专利名称：工程化生物神经移植物的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及再生医学和组织工程领域，更具体地涉及轴突导向移植物的制备及其用于修复受损神经的用途。背景神经是封闭的缆绳样的轴突束。神经提供沿着每个轴突传输的电化学神经脉冲的共同路径。每个神经含有许多轴突。每个轴突由称为神经内膜的结缔组织层包围。轴突一起束集成称为神经束的群组，每个神经束包裹在称为神经束膜的结缔组织层中。最后，整个神经包裹在称为神经外膜的结缔组织层中。当神经轴突被切断时，仍然与细胞体连接的末端被标记为近端节段，而另一末端被称为远端节段。周围神经系统(PNS)中的神经再生通过轴突芽进行，轴突芽在近端残余部分形成并且生长至其到达远端残余部分为止。芽的生长通过从施万(Schwann)细胞(神经膜细胞)分泌的趋化因子来控制。只要细胞体是完整的，近端轴突就能够再生，并且其与神经内膜通道中的施万细胞进行接触。人轴突生长速率在小神经中可达到2毫米/天，在大神经中可达到5毫米/天。然而，远端节段在受损伤后的数小时内经历沃勒变性(Walleriandegeneration);轴突和髓磷脂发生变性，但是神经内膜保持不变。在再生后期，剩余神经内膜管引导轴突生长回到正确靶标。在沃勒变性期间，施万细胞沿着神经内膜管长成有序的多个列，从而产生保护和维持神经内膜通道的宾格内氏带(band of Bungner ;boB)。另外，巨噬细胞和施万细胞释放增强再生长的神经营养因子。发明概述本发明的一个方面是多细胞构建体。所述构建体包括多细胞区域，所述多细胞区域具有多个彼此粘附的活细胞以形成细长移植物，以便恢复切断神经的末端之间的神经连接。多个无细胞通道在移植物的内部轴向延伸。本发明的另一个方面是细长三维结构。所述结构包括多个工程化多细胞体。每个多细胞体包括多个彼此粘附的活细胞。所述结构还包括多个离散填充体。每个填充体包括抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料。所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。本发明的另一个方面是细长三维结构。所述结构包括多个不受神经支配的多细胞体。每个多细胞体包括多个彼此粘附的活细胞。所述结构包括多个离散填充体。每个填充体包括抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料。所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。本发明的另一个方面是细长三维结构。所述结构包括多个多细胞体。每个多细胞体包括组织培养基和多个彼此粘附的活细胞。所述结构包括多个离散填充体。每个填充体包括抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料。所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。本发明的另一个方面是一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能。所述移植物包括细长三维结构，其包含多个活细胞和多个在细长三维结构的相反末端之间延伸的离散的无细胞通道。在另一个方面，本发明包括一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神 经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能。轴突导向移植物包括由多个活细胞制成的细长三维结构。活细胞包括施万细胞。所述细长三维结构是工程化组织，不是自体移植物，是不受神经支配的，和/或包括组织培养基。本发明的另一个方面是一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能。所述移植物包括包含多个活细胞的细长三维结构。所述三维结构包括外侧部分和中央部分，所述中央部分在所述外侧部分的相反末端之间轴向延伸，以使得所述外围部分围绕所述中央部分。所述中央部分的活细胞群包含的施万细胞的百分比高于所述外侧部分的活细胞群中的施万细胞的百分比。所述细长三维结构是工程化组织，不是自体移植物，是不受神经支配的，和/或包括组织培养基。本发明的另一个方面是一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能。所述移植物包括包含多个活细胞的细长三维结构。多个活细胞包括施万细胞。至少一个无细胞通道在细长三维结构的相反末端之间延伸。至少一个填充体处于无细胞通道中。至少一个填充体包括琼脂糖。至少一些所述施万细胞沿着所述无细胞通道与所述填充体相邻安置。本发明的另一个方面是包括多个彼此粘附的活细胞的多细胞体。多个活细胞包括第一类型的活细胞和第二类型的活细胞。第一类型的活细胞是施万细胞，并且施万细胞占多个活细胞的约O. 1%至约20%。本发明的另一个方面是包括多个彼此粘附的活细胞的多细胞体。多个活细胞包括第一类型的活细胞和第二类型的活细胞。第一类型的活细胞是骨髓干细胞，并且骨髓干细胞占多个活细胞的约90%。本发明的另一个方面是三维结构。所述三维结构包括多个细长的多细胞体。每个多细胞体包括多个彼此粘附的活细胞。所述多细胞体具有相反的轴向末端。多细胞体以三维方式布置，其中多细胞体相对于彼此具有并排的取向，并且一个多细胞体的至少一个末端与一个相邻多细胞体的相应末端轴向偏置。本发明的另一个方面是制备具有以施万细胞填充的多个轴向通道的多细胞构建体的方法。所述方法包括以下步骤I)制备多种类型的细胞粘团，所述细胞粘团在选定的活细胞当中具有不同浓度的施万细胞，2)使每个细胞粘团成形为细长的形状，3)将成形的细胞粘团在受控环境中孵育以使得细胞彼此粘附以便形成细长的多细胞杆，4)制备具有与多细胞杆相似大小的无细胞填充杆或支承杆 5)根据一定的方式来布置多个多细胞杆和无细胞杆，所述方式使得每个多细胞杆接触至少一个其它多细胞杆，并且使得具有较低浓度施万细胞的多细胞杆放置在周围层中，而具有较高浓度施万细胞的多细胞杆放置在中心，以及6)使多细胞杆与至少一个其它多细胞杆融合以便形成所需构建体。在某些实施方案中，本文公开三维神经移植物构建体，其包含(a)多个第一工程化多细胞体，其中多个第一工程化多细胞体中的每个工程化多细胞体包括多个第一活细胞；(b)多个第二工程化多细胞体，其中多个第二工程化多细胞体中的每个工程化多细胞体包括多个第二活细胞；和(C)多个离散填充体，其中多个离散填充体中的每个离散填充体包括抵抗多个第一活细胞或第二活细胞迁移和向内生长的生物相容性材料；其中多个离散填充体形成多个在三维结构的第一末端与第二末端之间纵向延伸的无细胞通道。在一些实施方案中，多个第一活细胞和多个第二活细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞或其任意组合。在一些实施方案中，多个第一活细胞包括施万细胞。在一些实施方案中，多个第二活细胞包括骨髓干细胞。在一些实施方案中，多个第一工程化多细胞体集聚在多个无细胞通道的周围。在一些实施方案中，多个第二工程化多细胞体集聚在移植物的外周。在一些实施方案中，填充体包含琼脂糖。在某些实施方案中，本文公开槽形生物结构，其包含(a)多个第一活细胞；(b)多个第二活细胞；和(C)多个无细胞通道；其中多个无细胞通道在三维结构的第一末端与第二末端之间纵向延伸。在一些实施方案中，无细胞通道是中空的。在一些实施方案中，无细胞通道以填充体填充或部分地填充。在一些实施方案中，多个第一活细胞和多个第二活细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞或其任意组合。在一些实施方案中，多个第一活细胞包括施万细胞。在一些实施方案中，多个第二活细胞包括骨髓干细胞。在一些实施方案中，多个第一活细胞集聚在多个无细胞通道的周围。在一些实施方案中，多个第二活细胞集聚在移植物的外周。在某些实施方案中，本文公开的是本文所公开槽形生物结构用于重新接合受损轴突的近端和远端残余部分的用途。在某些实施方案中，本文公开的是本文所公开槽形生物结构用于制备重新接合受损轴突的近端和远端残余部分的神经移植物的用途。其它目的和特征将部分显而易见并且在下文中部分地指出。附图简述
图I是由多细胞体和填充体组装的三维结构的一个实施方案的透视图；图IA是由多细胞体组装的三维结构的另一个实施方案的透视图；图2示出多个多细胞体和填充体根据预定方式彼此上下堆叠以便形成图I中示出的三维结构的顺序的一个实施方案。图2A示出多个多细胞体和填充体根据预定方式彼此上下堆叠以便形成三维结构的顺序的另一个实施方案；图2B示出以图2A中示出的顺序制备的三维结构成熟为轴突导向移植物的顺序；
