专利名称：生产啶南平的方法
生产啶南平的方法
[与相关申请的交叉引用]此专利申请要求在2010年I月26日提交的日本专利申请号14727/2010的优先权，将其全部公开引入本文作为参考。
[发明背景]发明领域
本发明涉及一种生产唳南平(pyripyropene)的方法,更具体地,一种生产唳南平A, E,0等的方法。
背景技术：
如在日本专利特开公报号(Laid-Open Publication No. ) 360895/1992 (专利文件I)和Journal of Antibiotics (1993)，46 (7)，1168-9 (非专利文件I)中公开的啶南平A，具有针对ACAT(酰基辅酶A :胆固醇酰基转移酶)的抑制活性，有望将其应用于治疗由胆固醇积累引起的疾病等等。作为产唳南平A的真菌，烟曲霉(Aspergillus fumigatus) FQ-1289菌株已在日本专利特开公报号360895/1992 (专利文件I)中公开;Eupenicillium reticulosporumNRRL-3446 菌株已在 Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35 (非专利文件2)中公开;灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株已在W02004/060065 (专利文件 2)中公开；和粪牛.青霉(Penicillium coprobium)PF1169 菌株已在 Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (专利文件 3)中公开。此外，作为唳南平A的生物合成途径,在Journal of Organic Chemistry (1996),61,882-886(非专利文件 3)和 Chemical Review (2005)，105，4559-4580 (非专利文件4)中已公开了在烟曲霉F0-1289菌株中假定的生物合成途径。这些文件公开了在烟曲霉F0-1289菌株中，通过环化酶连接分别由聚酮合酶或异戊烯转移酶合成的部分结构以合成啶南平A。
[现有技术参考]
[专利文件]
[专利文件I]日本专利特开公报号360895/1992 [专利文件 2]W02004/060065
[专利文件 3] Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[非专利文件]
[非专利文件 I] Journal of Antibiotics (1993), 46 (7), 1168-9.
[非专利文件2]Applied and Environmental Microbiology (1995),61 (12),4429-35.[非专利文件 3] Journal of Organic Chemistry (1996), 61,882-886.
[非专利文件 4] Chemical Review (2005)，105，4559-4580.
[发明概述]
本发明者现在发现，能够通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物生产啶南平A或类似物，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。已基于这些发现产生了本发明。因此，本发明的一个目的是提供一种生产啶南平A的方法。此外，根据本发明的一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养导入有以下(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平0分离啶南平A:
(I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列
(a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，
(C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其与SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQID N0:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列，(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列，
(c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(d)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，
(e)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列，
(g)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列，
(h)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。另外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，其中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮(4_hydroxy-6- (pyridin-3-yl)-3-((2E, 6E) -3, 7, 11-tr imethyldodeca-2, 6, 10-trienyl)-2H-pyran-2-one)的方法,其特征在于用4_氧-6-(3-卩比唳基)-a -卩比喃酮(4-oxo_6-(3_pyridyl)_a-pyrone)培养微生物,其中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3, 7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根据本发明的另一个实施方案，提供了上述(I)至(III)中的至少一种分离的多核苷酸。此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了重组载体，其选自PPP6 (用质粒pPP6·转化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的登记号:FERMBP-11218), pPP7 (用质粒pPP7转化的米曲霍的登记号:FERM BP-11219)和pPP9 (用质粒dPP9转化的米曲霍的登记号:FERMBP-11220)。此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体。根据本发明的另一个实施方案，提供了上述重组载体用于生产啶南平A的用途。根据本发明的另一个实施方案，提供了上述转化体用于生产啶南平A的用途。根据本发明的生产方法，能够通过基因重组技术生产啶南平A，E，0等等。因此本发明的生产方法对啶南平A，E，0等等的大量生产技术具有重大贡献。
[附图简述]
[图I]图I显示了 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物M:分子量标记(IOObp梯)，泳道I:SEQ ID N0:1和2的引物，泳道2:SEQ ID NO:239和240的引物，泳道3:SEQ ID NO:237和238的引物，泳道4:SEQ ID NO:241和242的弓丨物，泳道5:SEQ ID NO:247和248的引物，泳道6:SEQ ID NO:251和252的引物，泳道7:SEQID NO:245 和 246 的引物，泳道 8:SEQ ID NO:243 和 244 的引物，泳道 9:SEQ ID NO:249250的引物，泳道10:SEQ ID N0:235和236的引物，泳道11:SEQ IDN0:233和234的引物，泳道12:SEQ ID N0:227和228的引物，泳道13:SEQID NO:229和230的引物，泳道14:SEQID NO:231和232的引物。
[图2]类似图I，图2显示了 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:M:分子量标记(IOObp梯)，泳道I: SEQID NO: 253和254的引物，泳道2: SEQID NO:257 和 258 的引物，泳道 3:SEQ ID NO:259 和 260 的引物，泳道 4:SEQ ID NO:255 和256的引物，泳道5:SEQ ID NO:261和262的引物。
[图3]类似
