物、2.5 11101阻遏寡核苷酸、5 11101检测探针和3 μ I含HCV RNA缓冲液的扩增缓冲液加入到96孔微量滴定板的各孔中。加入3 μ I无HCV RNA靶的缓冲液作为阴性对照。该板用一透明密封卡(card)覆盖。步骤⑵该96孔微量滴定板于60° C孵育0_5分钟。步骤(3):该96孔微量滴定板于42° C孵育2_5分钟。步骤⑷将25 μ I的酶混合物加入到各孔中。步骤(5):立即将板置于Μχ3005Ρ 实时PCR系统中(在42° C等温孵育)并每隔I分钟测量各孔的荧光。Ct值由监测的荧光信号来确定，Ct值用作合成的扩增子量的指标。
6. I. 2 结果正如可在图9中看见的，当将O. Ipg的HCV RNA转录物加入到反应物时，Dt值为约26分钟(參见短划线加上实心圆圈一·一)，而在阴性对照(没有加入HCV RNA)中没有观察到高于背景的可检测信号(參见短划线加上实心方块_ ■ _)。Dt为荧光信号跨过阈值所需要的时间(即超过背景水平)。6. 2实施例2 :本发明的方法中不同长度的折叠序列的影响以下实验研究了本发明的方法中不同长度的折叠序列在复合引物中的影响。6. 2. I材料与方法复合引物具有以下序列中的ー个5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGGCA ATTCC GGTGT ACTCA3，(SEQ ID NO: 1，具有9个碱基的折叠序列)，5’AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCCG GCAAT TCCGG TGTAC TCA3’ (SEQ ID NO: 4,具有12个碱基的折叠序列)，或5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGT TAGGC AATTC CGGTGTACTC A3，(SEQ ID NO: 5,具有15个碱基的折叠序列)。第1-27位的核苷酸构成了 T7启动子序列；下划线部分是折叠序列；和3’序列的其余部分与HCV RNA部分互补。除了毎次反应使用IOpg的HCV靶外，检测探针、阻遏序列、试剂、机器和实验方案基本上与实施例I中描述的相同。6. 2. 2 结果如图10所示，三种不同复合引物的Dt值是相似的(约12分钟)。曲线A是包含SEQ ID NO: I的氨基酸序列的复合引物的Dt值。曲线B是包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的复合引物的Dt值。曲线C是包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列的复合引物的Dt值。在另ー个实验(数据未显示)中，使用了以下具有长折叠序列的复合引物(參见下文)，但没有观察到高于背景的可检测信号5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGT TAGTA TGAGG GCAATTCCGG TGTAC TCA 3’ (SEQ ID NO :6,具有22个碱基的折叠序列，见下划线部分)。这些结果表明折叠序列的长度可以影响扩增效力。6. 3实施例3 :使用本发明的方法对靶核酸的定量检测以下实验证明了利用HCV RNA转录物作为例子，本发明的方法可以用来进行靶核酸的定量检测。6. 3. I材料与方法复合引物具有以下序列5’AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGG GCAAT TCCGG TGTAC TCA3’ (SEQ ID NO: 4,具有12个碱基的折叠序列，见下划线部分)。除了本实施例中毎次反应使用IOpg的HCV靶外，检测探针、阻遏序列、试剂、机器和实验方案基本上与实施例I中描述的相同。6. 3. 2 结果如图11中所示，当将10pg、lpg或O. Ipg的HCV RNA转录物加入到反应物时，Dt值 分别为约14分钟(參见短划线加上实心圆圈一·一)、20分钟(參见短划线加上实心方块一·一)或28分钟(參见短划线加上实心三角一▲一)，而在阴性对照(没有加入HCV RNA)中没有观察到高于背景的可检测信号。这些结果表明本发明的方法可以用于靶核酸的定量检测。7.具体方面/实施方案、引用的参考文献本发明并不限于由本文描述的具体方面和实施方案限定的范围。事实上，根据以上说明书和附图，除了本文所述内容以外，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修改都落入所附权利要求书的范围之内。本文中引用了各种參考文献，包括专利申请、专利和科学出版物；各类參考文献的公开内容都通过引用其全部结合到本文中。
权利要求
1.一种用于选择性扩增靶多核苷酸序列(T)的方法，包括以下步骤 (a)靶多核苷酸序列(+)与第一复合引物(_)杂交，所述第一复合引物包含5’启动子部分(P)和与靶多核苷酸序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分； (b)确定靶多核苷酸序列的5’末端部分； (c)延伸第一复合引物的3’末端并产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第一单链DNA模板( _)，所述第一单链DNA模板包含彼此互补的第一对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第一单链DNA模板的5’末端，而所述自折叠区段中的一个是在第一单链DNA模板的3’末端； (d)第一单链DNA模板自折叠并形成第一柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第一对自折叠区段的双链茎； (e)延伸第一柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (f)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)，其包含靶多核苷酸序列⑴。
2.权利要求I的方法，其中所述靶多核苷酸序列是RNA。
3.权利要求2的方法，其中步骤(c)包括延伸第一复合引物的3’末端以产生第一RNA/DNA杂交体，和去除第一 RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板。
4.权利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过酶切紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域来确定靶多核苷酸序列的5’末端。
5.权利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过阻遏寡核苷酸(_)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交确定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步骤(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻断第一复合引物的延伸。
6.权利要求5的方法，其中所述第一复合引物还包含在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)使单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体； (h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板㈠；和 继续步骤⑷、(e)和⑴。
7.权利要求5的方法，其中第一复合引物的3’靶-识别部分包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)使单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体； (h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(-)，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第ニ对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端； (i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎； U)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)。
8.权利要求5的方法，其中所述第一对自折叠区段包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段及其位于靶多核苷酸序列独立部分的互补序列，该方法还包括在步骤(f)之 后的以下步骤 (g)单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体； (h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(_)，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第ニ对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端； (i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎； U)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)。