图2C是根据图2A示出的顺序制备的三维构建体的俯视图，所述三维构建体在构建体的末端堆叠有额外的填充体以便获得额外稳定性。图3A-3D示出制备多细胞体的方法的一个实施方案；图4A — 4C示出制备适用于制备多细胞体的模型的方法的一个实施方案；图5是轴突导向移植物的一个实施方案的示意性透视图，其中移植物的一部分已经被去除以显示其内部特征；图6是轴突导向移植物的一个实施方案的照片；图7是根据本文所述方法工程化的轴突导向移植物的一个实施方案的横切片的照片，其中施万细胞已经过荧光标记；图8和9是显示在植入根据本文所述方法工程化度轴突导向移植物之后的大鼠的手术区域的照片。
图10是在植入大鼠体内之后三周收获的含有根据本文所述方法工程化的轴突导向移植物的一个实施方案的神经节段的照片；图11包括从图10中显示的神经节段获取的横切片的一组组织学照片，其中切片分别沿着线AA、BB、CC、DD和EE来获取，并且图11左列中的照片经过设定大小以便显示移植物的整个横截面，并且在左列中的照片的右侧是左列中的照片中的各种特征的放大照片;图12包括将根据本文所述方法工程化的轴突导向移植物植入大鼠体内三周之后从近端原生神经(左)和远端原生神经(右)获取的横切片的两个组织学照片；以及图13是示出植入单独胶原导管(图(a))或用根据本文所述方法工程化的轴突导向移植物填充的胶原导管(图(b)) 12周之后，从大鼠切除的神经节段的总体形态的照片。相应的参考字符指示整个图中的相应部件。详述本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用的方式整体并入。每年，仅在美国就要进行200，000例以上的周围神经手术。通常，这些手术需要移植物以便桥接一个或多个切断神经。神经的自发再生通常限于两个末端之间不超过3cm的间隙。修复破裂的神经是一个严峻的临床难题，因为神经必须朝向其靶标重新生长或再生。在一些情况下，可使用通过显微手术进行的直接端对端重接，但是使用此技术受到神经可拉长程度的限制(通常仅超出其原始长度约10%)。当前用于修复间隙超过约3cm的破裂的技术是使用从患者体内的另一个位置收获的移植物(即，自体移植物)。然而，自体移植物可需要多个手术步骤并且可产生进一步创伤，引起供体部位发病，由于神经与移植物之间的错配而导致异常的神经再生，并且可能最终未能充分地恢复神经功能。此外，即使当需要修复的切断神经是运动神经时，也通常使用感觉神经来进行自体移植，因为与去除运动神经相比,从供体部位去除感觉神经导致较小的发病率(去除感觉神经只导致感觉损失，而不导致运动功能损失)。然而，运动神经中的神经束比感觉神经中的神经束显著更大。因此，将感觉神经移植至运动神经中的间隙内会在原生运动神经部分与已经植入的感觉神经部分之间产生架构方面的错配。此架构方面的错配被认为至少部分地造成可伴随自体移植物而发生的异常的神经再生。已经引入另一种途径作为修复广泛神经损伤的替代方案，其依赖于使用天然或人工导管对截段末端进行套接(entubulating)来引导再生长。套接技术可桥接较短神经缺陷而没有与收获自体神经移植物相关的发病，但是修复结果随着导管材料的不同而不同。套接材料可为合成的或天然的(例如，胶原)，或同种的(即，同种异体移植物；例如，使用脱细胞的人尸体神经的同种异体移植物)。在修复周围神经中使用组织工程技术提供了用于规避与自体移植物、同种异体移植物和套接技术相关的问题的有前景的解决方案。然而，尽管存在一些科技进 步，但是将生物工程结构应用于修复患者的受损神经仍然是很有限的。一些研究显示纵向定向的圆柱形结构通过模仿神经内架构而有助于轴突生长。其它研究显示在某些人工导管中施万细胞的存在可改善神经再生，但是不足以实现通过自体移植物所观察到的恢复水平。此外，轴突生长可由于现有人工导管移植物中包含的植入支架所触发的炎症和免疫学反应而被削弱。最近，已在发明人的实验室中开发出新的组织工程技术“生物打印”，其用于制备具有所需形状的三维生物构建体。生物打印技术描述于美国专利申请第10/590，446号(公开为美国专利申请公布第2008/0070304号)中，并且进一步描述于国际专利申请第PCT/US2009/048530号(公开为W02010/008905)和相应的美国专利申请第12/491，228号(公开为美国专利申请公布第2010/0041134号)。美国专利申请公布第2008/0070304号和第2010/0041134号以及PCT公布第W02010/008905号均以引用的方式整体并入本文。生物打印技术涉及在方法中使用具有多个活细胞的工程化多细胞体，所述方法包括以预定方式布置多细胞体并且使其融合以形成工程化组织。生物打印通常是可在没有任何支架材料的情况下产生界限分明的结构特征的自动快速原型设计方法。“生物打印”技术展示了制备三维组织的前景。提供了用于制备生物工程轴突导向移植物的新的结构和方法。具体地说，提供新颖的工程化生物轴突导向移植物，其能够在神经再生过程中充当导向导管。所述移植物适合于促进轴突生长穿过导向物。所述技术涉及使用多细胞体作为构件，其可用于组装可通过成熟成为所需的工程化轴突导向移植物的三维构建体。每个多细胞体包括多个彼此充分粘附的活细胞以使得多细胞体可作为单一对象加以操作(例如，捡起和移动)。多细胞体可与一个或多个填充体(例如，包含抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料的填充体)结合使用以便组装可通过成熟成为细长三维结构的构建体，所述三维结构具有多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。填充体可容易地从工程化成熟组织的外部去除并且，如果需要的话，还可从内部(例如，从无细胞通道)去除。在某些情况下，可能有利的是在一个或多个填充体保留于移植物中的同时植入移植物。为了形成本文所述的轴突导向移植物，使用多细胞体和填充体来形成三维细长结构，其具有多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。当将轴突导向移植物植入人或其它动物中的神经损伤部位(例如，切断神经的末端之间的间隙中)时，来自近端原生神经的轴突生长穿过轴突导向移植物并且进入神经结构的远端。支持神经发育和再生的施万细胞填充轴突导向移植物中的无细胞通道与多细胞区域之间的界面的至少部分，这被认为可促进轴突生长穿过移植物。不受任何特定理论的束缚，由施万细胞和/或受损神经中的横断轴突释放的神经营养因子可促进来自近端原生神经的轴突生长穿过移植物并且进入神经的远端。已经提供使用本发明的材料和方法来制备三维生物工程化组织的方法的总体概述，现在更详细地描述此类方法和材料。多细朐体
所述技术涉及使用多细胞体作为构件，其可用于组装可通过成熟成为所需的工程化轴突导向移植物的三维构建体(图I和2)。多细胞体、其在组织工程中的一般用途，和其在制备生物工程血管中的用途详细地描述于美国专利申请第12/491，228号(公开为美国专利公布第2010/0041134号)中，该申请以引用的方式整体并入。具体地说，多细胞体描述于美国专利公布第2010/0041134号通篇中，例如段落
、
和
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,并且在美国专利公布第2010/0041134号的图1A-1C中示出。简单地说，每个多细胞体包括多个彼此充分粘附的活细胞以使得多细胞体可作为单一对象加以操作(例如，捡起和移动)。多细胞体的粘附力适当地足以使所述多细胞体自我支承(例如，在工作面上或在包括多个多细胞体的组装体中)历时足以使得活细胞能够粘附至邻接的多细胞体的活细胞的一段时间。捡起和移动呈自支承多细胞体形式的多个活细胞的能力提供了组装许多不同三维构建体的灵活性。例如，多细胞体可与一个或多个填充体(例如，包含抵抗细胞从多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中并且可抵抗细胞粘附至填充体的生物相容性材料的填充体)结合使用以便组装可通过成熟成为细长三维结构的构建体，所述细长三维结构具有多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。多细胞体和填充体也可用于组装通过成熟成为具有其它形状的工程化组织的构建体。此夕卜，因为多细胞体是自支承的，所以不需要将多细胞体埋置于支承凝胶或支架中。替代地，“在空气中打印(print in air) ”或在低粘度组织培养基中操作的能力有助于以确保多细胞体彼此直接接触的方式来布置多细胞体。