图1，图3显示了 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:泳道I:分子量标记(IOObp梯)，泳道2: SEQ ID NO: 264 265的引物(400bp扩增片段)。
[图4]图4显示了 pUSA的质粒图谱。[图5]图5显示了 pPP2的质粒图谱。
[图6]图6显示了 P450-2cDNA扩增的方案。
[图7]图7显示了 pPP3的质粒图谱。
[图8]图8显示了啶南平E在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图9]图9显示了用质粒pPP2转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图10]图10显示了啶南平O在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图11]图11显示了显示了用质粒PPP3转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的
1H-NMR 谱。
[图12]图12显示了质粒pPP6，pPP7和pPP9的质粒图谱。
[发明详述]微牛物保藏
用质粒DCCl-PPl转化的大肠杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌EPI 300 -TlE)已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址日本茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305 —8566) (AISTTsukuba Central 6,1-1-lHigashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan,305-8566)),登记号为自2008年10月9日(原始保藏日期)起的FERM BP-11133 (从登记号为FERMP-21704的国内保藏移管)(保藏者所用的识别标识(identification reference):大肠杆菌 EPI300tm-T17dCC1-PP1)。用质粒pPP2转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6(邮政编码305 — 8566))，登记号为自2009年6月23日起的FERM BP_11137(保藏者所用的识别标识米曲霉PP2-1)。用质粒pPP3转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6(邮政编码305 — 8566))，登记号为自2009年7月3日起的FERM BP_11141(保藏者所用的识别标识米曲霉PP3-2)。用质粒pPP6转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城县筑波市东 I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305 - 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERMBP-11218 (保藏者所用的识别标识米曲霉PP6)。用质粒pPP7转化的米曲霉已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城县筑波市东 I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305 - 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERMBP-11219 (保藏者所用的识别标识米曲霉PP7)。
用质粒pPP9转化的激血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城县筑波市东 I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305 - 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERMBP-11220 (保藏者所用的识别标识米曲霉PP9)。生产啶南平的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产啶南平的方法，其中通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物得到次级代谢产物，在所述微生物中引入参与啶南平A生物合成的基因。啶南平A生物合成途径的实例包括以下方案I。
[表I]
辅酶A, Cs.4■氣+P-吡啶基)- -吡喃義
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方案I
下面将详细描述上述方案I的每个生物合成途径。
1.允许烟酸与辅酶A连接酶反应，并进一步允许得到的产物与LovB样聚酮合酶(PKS)反应，由此产生5-(3-吡啶基)-3，5- 二氧戊酸。
2.允许5-(3-吡啶基)-3，5-二氧戊酸与LovB样聚酮合酶(PKS)反应，由此产生4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮。
3.允许4-氧-6-(3-吡啶基)-a -吡喃酮和法尼焦磷酸(FPP)与UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)反应，由此产生4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
4.允许4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-( (2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮与FAD依赖性单加氧酶(FMO)反应，并进一步允许得到的产物与环化酶(IMP:整合膜蛋白(Integral membrane protein))反应，由此产生去乙酰唳南平E。
5.允许去乙酰啶南平E与乙酰基转移酶(AT)反应，由此产生啶南平E。
6.允许啶南平E与细胞色素P450单加氧酶(I)(P450-1)反应，由此产生11_去乙酰啶南平O。
7.允许11-去乙酰啶南平0与乙酰基转移酶-2(AT-2)反应，由此产生啶南平O。
8.允许啶南平0与细胞色素P450单加氧酶(2)(P450-2)反应，由此产生7-去乙酰啶南平A。
9.允许7-去乙酰啶南平A与乙酰基转移酶-2(AT-2)反应，由此产生啶南平A。例如，通过下文的参考实施例3中的方法能够合成去乙酰啶南平E。例如，通过日本专利特开公报号239385/1996中描述的方法能够合成啶南平E。例如，通过下文的参考实施例4中描述的方法能够合成11-去乙酰啶南平O。例如，通过在J. Antibiot. 1996，49，292中描述的方法能够得到啶南平O。例如，通过在日本专利特开公报号259569/1996中描述的方法能够合成7_去乙酰啶南平A。例如，通过在J. Org. Chem. 1983. 48. 3945中描述的方法能够合成4_氧_6-(3_吡啶基)-a-吡喃酮。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2,pPP3,pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中弓I入以下
(IV)和(V)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平0分离啶南平A:
(IV)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQID NO: 269，270和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(V)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(I)以下(a)至(c)中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，和
(c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒pPP2，pPP3和pPP9的一种或多种载体，并通过啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2，pPP3和pPP9的微生物，并通过啶南平0分离啶南平A。 根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中弓IA以下(VI)和(VII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A:
(VI)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQID NO: 269，270，274和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(VII)分离的多核苷酸,其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(1)以下(a)至⑷中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，
(C)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒PPP2，pPP3，pPP7和pPP9的一种或多种载体，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的微生物，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)_a -吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a-吡喃酮培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核 苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。在此情况下，优选使用能够在体细胞内生物合成法尼焦磷酸(FPP)的微生物作为上述微生物。这样的微生物的实例包括属于曲霉属(Aspergillus)的微牛.物。根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)_a -吡喃酮培养)的优选实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a-吡喃酮培养微生物，在所述微生物中引入以下(VIII)和(IX)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮
(VIII)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO: 273的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；
(IX)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
和
(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养包含质粒PPP6的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平E。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平E。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的优选实施方案， 提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(X)和(XI)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平E:
(X)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID N0:274的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XI)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP7的微生物，并分离啶南平E。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中弓I入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中弓IA以下(XII)和(XIII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平0:
(XII)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQID NO: 269和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XIII)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列(1)以下(a)至(b)中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，和
(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提 供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，所述微生物包含选自质粒pPP2和pPP9的一种或多种载体，并分离啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2和pPP9的微生物，并分尚卩疋南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离11-去乙酰啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离11-去乙酰
啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离11-去乙酰啶南平0:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO:269的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白.根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平E培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2的微生物，并分离11-去乙酰啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶
南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶 南平0:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO:275的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培养)的更优选的实施方案，提供了一种生产啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培养包含质粒PPP9的微生物，并分离啶南平O。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离7-去乙酰啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP 3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离7-去乙酰啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培养微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离7-去乙酰啶南平A:
(XIV)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO:270的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用啶南平0培养)的优选实施方案，提供了一种生产7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培养包含质粒pPP3的微生物，并分离7-去乙酰啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离啶南平A。根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养微生物，在所述微生物中引入以下(XVI)和(XVII)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离啶南平A:
(XVI)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO: 275的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列；和
(XVII)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列
(1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的生产方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培养)的优选实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培养包含质粒pPP9的微生物，并分离啶南平A。可使用下面描述的重组载体将多核苷酸引入用于本发明的微生物。然而，可通过例如电穿孔法、聚乙二醇法、农杆菌法、锂法、氯化钙法等等将多核苷酸引入微生物。用于本发明的微生物没有特别的限制，只要其可引入多核苷酸，或包含其的重组载体。优诜属于曲霉属的微牛物,特别优诜米曲霉。
在本发明中，可通过例如在需氧条件下的固体培养、振荡培养、在搅拌下起泡培养或深部需氧培养，特别地，优选振荡培养。可使用通常使用的成分作为培养微生物的培养基，例如，使用葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物和植物油等等作为碳源。另外，可使用大豆粉、小麦胚芽、玉米衆、棉籽柏(cotton seed meal)、肉膏、聚蛋白胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等作为氮源。此外，根据需要加入钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等等)、硫酸(硫酸镁等等)或可产生其他有效离子的无机盐。另夕卜，根据需要可加入多种微生素如硫胺(盐酸硫胺等等)，氨基酸如谷氨酸(谷氨酸钠等等)或天冬酰胺(DL-天冬酰胺等等)，微量营养物如核苷酸，或选择剂如抗生素。此外，可适当地加入帮助真菌生长和促进啶南平A生产的有机物或无机物。培养基的pH为，例如约pH 5. 5至pH 8。合适的培养温度为15°C至40°C，在许多情况下，生长在约22。。至30°C下进行。4-羟基-6-(吡啶-3-基)_3_ ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平0和啶南平A的生产根据培养基和培养条件，或使用的宿主而变化。在任意培养方法中，积累通常在2天至10天中达到峰值。当培养物中的啶南平A的量达到峰值时终止培养，并从培养物中 分离和纯化期望的物质。为了从培养物中分离5- (3-吡啶基)-3，5- 二氧戊酸、4_氧_6_ (3_吡啶基)_ a -吡喃酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平O、7-去乙酰啶南平A、啶南平A等等，可根据其性能通过通常的分离手段提取和纯化上述产物，如溶剂提取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析法、凝胶过滤法、透析、沉淀法，所述方法可单独使用或适当地组合使用。特别优选溶剂提取法。在本发明中，术语"基本等同的氨基酸序列"指不影响多肽活性的氨基酸序列，尽管一个或多个氨基酸已通过取代、缺失、添加或插入而改变。优选地，通过氨基酸取代、缺失、添加或插入改变的氨基酸序列与改变前的氨基酸序列等具有70%或更高，优选80%或更高，更优选90%或更高，更优选95%或更高，和更优选98%或更高的序列同一性。此外，改变的氨基酸残基数为，优选I至40，更优选I至20，更优选I至10，更优选I至8，和最优选I至4。此外，不影响活性的改变的一个实例包括保守取代。术语〃保守取代〃指用其他化学性质类似的氨基酸残基取代优选I至40，更优选I至20，更优选I至10，更优选I至8，和最优选I至4个氨基酸残基，使得基本不改变多肽的活性。其实例包括用另一种疏水氣基酸残基取代特定的疏水氣基酸残基的情况，和用另一种具有相同电荷的极性氣基酸残基取代特定的极性氨基酸残基的情况。能够取代每种氨基酸的功能类似的氨基酸是本领域已知的。具体地，非极性(疏水)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等等。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等等。正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等等。负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸、谷氨酸等等。术语〃严格条件〃在本发明中指下述条件，其中在高温下和具有低盐浓度的溶液中进行杂交后的膜洗涤操作，本领域技术人员将能够适当地确定所述条件，例如所述条件包括在具有2 X SSC (I X SSC: 15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0. 5%SDS的溶液中在60° C下洗涤20分钟的条件，和在具有0. 2\330(1\33(:151111柠檬酸三钠，1501111氯化钠)和0.1%SDS的溶液中在60° C下洗涤15分钟的条件。可依照已知方法进行杂交。另外，当使用市售的文库时，可依照其附带的说明中描述的方法进行杂交。在本说明书中，术语核苷酸序列的〃同一性〃(又称同源性)指在待比较的序列之间，组成各个序列的碱基的匹配程度。在比较时考虑缺口的存在和氨基酸特征。在本说明书中显示的任意“同一性”值可为使用本领域技术人员已知的同源性检索程序计算的值。例如，通过使用FASTA，BLAST等等中的默认(初始设置)参数，可容易地计算所述值。在本说明书中，核苷酸序列的〃同一性〃为90%或更高，优选95%或更高，更优选98%或更高，更优选99%或更高。在本说明书中，术语〃在多核苷酸中缺失、取代、插入或添加一个或多个核苷酸〃指通过已知方法如位点特异性诱变法，或多个核苷酸的取代等进行的改变，改变的程度是 其可天然发生的。改变的核苷酸数为一个或多个核苷酸(例如，I至几个核苷酸，或1，2，3或4个核苷酸)。术语"编码与所述(各个)核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白的核苷酸序列"指核苷酸序列编码的蛋白质与“所述(各个)核苷酸序列编码的蛋白质”具有等同的活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有辅酶A连接酶活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有LovB样聚酮合酶(PKS)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有细胞色素P450单加氧酶(I) (P450-1)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有细胞色素P450单加氧酶(2) (P450-2)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有环化酶aMP:整合膜蛋白)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有FAD依赖性单加氧酶(FMO)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有乙酰基转移酶(AT)活性。优选地，与SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白具有乙酰基转移酶-2 (AT-2)活性。
获得分离的多核苷酸
不特别限制获得本发明的分离的多核苷酸的方法。可通过以下方法从龚生直藍PF1169菌株或丝状真菌中分离多核苷酸。具体地，基于以下实施例9等方法得到的同源序列，合成了能够特异性扩增任意参与啶南平A合成的一种或多种以下基因的引物聚酮合酶基因，异戊烯转移酶基因，羟化酶基因，乙酰基转移酶基因或腺苷酸合成酶基因。对粪生青霉PFl 169菌株的福斯质粒(fosmid)基因组文库进行PCR，单独制备了文库并进一步进行了菌落杂交，由此获得用于本发明的分离的多核苷酸。根据本发明的优选实施方案，提供了上述(I)至(III)的至少一种分离的多核苷酸。特别地，提供了以下⑴至(III)的至少一种多核苷酸