9.权利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过使模板转换寡核苷酸(TSO)(-)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交，来确定靶多核苷酸序列的5’末端，其中步骤(c)包括延伸第一复合引物3’端至模板转换寡核苷酸(TSO)的部分。
10.权利要求9的方法，其中所述第一复合引物还包含，从5’到3’端，并在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，且模板转换寡核苷酸(TSO)包含，从5’到3’端，通用部分(U)和与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域互补的部分，其中所述第一对自折叠区段包含通用部分(U)及其互补序列，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)使单链RNA产物(+)与第一复合引物或第二复合引物(_)杂交并延伸第二复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体，其中所述第二复合引物包含5’启动子部分(P)和通用部分(U)； (h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板㈠；和 继续步骤⑷、(e)和⑴。
11.权利要求I的方法，其中所述靶多核苷酸序列是DNA。
12.权利要求11的方法，在步骤(a)之前，包括一个变性步骤。
13.权利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过酶切紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域来确定靶多核苷酸序列的5’末端。
14.权利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过阻遏寡核苷酸(_)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交确定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步骤(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻断第一复合引物的延伸。
15.权利要求14的方法，其中所述第一复合引物还包含，在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生RNA/DNA杂交体； (h)去除RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板㈠；和 继续步骤⑷、(e)和⑴。
16.权利要求14的方法，其中第一复合引物的3’靶-识别部分包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生RNA/DNA杂交体； (h)去除RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(-)，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第二对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端； (i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎； U)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)。
17.权利要求14的方法，其中所述第一对自折叠区段包含对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段及其位于靶多核苷酸序列独立部分的互补序列，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)使单链RNA产物(+)与第一复合引物(_)杂交并延伸第一复合引物的3’末端以产生RNA/DNA杂交体； (h)去除RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板(-)，所述第二单链DNA模板包含彼此互补的第二对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端； (i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄和含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎； U)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)。
18.权利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在较长的多核苷酸模板内，和其中步骤(b)包括通过使模板转换寡核苷酸(TSO)(-)与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域杂交，来确定靶多核苷酸序列的5’末端，其中步骤(c)包括延伸第一复合引物3’端至模板转换寡核苷酸(TSO)的部分。
19.权利要求18的方法，其中所述第一复合引物还包含，从5’到3’端，并在启动子部分(P)和3’靶-识别部分之间，在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，且模板转换寡核苷酸(TSO)包含，从5’到3’端，通用部分(U)和与紧接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板区域互补的部分，其中所述第一对自折叠区段包含通用部分(U)及其互补序列，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)使单链RNA产物(+)与第一复合引物或第二复合引物(_)杂交并延伸第二复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体，其中所述第二复合引物包含5’启动子部分(P) 和通用部分(U)；(h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生第一单链DNA模板㈠；和 继续步骤⑷、(e)和⑴。
20.权利要求I的方法，其中所述第一复合引物还包含，从5’到3’端，并在启动子部分(P)和3’靶识别部分之间，在靶多核苷酸序列或其互补序列中不存在的通用部分(U)，和对应于靶多核苷酸序列的5’末端部分的区段，其中该区段及其互补序列形成所述第一对自折叠区段，该方法还包括在步骤(f)之后的以下步骤 (g)单链RNA产物(+)与第一复合引物或第二复合引物(_)杂交并延伸第二复合引物的3’末端以产生第二 RNA/DNA杂交体，其中所述第二复合引物包含5’启动子部分(P)和通用部分⑶； (h)去除第二RNA/DNA杂交体中的RNA部分以产生包含启动子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互补序列(Tc)的第二单链DNA模板㈠，所述第二单链DNA模板包含彼此互补并分隔开的第二对自折叠区段，其中所述启动子部分(P)是在第二单链DNA模板的5’末端，而第二对自折叠区段中的一个是在第二单链DNA模板的3’末端； (i)第二单链DNA模板自折叠并形成第二柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分(P)的5’单链柄、含彼此杂交的第二对自折叠区段的双链茎和含介于第二对自折叠区段之间的序列的单链环； U)延伸第二柄-茎-环结构的3’末端以产生包含彼此杂交的启动子部分(P)及其互补序列(Pc)的双链启动子；和 (k)从双链启动子开始启动转录以产生多拷贝的单链RNA产物(+)。
全文摘要
本申请涉及一种用于选择性扩增一个或多个靶核酸或其片段的方法和试剂盒，以及由该方法所获得的扩增反应混合物。更具体地讲，本申请涉及一种包含5’启动子部分和与靶多核苷酸序列3’末端部分互补的3’靶-识别部分的复合引物和一种任选地，用于确定靶多核苷酸序列的5’末端部分的工具。本申请涉及的扩增反应混合物包含至少一种柄-茎-环结构，该结构包含含启动子部分的5’单链柄和含至少一对彼此杂交的自折叠区段的双链茎，和任选地，含介于该对自折叠区段之间的序列的单链环。
文档编号C12Q1/68GK102725424SQ201180007068
公开日2012年10月10日 申请日期2011年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者居金良 申请人:Rd生物科技公司