多细胞体之间的较好的接触可促进多细胞体在成熟期间有效和可靠的融合。另外，填充体可容易地从工程化成熟组织的外部去除并且，如果需要的话，还可从内部(例如，管状结构的内腔或无细胞通道)去除。另外，本文所述的方法使用细长的(例如，大致杆形或杆形)多细胞体作为工程化轴突导向移植物的构件。因为细长的多细胞体已经在沿着多细胞体的纵轴的显著长度内彼此粘附，所以多细胞体的融合更可靠并且可在更少的时间内实现。此外，细长的多细胞体可以并排邻接的关系加以布置以便沿着具有实质性长度的接触区域建立多细胞体之间的接触。这可促进邻接的多细胞体彼此快速和可靠的融合。虽然本申请的图中示出的多细胞体是圆柱形杆，但是应理解多细胞体的形状可在本发明的广泛范围内变化。每个多细胞体包括多个彼此粘附的活细胞以使得在生物工程处理，例如组织或器官工程期间，细胞一起以易于处理和操作的粘弹性稠度和足够完整性来形成所需三维(3-D)形状。足够完整性是指多细胞体在后续操作期间能够保持其物理形状和维持细胞的生命力，所述物理形状并非刚性的，而是具有粘弹性稠度。多细胞体可由一种或多种预先选择的细胞类型组成。用于形成可用来构成轴突导向移植物的多细胞体的细胞可有利地包含通常存在于神经系统组织中的一种或多种细胞类型(例如，神经胶质细胞例如施万细胞，另外存在或不存在卫星神经胶质细胞)。用于形成多细胞体的细胞还可有利地包含表现出一种或多种抗炎性质的一种或多种细胞类型(例如，骨髓干细胞(BMSC)或间充质干细胞)。将表现出抗炎性质的细胞并入多细胞体中可减轻通过其它类型的神经移植物在植入部位所观察到的炎症。炎症可促进瘢痕组织形成并且可阻碍轴突向内生长至移植物中，因而对于神经功能的最佳恢复而言是不合需要的。可适当地用于形成多细胞体的其它细胞类型包括但不限于毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞。多细胞体可为同型细胞的或异型细胞的。在同型细胞多细胞体中，多个活细胞包括单一细胞类型的多个活细胞。同型细胞多细胞体中的几乎所有活细胞是单一细胞类型的细胞，其易于对较低含量的杂质产生某种程度的耐受性，包括对于包含同型细胞多细胞体的构建体的成熟仅仅具有可以忽略的影响的相对较小数量的不同细胞类型的细胞。相比之
下，异型细胞多细胞体包括显著数量的一种以上细胞类型的细胞。例如，多细胞体可包含第一类型的多个活细胞和第二类型的多个活细胞(等)，第二细胞类型不同于第一细胞类型。异型细胞多细胞体还可包括第一细胞类型的多个细胞、第二细胞类型的多个细胞，和第三细胞类型的多个细胞，其中第一、第二和第三细胞类型中的每一种不同于第一、第二和第三细胞类型中的其它类型。异型细胞体中的活细胞可保持未分选或可在融合过程期间“分选出”(例如，自组装)以便形成工程化组织的特定内部结构。细胞的分选与差异粘附假说(DifferentialAdhesion Hypothesis ；DAH)的预测一致。DAH解释了细胞群在由组分细胞之间的粘附和内聚相互作用产生的组织表面和界面张力方面的液体样行为。通常，细胞可基于细胞粘附强度的差异来分选。例如，与分选至多细胞体外部的细胞相比，分选至异型细胞多细胞体内部的细胞类型通常具有更强的粘附强度(因而具有更高的表面张力)。为了形成轴突导向移植物，在一些实施方案中，可使用同型细胞和异型细胞多细胞体的组合。例如，其中第一类型的细胞是施万细胞并且第二类型的细胞是BMSC(或另一种具有抗炎性质的细胞类型)的异型细胞多细胞体可与其中多个活细胞是BMSC (或另一种具有抗炎性质的细胞类型)的同型细胞多细胞体一起使用以便形成轴突导向移植物。在其中第一类型的细胞是施万细胞并且第二类型的细胞是BMSC(或另一种具有抗炎性质的细胞类型)的异型细胞多细胞体中，施万细胞适当地占多细胞体中的多个活细胞的约O. 1%至约20%(v/v),更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约1%至约15%(v/v),并且更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约3%至约10%(v/v)，并且甚至更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约5%至约10%(v/v)。例如，施万细胞适当地占多细胞体中的多个活细胞的约10%(v/v)。多细胞体中的多个活细胞的其余部分可为BMSC、BMSC与一种或多种其它细胞类型的组合，或任何其它合适的细胞类型。作为另外的实例，轴突导向移植物可使用具有相对较高百分比的施万细胞的第一类型异型细胞多细胞体，和具有相对较低百分比的施万细胞的第二类型异型细胞多细胞体来构建。在此情况下，在具有相对较高百分比的施万细胞的异型细胞多细胞体中，施万细胞适当地占多细胞体中的多个活细胞的约O. 1%至约20%(v/v)，更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约1%至约15%(v/v)，并且更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约3%至约10%(v/v)，并且甚至更适当地占多细胞体中的多个活细胞的约5%至约10%(v/v)。例如，在具有相对较高百分比的施万细胞的多细胞体中，施万细胞适当地占多个活细胞的约10%(v/v)。具有相对较低百分比的施万细胞的异型细胞多细胞体可基本上没有施万细胞或所包含的施万细胞的百分比可低于具有相对较高百分比的施万细胞的异型细胞多细胞体中的施万细胞的百分比。用于制备多细胞体的细胞可为来自非自体来源的细胞或来自自体来源的细胞。当使用来自自体来源的细胞时，细胞可从具有待修复的神经损伤的个体中收获，在组织培养中扩增，和用于制备多细胞体。例如，在多细胞体包含施万细胞和/或骨髓干细胞的实施方案中，这些细胞可从具有需要修复的神经损伤的人类或其它动物中收获并且可用于制备多细胞体。例如，施万细胞可在切除受损神经或另一手术步骤期间通过活检来收获。或者，嗅鞘细胞或毛囊干细胞可从具有需要修复的神经损伤的人类或动物中收获并且分化成施万细胞。BMSC可从患者的骨髓中，使用本领域中已知的各种工序，例如通过骨髓抽吸或骨髓活 检(例如，使用骨髓活检枪)来收获。然后，收获的施万细胞和BMSC可在组织培养中扩增以便产生用于制备多细胞体的足够数量的细胞。在一些情况下，除了多个细胞以外，多细胞体适当地包括一种或多种细胞外基质(ECM)组分或一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物。例如，多细胞体可含有各种ECM蛋白质(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白多糖)。ECM组分或ECM组分的衍生物可添加至用于形成多细胞体的细胞粘团中，如下文进一步详细讨论。添加至细胞粘团的ECM组分或ECM组分的衍生物可从人类或动物来源纯化,或通过本领域中已知的重组方法产生。或者,ECM组分或ECM组分的衍生物可由多细胞体中的细胞自然地分泌，或用于制备多细胞体的细胞可通过本领域中已知的任何合适方法来基因操纵以便改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基质粘附分子(例如，选择蛋白、整联蛋白、免疫球蛋白和钙粘着蛋白)的表达水平。ECM组分或ECM组分的衍生物可促进多细胞体中的细胞的粘附。例如，明胶和/或纤维蛋白原可适当地添加至用于形成多细胞体的细胞粘团。然后，纤维蛋白原可通过添加凝血酶来转化为纤维蛋白。在一些情况下，多细胞体适当地包括组织培养基。组织培养基可为任何生理相容培养基并且通常根据所涉及的细胞类型来选择，如本领域中熟知。组织培养基可包含例如例如糖和氨基酸的基本营养素、生长因子、抗生素(将污染减少到最低限度)等。此外，多细胞体可适当地为不受神经支配的(即，其基本上不含神经元)或非软骨性的，或同时为不受神经支配的和非软骨性的。多细胞体可被描述为“工程化”多细胞体，因为其与在无人构思指导下产生的生物结构不同。换句话说，多细胞体是合成的，或非天然存在的。多细胞体可具有本发明范围内的各种大小和形状。例如，多细胞体可适当地具有细长的形状，并且更适当地可为大致圆柱形(例如，大致杆形)。多细胞体通常具有与美国专利公布第2010/0041134号的段落