(I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列(a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，
(C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其与SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQID NO:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列
(I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列，
(c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(d)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，
(e)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列，
(g)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列，
(h)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与和(I)的核苷酸序列互补的序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。根据本发明的更优选的实施方案，提供了选自以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e), (f),
(g)和(h)的分离的多核苷酸
(a)多核苷酸，其具有SEQID NO:266的核苷酸序列，
(b)多核苷酸，其编码由选自SEQID NO: 269，270，273，274和275的氨基酸序列组成的多肽，
(c)多核苷酸，其具有与SEQID N0:269显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有羟化酶活性的多肽，
(d)多核苷酸，其具有与SEQID NO: 270显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有羟化酶活性的多肽，
(e)多核苷酸，其具有与SEQID NO: 273显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有异戊烯转移酶活性的多肽，
(f)多核苷酸，其具有与SEQID NO: 274显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，
(g)多核苷酸，其具有与SEQID NO: 275显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和(h)分离的多核苷酸，其具有选自以下(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(V)的核苷酸序列
(i)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(ii)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，
(iii)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列，
(iv)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(v)在SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。根据本发明的更优选的实施方案，提供了选自以下(A)，⑶和(C)的分离的多核苷酸
(A)多核苷酸，其编码由选自SEQID NO:275的氨基酸序列组成的多肽，
(B)多核苷酸，其具有与SEQID NO:显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列275，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和
(C)分离的多核苷酸，其具有在SEQID N0:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。根据本发明的更优选的实施方案，提供了所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸，其中所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列分别与SEQ IDNO: 269，270，273，274和275中显示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。根据本发明的更优选的实施方案，提供了所述(B)的多核苷酸，其中所述(B)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 275中显示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。重组载体
可依照常规方法，例如，在[Sambrook, J.等人，"Molecular cloning:a laboratorymanual", (USA),第 2 版,Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]中描述的基因重组技术，通过将上述(I)至(III)中的任一种或多种多核苷酸根据目的修饰为适当的形式，并将其连接至载体制备根据本发明的重组载体。用于本发明的重组载体可适当地选自病毒、质粒、福斯质粒、粘粒载体等等。例如，当宿主细胞是大肠杆菌时，其实例包括基于\噬菌体的噬菌体和基于pBR和pUC的质粒。在枯草芽孢杆菌的情况下，实例包括基于pUB的质粒。在酵母的情况下，实例包括基于YEp，YRp，YCp和Hp的质粒。优选地，在使用的质粒中的至少一种质粒包含用于选择转化体的选择标记。可使用编码药物抗性和基因互补营养缺陷体的基因作为选择标记。其具体的优选实例包括，当使用的宿主是细菌时为氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等等；在酵母的情况下为色氨酸生物合成基因(TRPl)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等等；在真菌的情况下为潮霉素抗性基因、双丙氣勝(bialaphos)抗性基因、博来霉素抗性基因、短梗霉素(aureobasidin)抗性基因等等；和在植物的情况下为卡那霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因等等。另外，用于本发明的作为表达载体的DNA分子优选具有表达各个基因所必需的DNA序列，例如，转录调控信号和翻译调控信号，如启动子、转录起始信号、核糖体结合位点、翻译终止信号、终止子。优选的启动子的实例包括大肠杆菌中的乳糖操纵子、色氨酸操纵子等的启动子；在酵母中的醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖代谢基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因等的启动子；在真菌中的a-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纤维二糖水解酶基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因、abpl基因等的启动子；在植物中的CaMV 35S RNA启动子、CaMV 19S RNA启动子或胭脂氨酸合成酶基因启动子。根据本发明的重组载体优选地是选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的重组载体。 另外，根据本发明的优选实施方案，举例说明了选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的重组载体用于生产啶南平A的用途。转化体