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中所述相同的尺寸和特征。用于制备轴突导向移植物的多细胞体的长度适当地为至少约I厘米、更适当地为至少约2厘米，并且更适当地为至少约3厘米。用于制备轴突导向移植物的多细胞体的长度适当地小于约7厘米、更适当地小于约6厘米，并且更适当地小于约5厘米。因此，例如，多细胞体的长度适当地在约I厘米至约7厘米的范围内，更适当地在约2厘米至约6厘米的范围内，并且更适当地在约3厘米至约5厘米的范围内。虽然图I和2中示出的多细胞体I为大致圆柱形并且具有大致圆形的横截面，但是具有不同大小和形状的多细胞体在本发明的范围内。例如，多细胞体可为细长的形状(例如，圆柱形形状)，具有正方形、长方形、三角形或本发明范围内的其它非圆形横截面形状。同样地，在本发明范围内，多细胞体可通常具有球形，非细长圆柱形形状或立方体形状。制备多细胞体的方法制备多细胞体的方法描述于美国专利申请公布第2010/0041134号的段落-
中，并且在该公布的图3A —3D、4A —4D、5A —5C和6A —6C中示出。用 于构建本文所述的轴突导向移植物的多细胞体通常以相同的方式来制备。 简单地说，存在用于制备本发明范围内的具有上述特征的多细胞体的各种方法。例如，多细胞体可由含有多个活细胞或具有所需细胞密度和粘度的细胞粘团制成。细胞粘团可成形为所需形状并且通过成熟(例如，孵育)形成多细胞体。在另一个实例中，细长的多细胞体通过将包括多个活细胞的细胞粘团成形为细长的形状来产生。细胞粘团在受控环境中孵育以使得细胞彼此粘附以便形成细长的多细胞体。在另一个实例中，通过将包括多个活细胞的细胞粘团在将细胞粘团保持成三维形状的装置中成形来制备多细胞体。细胞粘团在受控环境中孵育，同时将其保持成三维形状历时足以制备多细胞体的一段时间，所述多细胞体具有在平坦表面上自支承的足够粘附力，如上所述。细胞粘团可适当地通过以下步骤来提供(A)将细胞或细胞集合体(细胞或细胞集合体可包括单一细胞类型或两种或两种以上不同细胞类型)与细胞培养基(例如，以预先确定的比率)混合以便产生细胞悬液，并且(B)压实细胞混合物以便产生具有所需细胞密度和粘度的细胞粘团。压实可通过许多方法来实现，例如通过将由细胞培养物产生的特定细胞悬液浓缩以便实现细胞粘团所需的期望细胞浓度(密度)、粘度和稠度。例如，可将来自细胞培养物的相对较稀的细胞悬液离心一定时间以实现球团中允许在模型中成形的细胞浓度。正切流动过滤(“TFF”)是浓缩或压实细胞的另一种合适的方法。化合物也可与细胞悬液组合以便提供所需的挤出性质。可用于本发明中的合适化合物的一些实例包括胶原、水凝胶、基质胶、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。因此，在这些方法中使用的细胞粘团适当地通过将多个活细胞与组织培养基混合，并且压实活细胞(例如，通过尚心)来制备。如果在细胞粘团中包括一种或多种ECM组分，或一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物(如下文进一步详细讨论)，则细胞球团可适当地重悬于含有ECM组分或ECM衍生物的一种或多种生理可接受的缓冲液中。进一步加工所需的细胞粘团的细胞密度可随着细胞类型而变化。细胞之间的相互作用决定细胞粘团的性质，并且不同细胞类型具有细胞密度和细胞-细胞相互作用之间的不同关系。可对细胞进行预先处理以便在将细胞粘团成形之前增加细胞相互作用。例如，细胞可在离心之后在离心管内孵育以便在将细胞粘团成形之前增强细胞-细胞相互作用。在本发明下可使用将细胞粘团成形的各种方法。例如可对细胞粘团进行操纵、手动模塑或挤压(例如，在浓缩/压实之后)以便实现所需形状。例如，可将细胞粘团吸收(例如，抽吸)至预成型仪器，例如微量吸移管(例如，毛细吸移管)中，所述仪器将细胞粘团成形以便适形于仪器的内表面。微量吸移管(例如，毛细吸移管)的横截面形状可为圆形、正方形、长方形、三角形或其它非圆形横截面形状。细胞粘团也可通过将其沉积至预成型模型，例如塑料模型、金属模型或凝胶模型中来成形。此外，离心浇注或连续浇注可用于将细胞粘团成形。在所述方法的一个实例中，成形包括将细胞粘团保持于成形装置中以使得细胞在成形装置中部分地彼此粘附。例如，如图3A中示出，可将细胞粘团55抽吸至成形装置51(例如，毛细吸移管)中并且在成形装置中保持一段成熟期(本文中也称为培育期)(图3B)以使得细胞至少部分地彼此粘附。如果细胞能够在第一成形装置51中实现足够的粘附，则多细胞体I可在仅具有单一成熟步骤(例如，单一孵育步骤)的方法中产生。例如，所述方法适当地包括将细胞粘团55在单一成形装置51中成形和将成形的细胞粘团在单一受控环境中孵育以使得细胞彼此粘附以形成多细胞体。如果是这种情况，成形装置51 (例如，毛细吸移管)可适当地为生物打印机或可进行操作以便自动地将多细胞体设置成三维构建体的类似设备的打印头的一部分，如以下更详细描述。将ECM组分或ECM组分的衍生物，·例如明胶和/或纤维蛋白原并入细胞粘团中可有助于在单一成熟步骤中产生多细胞体，因为此类组分可促进多细胞体的总体粘附性。然而，细胞可保持于成形装置例如毛细吸移管中的时间量是受到一定的限制，所述成形装置在细胞生存力受到影响之前使得细胞仅可获得有限的氧气和/或营养素。如果细胞不能在成形装置51中保留足够长以便实现所需粘附力的成熟期，则部分粘附的细胞粘团55适当地从成形装置(例如，毛细吸移管)转移至第二成形装置301 (例如，模型)，所述第二成形装置301使得可在将细胞保留于第二成形装置中历经额外成熟期的同时将营养素和/或氧气供应给细胞。使得可向细胞供应营养素和氧气的合适成形装置301和制备所述模型的方法的一个实例在图4A-4C中示出。此成形装置是用于产生多个多细胞体(例如，基本上相同的多细胞体)的模型301。模型301包括生物相容性基底303，其由抵抗细胞迁移和向内生长至基底中和抵抗细胞粘附至基底的材料制成。模型301可由阻止细胞生长或迁移至模型中或粘附至模型的任何材料制成。例如，基底303可适当地由特氟隆 (PTFE)、不锈钢、透明质酸、琼脂糖、琼脂、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如，琼脂糖凝胶或其它水凝胶)和类似材料制成。将基底303成形为容纳包含具有相对较低粘附力的多个细胞的组合物(例如，来自第一成形装置51)并且将组合物在成熟期期间保持成所需三维形状中，在此期间细胞粘附力增加以形成相对于成熟期之前的组合物具有更大粘附力的多细胞体，例如具有如上所述多细胞体的任何特征的多细胞体。还适当地构造模型301以使得可将组织培养基供应至细胞粘团55 (例如，通过将组织培养基分配至模型顶部)。例如，如图3C和3D中示出，多个细长沟槽305形成于基底303中。模型301的细长沟槽305通常具有如美国专利申请公布第2010/0041134号的段落
中所描述相同的尺寸和特征。在本发明范围内存在制备合适模型的各种方法。例如，图4A-4C示出通常标示为201的工具的一个实施方案，其可用于制备适合于制备如上所述的多细胞体的模型。通常，工具201的一部分被构造为模型301的在第二成熟期期间保持部分粘附的细胞粘团的一部分的负版。例如，工具201适当地包括本体203和从本体伸出的多个凸出部205。每个凸出部205经过适当地设定大小和成形以形成模型基底中的将细胞粘团55保持于适当形状中的凹陷或接收区域，以使得在模型中由凸出部形成的凹陷/接收区域中的细胞从成形的细胞粘团的外表面开始没有一个超过约300微米。关于工具的此实施方案的进一步细节提供于美国专利申请公布第2010/0041134号的段落
和图5A — 5C中。为了制备模型301，将细胞培养皿221适当地以可固化或凝固成凝胶的液体223来填充，如图4A示出。例如，液体可为琼脂糖溶液223。将工具201放置于细胞培养皿221的顶部(图4B)以使得唇缘211位于细胞培养皿的边缘225并且凸出部205(例如，鳍状物)从工具201的底部207延伸至液体223中。使液体223凝固以形成围绕凸出部205 (例如，鳍状物)的远端的固体或凝胶基底。然后，将工具201从细胞培养皿中拎起以便将工具201与新制备的模型301分离(图4C)。因此，如果使用第二成形装置，部分粘附的细胞粘团55适当地从第一成形装置51 (例如，毛细吸移管)转移至第二成形装置(例如，图4C中示出的模型301)。部分粘附的细胞粘团55可通过第一成形装置51 (例如，毛细吸移管)转移至模型301的沟槽305中。因此，所述方法包括将部分粘附的细胞粘团55转移至第二成形装置301，并且将部分 粘附的细胞粘团保持于第二成形装置中以便形成多细胞体。在模型301与保持于其中的细胞粘团55在受控环境中一起孵育以使得细胞粘团中的细胞进一步彼此粘附以形成多细胞体I的成熟期之后，细胞的粘附力足够强以使得由此产生的多细胞体I可用毛细吸移管或其它仪器来捡起。毛细吸移管51 (现在含有从模型301中的沟槽305中捡起的成熟多细胞体I)可适当地为生物打印机或可进行操作以便自动地将多细胞体设置成三维构建体的类似设备的打印头的一部分，如以下更详细描述。因此，在制备多细胞体I的方法的一个实例中，成形包括将细胞粘团55保持于第一成形装置51中以使得细胞在第一成形装置中部分地彼此粘附，将部分粘附的细胞粘团转移至第二成形装置301，并且将部分粘附的细胞粘团保持于第二成形装置中以形成多细胞体I。然而，在一些实施方案中，例如在将明胶和/或纤维蛋白原添加至细胞粘团时，细胞可在第一成形装置51中充分粘附以便形成多细胞体，并且将细胞粘团55转移至第二成形装置301并将细胞粘团保持于第二成形装置中的步骤可为不必要的。第一成形装置51可适当地包括毛细吸移管并且第二成形装置可包括在将细胞保持于第二成形装置中的同时使得营养素和氧气可被供应给细胞的装置，例如以上描述的模型 301。多细胞体的横截面形状和大小与用于制备多细胞体的第一成形装置以及任选地第二成形装置的横截面形状和大小基本上相对应，并且本领域技术人员能够选择具有合适横截面形状、横截面面积、直径和长度的合适成形装置，该成形装置适于形成具有上述横截面形状、横截面面积、直径和长度的多细胞体。如以上讨论，多种细胞类型可用于形成本发明的多细胞体。因此，均为人类和动物体细胞的一种或多种类型的细胞或细胞集合体，包括例如以上列出的所有细胞类型，可用作产生细胞粘团的起始材料。例如，可使用例如施万细胞、BMSC、间充质干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的细胞。可对来自轴突导向移植物的预期接受者的自体细胞的样品(例如如上所述通过活检获得)进行培养以便产生用于制备多细胞体的足够数量的细胞。或者，可对来自非自体供体的细胞或来自一种或多种确立细胞系的细胞的样品进行培养以便产生用于制备多细胞体的足够数量的细胞。由来自预期接受者的自体细胞制成的多细胞体可有利地用于避免接受者对于移植组织的宿主炎症反应或其它急性或慢性排斥反应。如以上提及，多细胞体可为同型细胞的或异型细胞的。为了制备同型细胞多细胞体，细胞粘团适当地为同型细胞的。用于产生同型细胞多细胞体的细胞粘团中的几乎所有活细胞是单ー细胞类型的细胞(例如，骨髄干细胞)，其易于对较低水平的杂质产生某种程度的耐受性，包括对于构建体(包括由此类细胞粘团制成的同型细胞多细胞体)的成熟仅仅具有可以忽略的影响的相对较小数量的不同细胞类型的细胞。为了制备转而用于制备轴突导向移植物的同型细胞多细胞体，细胞粘团中的多个活细胞可适当地为BMSC。另ー方面，为了制备异型细胞多细胞体，细胞粘团适当地包括显著数量的ー种以上细胞类型的细胞(即，细胞粘团为异型细胞的)。例如，细胞粘团可包含第一类型的多个活细胞和第二类型的多个活细胞，第二细胞类型不同于第一细胞类型。在另ー个实例中，细胞粘团可包含第一细胞类型的多个活细胞、第二细胞类型的多个活细胞和第三细胞类型的 多个活细胞。因此，如果细胞粘团用于制备进而用于制备轴突导向移植物的异型细胞多细胞体，细胞粘团中的多个活细胞可适当地包括两种或两种以上选自施万细胞、BMSC、间充质干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的细胞类型。例如，多个活细胞可包括BMSC和施万细胞。此类异型细胞多细胞体可适当地与由BMSC组成的同型细胞多细胞体组合使用以便构建轴突导向移植物，如在下文更详细地描述。如上文更详细地描述，在使用异型细胞的细胞粘团来产生多细胞体吋，活细胞可在成熟和粘附过程期间基于细胞粘附強度的差异而“分选出”，并且可恢复其生理构造。除了多个活细胞以外，ー种或多种ECM组分或ー种或多种ECM组分的ー种或多种衍生物(例如，明胶、纤维蛋白原、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弾性蛋白和/或蛋白多糖)可适当地包含在细胞粘团中以便将这些物质并入多细胞体中，如以上提及。添加至细胞粘团的ECM组分或ECM组分的衍生物可从人类或动物来源纯化，或通过本领域中已知的重组方法产生。将ECM组分或ECM组分的衍生物添加至细胞粘团可促进多细胞体中的细胞的粘附。例如，可将明胶和/或纤维蛋白原添加至细胞粘团。更具体地说，10-30%明胶溶液和10-80mg/ml纤维蛋白原溶液可与多个活细胞混合以便形成含有明胶和纤维蛋白原的细胞悬液。然后，可将细胞悬液压实(例如，通过离心)以便形成细胞粘团。然后，由此方法形成的细胞粘团可在受控环境下成形和孵育以使得细胞彼此粘附以便形成多细胞体。纤维蛋白原可通过添加凝血酶而转化为纤维蛋白(例如，在打印エ艺期间)。当例如明胶和纤维蛋白原的ECM组分或ECM组分的衍生物包含在细胞粘团中吋，成形步骤适当地包括将细胞粘团保持在単一成形装置中以便形成多细胞体，并且孵育步骤适当地包括在単一受控环境下孵育成形的细胞粘团以使得细胞彼此粘附以便形成多细胞体。本发明还提供制备以所需三维形状形成的包含多个细胞或细胞集合体的多细胞体的方法。本发明制备方法通常包括以下步骤1)提供含有多个预先选择的细胞或细胞集合体(例如，具有所需细胞密度和粘度)的细胞粘团，2)将细胞粘团成形(例如，获得所需形状)，并且3)通过成熟来形成多细胞体。上述的形成步骤可通过ー个或多个步骤实现以便确保多细胞体(例如，细胞单元)的粘附性。在某些方法中，在初始成熟时，细胞粘团可部分地稳定化，或部分地硬化以便形成具有允许进一歩操作的足够完整性的多细胞体。根据ー个实施方案，形成步骤可包括两个分步骤:A)将细胞粘团保持在成形装置，例如微量吸移管(例如，毛细吸移管)中历经第一段时间(例如，一段预先确定的时间)以便初始成熟，和B)将成形的细胞粘团沉积于保持装置例如模型中历经第二段时间(例如，一段预先确定的时间)以便进一歩成熟，其中保持装置由能够阻止细胞生长或迁移至其中或粘附至其上的材料制成。初始成熟向细胞粘团提供了在进ー步成熟过程中的操作期间保持完整的足够稳定性。各种方法可用于促进进ー步成熟过程。在一个实施方案中，将细胞粘团可在约37°C下孵育一段时间(可取决于细胞类型)以便促进粘附。替代地或额外地，细胞粘团可在含有促进粘附的因子和/或离子的细胞培养基的存在下加以保持。例如，在圆柱形形状的细胞粘团在微量吸移管(例如，毛细吸移管)中孵育(即，初始成熟过程)直到细胞的粘附カ使得可将圆柱体在不断裂的情况下从微量吸移管中挤 出之后，然后细胞粘团可在进ー步成熟过程中与培养基一起进ー步孵育和培养，从而促进所需形状的保持。填充体本发明还提供填充体，其可与以上描述的多细胞体组合使用以便形成所需三维工程化生物组织。填充体详细地描述于美国专利申请公布第2010/0041134号的段落一
中。简单地说，本发明还提供与作为用于构建生物构建体的构件的多细胞体组合使用的填充体，其中填充体用于界定没有多细胞体的所需三维生物构建体的范围(例如，界定多细胞构建体中的无细胞通道)。填充体适当地为具有预先确定的形状的物体，其由能够阻止至少ー些类型的细胞生长或迁移至其中或粘附至其上的无细胞材料制成。在一些实施方案中，填充体由具有以下功能的材料(例如，琼脂糖)制成阻止大多数细胞类型迁移至填充体中但是可保留在成熟的轴突导向移植物的无细胞通道中的适当位置并且使得轴突可从近端神经结构生长至轴突导向移植物中并且穿过轴突导向移植物。填充体材料适当地对于营养介质(本文中也称为组织培养基或细胞培养基)为可渗透性的。例如，填充体材料适当地为选自由以下组成的组的生物相容性凝胶材料琼脂糖、透明质酸、聚こニ醇和琼脂，或其它水凝胶或非凝胶柔性生物相容性材料。用于构建特定三维生物エ程化组织的所有填充体可适当地由相同材料以及相同浓度的相同材料形成。例如，填充体可适当地由浓度为约0. 5%至约4. 5%的琼脂糖制成，更适当地可由浓度为约I. 5%至约4%的琼脂糖制成，并且更适当地可由浓度为约2%的琼脂糖制成。作为另ー个实例，填充体可适当地由不同材料或不同浓度的相同材料形成。例如，形成内腔的填充体可由4%琼脂糖制成，而用于构建所需三维生物工程化组织的其余填充体可由2%琼脂糖制成。填充体可采用与相应多细胞体的形状或大小一致的任何形状或大小，其中圆柱形形状为优选的。在一些实施方案中，填充体的形状和大小与用于构建所需三维生物工程化组织的多细胞体的形状和大小基本上一致。因此，例如，填充体可适当地具有如上关于多细胞体I所述的任何形状。例如，填充体和多细胞体可为大致圆柱形的(例如，大致杆形)并且具有具备基本上相同直径的大致圆形横截面(如图I所示)。虽然图I和2中示出的填充体I是大致圆柱形的并且具有大致圆形横截面，但是具有不同大小和形状的填充体也在本发明范围内，只要填充体和多细胞体可根据一定的方式进行布置，该方式使得在多细胞体彼此融合时可形成所需三维生物工程化组织。例如，填充体可为大致圆柱形的(例如，大致杆形)并且多细胞体可为大致球形的(如美国专利申请公布第2010/0041134号的图8和12中示出)。此外，填充体和多细胞体可同时为细长的和大致圆柱形的，但是具有不同长度。本领域技术人员将认识到存在许多可对不同大小和形状的填充体和多细胞体可加以组合以便形成所需三维生物工程化组织的方法。填充体适当地使用美国专利申请公布第2010/0041134号的段落