根据使用的载体的类型，其中引入根据本发明的分离的多核苷酸的宿主可适当地选自放线菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌、植物细胞等等。根据检测的宿主细胞，将重组载体引入宿主的方法可选自接合转移、通过噬菌体的转导以及例如钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌法或基因枪法的转化方法。在引入多个基因至本发明的宿主细胞中的情况下，基因可包含在单个DNA分子中或分别包含在不同的DNA分子中。此外，当宿主细胞是细菌时，可将各个基因设计为以多顺反子mRNA的形式表达并成为I个DNA分子。根据本发明的转化体优选地是包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的转化体。根据本发明的优选实施方案，举例说明了包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的转化体用于生产啶南平A的用途。通过以下实施例将进一步详细说明本发明，所述实施例无意限制本发明。实施例I :制备粪牛青霉PFl 169株的基因组DNA
将无菌NB培养基(500ml)置于三角瓶(IL)。将在1/2CMMY琼脂培养基中28°C预培养4 天的幾生青霉 PFl 169 株(Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008 (专利文献3))加入上述培养基，并在28°C液体培养4天。用Miracloth过滤，获得5g真菌细胞。从这些真菌细胞根据基因组DNA纯化试剂盒Genomic-tip 100/G (Qiagen K. K.制)所附的手册获得30 ii g基因组DNA。
实施例2 :用于扩增聚酮化合物合酶(PKS)的简并引物和其扩增片段基于多种丝状真菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，设计并合成下列引物作为简并引物用于扩增LCl GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO :1)
LC2c GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO :2)
(其中 R=A/G，X=CfT, M=A/C，I=肌苷)。
使用这些简并引物，将实施例I中制备的基因组DNA和ExTaq聚合酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手册进行反应。检测到约700bp的扩增片段(图I)。进一步地，分析上述扩增片段来特定其内部的500bp序列(SEQID NO :3)。
实施例3 :基因组DNA的大暈测序和氨基酸序列同源性检索
将实施例I中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50 ii g份进行预处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了 103000个约250bp片段序列(总计49Mb的序列)。
对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶烟曲霉PKS 2146a. a.和灰黄青霉(Penicillium(P.)griseofIuvum)6-甲基水杨酸(methylsalycilic acid)合酶 1744a. a.;异戍烯转移酶烟曲霉异戊烯转移酶，烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)和马尼菲青霉(Penicillium(P. )marneffei)异戍烯转移酶)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得89个、86个、2个、I个和3个同源序列(见表2)。进一步地，从烟曲霉PKS2146a. a.和灰黄青霉6_甲基水杨酸合酶1744a. a.的同源序列，分别获得19个和23个叠连序列(烟曲霉PKS 2146a. a.的叠连序列SEQ ID NO :179至197 ;灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a. a.的叠连序列SEQ ID NO :198至220)(见表2)。
表2
酶名称____同源性序列数目 SEQ ID NO. 聚酮化合物烟曲霉 89 4到92 合酶PKS 2146 a.a.___
灰黄青霉6 -8693到178
曱基水杨酸合酶
__1744 a.a.___
权利要求
1.一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养导入有以下(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A: (I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列， (b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白， (C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQ ID N0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和 (d)核苷酸序列，其与SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQID NO:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列； (III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列， (c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (d)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列， (e)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列， (f)SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列， (g)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列， (h)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和 (i)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和 (4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
2.根据权利要求I的生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A。
3.根据权利要求I的生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养导入有以下(IV)至(V)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A: (IV)分离的多核苷酸，其具有选自对选自SEQID NO: 269，270和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列；(V)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (1)以下(a)至(C)中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，和 (c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
4.根据权利要求2的生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养包含质粒pPP2，PPP3和pPP9的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A。
5.生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养导入有根据权利要求I的(I)至(III)中的至少一种所述多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
6.根据权利要求5的生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