至
中描述的方法来制备。三维结构如上所述的多细胞体和填充体可根据本发明的方法使用以便制备三维生物工程化组织，例如轴突导向神经移植物。简单地说，多个多细胞体和多个填充体根据使得每个多 细胞体接触(i)另ー个多细胞体或(ii)填充体中的至少ー个的方式来加以布置。然后，通过成熟过程使多细胞体与至少ー个其它多细胞体融合以便形成适用于神经恢复エ序的エ程化三维生物组织移植物。然后，填充体可与融合的多细胞体分离以便获得工程化组织移植物，但是在一些实施方案中，移植物可包括ー个或多个通过植入保留在适当位置的填充体。通常标示为101的本发明的三维结构的一个实施方案在图I和2中示出。结构101包括多个细长的多细胞体I，其每ー个适当地与如上所述的细长的多细胞体I相同。例如，每个细长的多细胞体I适当地根据如上所述用于产生可在空气中打印的自支承多细胞组织体的方法来制备。多细胞体I以使得每个多细胞体接触至少ー个其它多细胞体的方式来加以布置。至少ー个多细胞体I沿着具有实质性长度的接触区域而接触另ー个多细胞体。多细胞体之间在实质性长度内的这种接触更详细地描述于美国专利申请公布第2010/0041134号的段落
中并且在所述公布的图IC中示出。例如，在图I和2的布置中，每个多细胞体I在具有实质性长度的接触区域内接触至少ー个(例如，两个)其它多细胞体。处于并排邻接的关系中的邻接的细长的多细胞体之间的接触区域适当地具有至少约I厘米的长度。接触区域的长度可与多细胞体I的长度相对应，所述多细胞体的长度适当地与所需移植物的长度大约相等。虽然在图I和2中，多细胞体I彼此接触，但是在此初始成熟阶段，多细胞体未彼此粘附。结构101还包括一个或多个填充体5，其每ー个适当地与如上所述的填充体相同。例如，图I和2中的结构包括多个离散填充体5。填充体5以一定方式与多细胞体一起布置以使得每个填充体接触至少ー个多细胞体I或另ー个填充体。图I和2中的多细胞体I和填充体5经过布置以便在结构101中形成多个空间17，所述空间17未被多细胞体占据，并且也未被填充体占据。空间17可适当地含有组织培养基，其可通过将组织培养基倾倒至多细胞体I和填充体5的顶部来添加至结构101。因此，空间17可促进将营养素和/或氧气供应至多细胞体I中的细胞(例如，在成熟期间)。所述结构中的至少ー些多细胞体I是如上所述的含有施万细胞的异型细胞体。例如，异型细胞体适当地包括施万细胞以及具有一种或多种抗炎性质的不同细胞类型的细胞，例如骨髄干细胞或间充质干细胞。含有施万细胞的异型细胞体形成标示为I"的第一组多细胞体。所述结构中的多细胞体还包括标示为I’的第二组多细胞体，其中细胞，即施万细胞的百分比小于第一组多细胞体中的细胞，即施万细胞的百分比。例如，第二组I’中的多细胞体可为同型细胞体(例如，实质上只含有BMSC)或异型细胞体(例如，包括BMSC和相对较低数量的施万细胞)。第二组I’中的至少ー些多细胞体I (例如，具有一些或没有施万细胞的多细胞体)经过布置以便形成管样结构31的外层。至少ー个填充体5和第一组I"的至少ー个多细胞体(例如，具有相对较高百分比的施万细胞的多细胞体)处于管样结构31的外层的内部并且基本上由形成管样结构的外层的多细胞体包 围。例如，图I和2中的多细胞体I’以六边形构造进行布置以便形成包围三个填充体5和三个含有施万细胞的多细胞体I"的管样结构31。六边形构造中的每个多细胞体I’处于与至少两个邻近的细长的多细胞体I并排邻接的关系中。在此布置中，管样结构31内部的一个或多个填充体5经过安放以便形成多个在结构101内延伸的无细胞通道。填充体5适当地防止细胞从多细胞体I迁移和向内生长至在管样结构31内延伸的细长的空间中，所述空间根据以下描述的方法在结构成熟之后变为无细胞通道。通常，可经由成熟来产生包括多个活细胞的工程化管状组织的多细胞体I的任何布置可被认为是管样结构，不论管样结构内部是否有填充体。根据前述显而易见的是管样结构可由于以下事实而不同于管状结构邻接的多细胞体在此成熟阶段尚未彼此粘附以致于可将物体推入形成管样结构的两个邻接的多细胞体之间的空间内。图IA示出通常称为101"的三维结构的另ー个实施方案。除所提及以外，此结构101"与如上所述并且在图I中示出的结构101相同。此结构101"在管样结构31内不包括任何填充体5。替代地，管样结构实质上以含有施万细胞的多细胞体I"填充。制备三维结构的方法存在使用如上所述的多细胞体，包括与填充体5结合的细长的多细胞体I来制备本发明范围内的如上所述的三维生物构建体的许多不同方法。例如，ー种方法通常涉及根据使得每个多细胞体接触至少ー个其它多细胞体的方式来布置多个细长的多细胞体1，然后使得至少ー个(例如，所有)多细胞体融合至至少ー个其它多细胞体以便产生所需三维生物工程化组织。可使用许多方法来以预先确定的方式递送多细胞体以便制备所需三维结构。例如，多细胞体可手动地放置以便彼此或与填充体接触，通过从吸移管、喷嘴或针中挤出而沉积于适当位置，或通过自动化机器安放以便接触。例如，使用ー种或多种工具(可适当地包括如上所述的第一成形装置51、如上所述的将多细胞体从模型301中取出的毛细吸移管，和/或不同工具)来捡起多细胞体(例如，将其从如上所述的模型301中取出)。所述工具将多细胞体运输至三维构建体正进行组装(例如图2示出)的组装区(例如，玻璃表面)并且相对于已经运输至组装区并且放置于正进行组装的构建体中的任何其它多细胞体和任何填充体将多细胞体分配或以其它方式放置在适当的位置。在将每个多细胞体I放置在其适当位置之后，适当地重复所述过程以便将另ー个多细胞体或填充体添加至构建体(例如，通过将其放置在已经放置于构建体中的多细胞体旁)。如果正进行组装的构建体包括一个或多个填充体，那么每当需要填充体时，适当地使用另ー种工具(未显示，但是可与成形装置51或毛细吸移管类似)来捡起填充体5 (或制备填充体，如上所述)，将填充体传输至组装区，并且将填充体分配或以其它方式放置在其位于正进行组装的构建体中的适当位置。用于将多细胞体传输至组装区的工具适当地由生物打印机或可进行操作以便以所需方式布置多细胞体和填充体的其它自动设备的打印头来承载。例如，一种合适生物打印机公开于美国专利申请公布第2004/0253365号中，该申请据此以引用的方式并入。Novogen的MMX生物打印机是合适生物打印机的ー个商业实施方案。组织工程领域技术人员熟悉可用于将多细胞体(和填充体(如果使用))布置成合适构建体的其它合适生物打印机和类似设备。用于将填充体传输至组装区的工具适当地为生物打印机的另ー个头部的一部分。生物打印机可具有多个头部和/或用于传输多细胞体和填充体的各种工具可依序加载至ー个或多个生物打印机头部中。虽然可能需要使用生物打印机或自动地组装构建体的类似设备，但是在本发明范围内，本文所述的方法可手动进行(例如，使用一个或多个毛细吸移管)。如图2中指示，将多细胞体I适当地放置(例如，堆叠)于ー个或多个填充体5的顶部。多细胞体I适当地相邻于其它多细胞体和/或填充体5来放置。因此，多细胞体I未被推入或埋置于任何填充体5中。这可被称为“在空气中打印”，因为多细胞体未分配至凝胶或液体中。一旦构建体的组装完成，就将组织培养基适当地倾倒至构建体顶部。组织培养基
可进入多细胞体与填充体之间的空间17以便支承多细胞体中的细胞。其它填充体(未显示)可堆叠于图2中示出的结构周围以便在将结构进行孵育和使其成熟时提供进ー步支承以便有助于将填充体和多细胞体相对于彼此保持在适当的位置中。图2A和2B示出制备与图2中的结构101基本上类似的结构的方法，不同之处在于管状构建体内部的填充体和多细胞体I"的长度比形成管样结构的多细胞体的长度稍短。这在结构的相反末端处产生凹陷区域43。额外的填充体5(图2C)堆叠于结构周围并且延伸至结构末端的凹陷43中以使得一些多细胞体与间隙或接合处相重叠，在所述间隙或接合处ー个填充体或多细胞体的末端衔接另一个填充体或多细胞体的末端。具体地说，如图2C中示出，多细胞体I"和填充体5的凹陷末端45与形成管样结构31的多细胞体I’的末端49轴向偏置。一些填充体5的末端47延伸至凹陷43中并且衔接形成凹陷的填充体和多细胞体I"的凹陷末端45。形成外部管样结构的多细胞体I’具有与衔接末端45，47重叠的足够长度。这使得三维结构更稳定。凹陷末端的填充体在构建构建体时提供支承。由此结构形成的移植物的末端使得外科医生可在不触摸移植物本身的情况下正确地放置移植物，并且还可提供将移植物连接至原生神经结构末端的边界。或者，移植物的末端可在植入之前被切断。三维构建体中的多细胞体可彼此融合以便产生生物工程化组织。“融合”是指邻近的多细胞体的细胞直接通过细胞表面蛋白质之间的相互作用，或间接地通过细胞与ECM组分或ECM组分的衍生物的相互作用而变得彼此粘附。在融合之后，将包围构建体的任何填充体适当地与工程化组织分离。在包括管样结构的构建体的情况下，例如，管外部的任何填充体可加以去除(例如，通过将其从形成管样构建体的管状结构剥离)。管状结构内部的填充体5可适当地保留在适当位置。在其它情况下，填充体5可在成熟之后和植入之前从三维构建体去除，如下文进ー步讨论。如果填充体5加以去除，这可适当地通过将其从管状结构的敞开末端拉出而完成。另外，如果填充体5在成熟之后从结构去除，填充体5可适当地由柔性材料制成(如果需要的话)以便有助于将填充体从结构拉出。另ー种选择是用可在融合之后溶解(例如，通过温度变化、光或其它刺激)的材料来制备填充体5。
本发明进一歩提供另ー种对具有3-D形状的生物构建体，例如组织(例如，轴突导向移植物)进行工程化的方法，所述方法使用多细胞体通过根据预先确定的3-D方式将多个多细胞体进一步递送至预先选择的接收环境中，使得细胞单元可融合至所需生物构建体中来进行。发生融合的两种或两种以上多细胞体可为相同或不同的形状和大小，并且可含有相同或不同的细胞类型。多细胞体可以许多方法应用于生物构建体工程化中。例如，可产生构成所需结构的上半部和下半部的两个不同形状的多细胞体，并且可使其接触并进行融合。或者，多个多细胞体可与填充体组合进行组装并且使其融合成所需形状。根据ー个实施方案，在多细胞体与填充体一起使用时，工程化方法可包括以下步骤:A)根据预先确定的方式对与多个填充体预定组合的多个多细胞体进行递送以便形成分层的构建体，其中多细胞体和填充体是邻近的，B)将分层的构建体沉积至预先选择的受控环境中以便成熟，由此使多细胞体彼此融合以便产生融合的构建体，以及C) 将填充体从融合的构建体去除以便产生所需生物构建体。用于修复受损神经的轴突导向移植物图5示出通常标示为1001的多细胞构建体(例如，轴突导向移植物)的ー个实例，其根据本发明方法来工程化。如所示出，构建体包括包含中央部分1005和周围部分1003的细长的多细胞区域。多细胞区域的每个部分1003，1005包括多个彼此粘附的活细胞以使得多细胞区域形成适用于恢复受损神经的神经功能的细长移植物1001。如下文更详细地解释，移植物1001适合于在移植物植入具有神经系统的活有机体中并且安放在切断神经的末端之间的间隙中(例如，其中神经因外伤性损伤而切断和/或由准备进行神经恢复エ序的健康护理医生来切除)中时促进再生轴突生长穿过移植物。移植物1001是广义上的管状结构。然而，在本发明的广泛范围内，移植物不必具有任何特定横截面形状并且不需要具有任何中空部分。多细胞区域包括以上结合多细胞体的描述所述的相同类型的细胞。例如，多细胞区域适当地包括选自由以下组成的组的细胞间充质干细胞、骨髄干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞和其组合。在另ー个实例中，多细胞区域的细胞包括具有ー种或多种抗炎性质的细胞，例如骨髓干细胞。在另ー个实例中，多细胞区域中的细胞包括施万细胞。在另ー个实例中，多细胞区域中的细胞包括骨髄干细胞和施万细胞的组合。当多细胞区域包括施万细胞时，施万细胞的数量适当地在多细胞区域中的细胞总数的约0. 1%(v/v)至约20%(v/v)范围内，更适当地在约1%(v/v)至约15%(v/v)范围时,并且更适当地在约3%(v/v)至约10(v/v)%范围内，并且更适当地为约5%(v/v)至约10%(v/v)。另外，在多细胞区域包括施万细胞时，多细胞区域中的其它活细胞可适当地基本上由骨髄干细胞组成。然而，应理解除以上叙述的特定实例中阐明的细胞类型组合以外的细胞类型的各种组合可存在于本发明的广泛范围内的移植物的多细胞区域中。在图5中示出的实施方案中，至少ー个无细胞通道1007在多细胞区域形成的结构的相反末端之间轴向延伸穿过移植物1001的内部。更具体地说，在图5中，多个离散的无细胞通道1007在多细胞区域形成的结构的相反末端之间延伸穿过移植物1001。无细胞通道1007的数量可在本发明的广泛范围内变化。例如，适当地有2个至7个无细胞通道，并且更适当地有3个至5个无细胞通道。在另ー个实例中，有至少三个无细胞通道。例如，图5中示出的移植物1001恰好具有三个无细胞通道1007。无细胞通道1007适当地一直延伸穿过移植物1001以使得在植入移植物时，每个通道可实质上在相対的近端和远端神经残端之间一直连续地延伸。然而，无细胞通道的长度可比本发明范围内的移植物的总长度稍短。例如，移植物的外部周围部分1003可例如通过使用图2A和2B中概述的方法而变得比中央部分1005(包括中央部分中的无细胞通道)稍微更长。如果需要的话，可将具有更长外围部分的末端移植物切断以便准备将移植物植入。如以上提及，在本发明范围内，还可在末端參差不齐时将移植物植入。无细胞通道1007适当地以并排取向布置并且通过多细胞区域的细胞而彼此分隔，如图5中示出。例如，无细胞通道10 07适当地基本上彼此平行。此外，无细胞通道1007适当地由多细胞区域的部分来彼此隔开。无细胞通道1007还适当地均匀地彼此隔开。多细胞区域的处于通道之间的部分的厚度取决于通道数量和通道直径而变化。其具有支承无细胞通道的富含施万细胞的村里的足够厚度。无细胞通道1007适当地由填充体5形成。无细胞通道1007的尺寸可适当地与如上所述的填充体的尺寸基本上相同。或者，无细胞通道1007可具有与填充体5不同的长度。例如，两个(或更多个)填充体可首尾相连放置以便产生一个比个别填充体更长的无细胞通道。在某些情况下，填充体5可在植入受损神经部位之前从移植物1001去除。如果去除填充体5，无细胞通道1007在植入移植物1001时为空的，并且形成中空的轴突导向物，其引导轴突从近端神经残余部分生长穿过移植物到达远端神经残余部分。在其它情况下，一个或多个填充体5可保持于三维构建体/移植物1001中并且与移植物的其余部分一起植入受损神经部位。例如，已经发现在填充体5由琼脂糖制成并且保持于用于植入的轴突导向成熟移植物的无细胞通道中的适当位置时，来自近端神经结构的轴突生长进入轴突导向移植物并且穿过轴突导向移植物。在这种情况下，填充体5还向移植物1001提供额外的机械完整性，并且在植入之前或之后对移植物进行压实的情况下有助于防止无细胞通道1007塌陷。施万细胞适当地填充移植物1001的无细胞通道1007和多细胞区域之间的界面的至少一部分。具体地说，至少ー些施万细胞适当地形成无细胞通道1007的富含施万细胞的村里，其用于支持轴突向内生长。如5中示出，移植物具有具备较高百分比的施万细胞的中央部分1005和围绕中央部分并且具有较低百分比的施万细胞的周围部分1003。虽然周围部分1003和中央部分1005之间的界限在图5的示意图中示出为明显的界限，但是应认识到移植物的多细胞部分在实践中并非如此明显，而是存在从富含施万细胞的中央部分到具有相对较少或没有施万细胞的周围部分的逐渐过渡。移植物1001的富含施万细胞的中央部分1005通常与含有较高百分比的施万细胞的多细胞填充体I"形成的区域对应。移植物1001的中央部分1005中的施万细胞的总体百分比与如上所述的含有施万细胞的多细胞体I"中的施万细胞的百分比大约相等。在由多细胞体I’，I"和填充体5形成的三维构建体101的成熟期间，一些施万细胞以与差异粘附假说对于自动分选细胞类型的解释一致的方式自动分选至无细胞通道1007的村里中。施万细胞优选地朝向无细胞通道1007的村里移动，虽然在本发明范围内，来自多细胞体I’，I "的其它类型的细胞也可存在于衬里内。认为无细胞通道1007的富含施万细胞的村里有助于轴突向内生长至移植物1001的无细胞通道中。施万细胞己知在神经发育和再生中起作用。不受任何特定理论的束缚，认为由施万细胞和/或受损神经中的横断轴突释放的神经营养因子可促进来自近端原生神经的轴突生长穿过轴突导向移植物并且进入神经的远端。因为施万细胞沿着无细胞通道1007的表面安置，所以其经过安放以便可在轴突生长至移植物中时接触轴突和/或琼脂糖填充体。因此，施万细胞释放的信号转导分子可促进轴突生长穿过移植物。根据前述应认识到移植物1001适当地为工程化组织，其通过使如上所述将多细胞体和填充体以预定方式布置而制备的组织构建体101在恒温箱中成熟来制成。由于使用如上所述的方法，多细胞区域形成的三维结构适当地为不受神经支配的。