7.根据权利要求5的生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养导入有以下(VI)和(VII)中的至少一种所述多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A: (VI)分离的多核苷酸，其具有选自编码选自SEQID NO: 269，270，274和275的至少一种氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一种核苷酸序列； (VII)分离的多核苷酸,其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (1)以下(a)至⑷中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列， (C)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列；和 (d)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
8.根据权利要求6的生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养包含质粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的微生物，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
9.一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养导入有权利要求I的(I)至(III)中的至少一种所述多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
10.根据权利要求9的生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养包含选自质粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-( (2E，6E) -3, 7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
11.根据权利要求9的生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养导入有以下(VIII)和(IX)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2,6, 10-三烯)-2H-吡喃-2-酮 (VIII)分离的多核苷酸，其具有选自编码SEQID NO: 273的氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列； (IX)多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列 (1)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其编码与所述核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
12.根据权利要求11的生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2￡，6￡)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培养包含质粒PPP6的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
13.根据权利要求I的(I)至(III)的至少一种分离的多核苷酸。
14.根据权利要求13的分离的多核苷酸，其选自以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)和(h): (a)多核苷酸，其具有SEQID NO:266的核苷酸序列， (b)多核苷酸，其编码由选自SEQID NO: 269，270，273，274和275的氨基酸序列组成的多肽， (c)多核苷酸，其具有与SEQID NO:269中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有羟化酶活性的多肽， (d)多核苷酸，其具有与SEQID N0:270中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有羟化酶活性的多肽，(e)多核苷酸，其具有与SEQID N0:273中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有异戊烯转移酶活性的多肽， (f)多核苷酸，其具有与SEQID N0:274中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽， (g)多核苷酸，其具有与SEQID N0:275中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和 (h)分离的多核苷酸，其具有选自以下(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(V)的核苷酸序列 (i)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (ii)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列， (iii)SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列， (iv)SEQ ID NO :266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和 (V)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。
15.根据权利要求13或14的分离的多核苷酸，其选自以下(A)，⑶和(C): (A)多核苷酸，其编码由选自SEQID NO:275的氨基酸序列组成的多肽， (B)多核苷酸，其具有与SEQID NO:275中显示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其编码具有乙酰基转移酶活性的多肽，和 (C)分离的多核苷酸，其具有SEQID NO: 266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列。
16.根据权利要求14的多核苷酸，其中由权利要求14的所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列分别与SEQ ID NO: 269，270，273，274和275中显示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。
17.根据权利要求15的多核苷酸,其中由权利要求15的⑶的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:275中显示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。
18.选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的重组载体。
19.包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体的转化体。
20.根据权利要求18的所述重组载体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
21.根据权利要求19的所述转化体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
全文摘要
提供了用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物制备啶南平的方法，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。
文档编号C12N15/09GK102762737SQ20118000726
公开日2012年10月31日 申请日期2011年1月19日 优先权日2010年1月26日
发明者三富正明, 后藤公彦, 土田麻里子, 安西弘行, 尾山和彦, 山本憲太朗 申请人:明治制果药业株式会社