此外，三维结构适当地包括来自多细胞体的ー些残留组织培养基。相比之下，许多用于神经修复的现有技术移植物(包括自体移植物和同种异体移植物)是受神经支配的。此外，现有技术自体移植物和同种异体移植物不包括任何组织培养基。在一些实施方案中，轴突导向移植物不包括任何由填充体形成的无细胞通道。据信，即使在没有本文所述的无细胞通道的情况下来自近端原生神经的轴突也可以生长进入并且穿过轴突导向移植物。以下更详细描述的图11显示，将在植入时包括由填充体占据的无细胞通道的轴突导向移植物植入三周之后，轴突(參考数字1017标示的小黒点)存在于 移植物中的处于无细胞通道1007部分外部的许多部位，所述无细胞通道在植入三周结束时仍存在于移植物中。这暗示轴突能够在不生长穿过填充体或生长穿过无细胞通道的情况下从近端生长穿过如上所述的富含施万细胞的中央部分1005到达远端。因此，缺乏本文所述的无细胞通道的轴突导向移植物也可支持轴突从近端原生神经生长进入并穿过移植物并且进入原生神经结构的远端。使用轴突导向移植物来修复受损神经在成熟之后，可将轴突导向移植物植入具有神经损伤的活有机体(例如，人类或其它动物)中。轴突导向移植物可安放在切断神经的末端之间的间隙中。以此方式安放轴突导向移植物促进再生轴突生长穿过轴突导向移植物的无细胞通道并且导致神经功能的恢复。更具体地说，来自切断原生神经的近端的轴突生长穿过轴突导向移植物的无细胞通道并且进入神经结构的远端。在植入之前，将围绕轴突导向移植物1001的生物相容性凝胶材料(例如，琼脂糖)去除，留下例如图5中示出的结构。如果无细胞通道1007中的生物相容性凝胶材料是使得轴突可从近端神经结构生长进入和穿过轴突导向移植物的材料，那么可将其保留在适当位置以便植入。例如，如果使用琼脂糖填充体5来形成无细胞通道1007，那么琼脂糖填充体不需要在植入之前从无细胞通道去除，因为己知即使在将琼脂糖填充体保留在无细胞通道以便进行植入的情况下，轴突也会生长进入并且穿过移植物。将填充体5保留在无细胞通道1007中可有利地将额外的结构整体性赋予移植物。例如，即使在植入之前或之后对移植物进行压缩，填充体也可保持无细胞通道敞开。作为另ー个实例，无细胞通道1007中的填充体5可在植入轴突导向移植物1001之前去除。去除无细胞通道1007中的填充体5将是合适的，例如，在填充体由不支持轴突生长的材料组成吋。如果无细胞通道1007中的填充体5在植入之前加以去除，那么无细胞通道在植入时是中空的，并且随着时间的推移在轴突生长进入移植物中时由轴突填充。本发明的轴突导向移植物可用于修复周围神经系统中的任何神经，所述神经直接由于损伤或由于神经切除手术而导致被切断。轴突导向移植物可使用以上阐明的方法构建为适合于修复切断神经中的间隙的长度，所述间隙的长度在至少约Icm至约7cm的范围内。轴突导向移植物适当地构建为具有至少与待修复的切断神经的末端之间的间隙一样长的长度。因此，例如，如果切断神经中的间隙的长度为约3cm，那么轴突导向移植物适当地也制备为具有至少约3cm的长度。太长的移植物比太短的移植物要好得多，因为在外科医生将神经暴露时，太长的移植物可以很容易地切割成适当长度。因此，将移植物适当地构建以使得其可在植入完成之前的任何时间切割成较短节段。轴突导向移植物尤其适合于修复切断神经中的长度过长导致不可能发生神经的自发再生的间隙。自发再生通常只在切断神经的间隙小于约3cm长度的情况下发生，并且甚至在切断神经的间隙为2cm长度的情况下并不总是一定会发生。因此，轴突导向移植物尤其适合于修复切断神经中的至少约2cm的间隙。因此，轴突导向移植物适合于修复切断神经中的具有约Icm至约7cm范围内的长度的间隙，更适合于修复切断神经中的具有约2cm至约6cm范围内的长度的间隙，并且更适合于修复切断神经中的具有约3cm至约5cm范围内的长度的间隙。此外，应认识到通过使用本发明技术来制备轴突导向移植物，移植物的横截面架构可经过构建以便匹配待修复的神经的横截面架构。具体地说，轴突导向移植物的直径可例如通过改变多细胞体和/或填充体的直径，或通过改变用于构建轴突导向移植物的多细 胞体和或填充体的数量来变化。另外，可使用ー个以上轴突导向移植物以便修复较大直径神经的损伤。此外，轴突导向移植物中的无细胞通道的数量可使用在上文中描述的技术来改变以便产生具有适合于需要修复的受损神经束的架构的轴突导向移植物。轴突导向移植物可单独或在支承套筒(例如，胶原导管或尸体脱细胞神经)内部来植入切断神经部位。本领域技术人员能够选择合适的支承套筒。通常，在本领域中通过其它技术(例如，使用自体移植物)用于修复受损神经的胶原导管也适合于用作与本文所述的本发明轴突导向移植物相关的支承套筒。例如，可使用Integra Life Sciences出售的NEUR0GEN胶原导管。待插入轴突导向移植物的切断神经部位可使用本领域中已知的标准手术技术来暴露。当単独(例如，没有胶原导管)植入轴突导向移植物时，将轴突导向移植物适当地浮置至手术区域上并且作为插入移植物在每个末端用手术粘附剂(例如，纤维蛋白胶)或缝线来加以固定。当轴突导向移植物与例如胶原导管的支承套筒一起植入时，将胶原导管或其它套筒适当地切割以使得其长度约匹配待植入的轴突导向移植物的长度。还将胶原导管沿着其纵轴加以切割。然后将轴突导向移植物适当地浮置至手术区域上并且进入纵向切割的导管，并且将导管中的纵向切口重新密封。或者，可将轴突导向移植物放置在纵向切割的导管内部，然后转移至手术区域。然后可将原生神经结构的游离末端适当地装入导管中并且用手术粘附剂或手术缝合材料(例如，9-0尼龙)加以固定。一旦将轴突导向移植物固定至切断神经结构的两个末端，手术区域可使用本领域技术人员己知的标准手术技术来加以闭合。
实施例实施例I :制备多细胞体。小鼠骨髓干细胞。小鼠骨髓干细胞(BMSC)在Eisenberg等，Bone Marrowしells Transdifierentiate to しardiomyocytes Wnen Introduced into the EmbryonicHeart, Stem Cells24:1236 — 45 (2006)使用的相同条件下分离，所述文献以引用的方式整体并入本文。简单地说，将完整骨髓从8 — 12周龄野生型ICR小鼠的股骨分离。将骨骼用伊斯科夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco's medium ；IMDM)冲洗之后，将骨髓重复穿过20号针并且通过40 y m尼龙套筒过滤。将所得细胞悬液清洗并且在具有MDM/20%胎牛血清(FBS)的细菌级陪替氏培养皿(Petri dish)中放置四周，并且每周提供新鲜的培养基。分离之后，将小鼠BMSC在补充有12%供体马血清、12%小牛血清、ImM氢化可的松(hydrocortisone)和I. OX IO5单位/升青霉素和链霉素(BMSC培养基)的頂DM中培养。将细胞在IOcm陪替氏培养皿中生长并且在37°C，5%C02下孵育。需要十二个汇合陪替氏培养皿来制备ー个具有约2. 5mm外径和3. 5cm长度的轴突导向移植物。施万细胞。施万细胞(CRL-2765)购自ATCC。培养基组合物是补充有10%FBS和
I.OX IO5単位/升青霉素和链霉素(施万细胞培养基)的杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium ；DMEM)高葡萄糖。
制备琼脂糖模型制备2%琼脂糖溶液。将两克超纯低融点(LMP)琼脂糖溶解于IOOml超纯水/缓冲溶液(I: I, v/v)中。缓冲溶液可为PBS(杜尔贝科氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水Ix)或HBSS (汉克斯氏(Hanks’)平衡盐溶液Ix)。将琼脂糖溶液放置含有温水(80°C )的烧杯中并且保留在热板上直到琼脂糖完全溶解为止。只要温度在36°C以上，琼脂糖溶液就保持液态。在此温度以下，发生相转变，粘度増加，并且最后琼脂糖形成凝胶。制备琼脂糖模型。使用适合于细胞培养皿221 (10cm直径)的特氟隆打印(S卩，特氟隆工具201)(图4A — C)来形成琼脂糖模型。将组装体(特氟隆工具+陪替氏培养皿)保持垂直并且将约40ml预温的琼脂糖通过特氟隆工具中的孔倾倒至陪替氏培养皿中。去除所有空气气泡之后，将组装体在4°C下放置至少I小吋。琼脂糖完全凝胶化之后，将特氟隆工具201去除并且在琼脂糖中可见沟槽(參见图4C中的沟槽305)。然后将IOml培养基添加至模型。制备多细胞体。BMSC多细胞体。将培养基从BMSC的汇合陪替氏培养皿去除并且将细胞以IOmlPBS清洗。将I. 5ml的0. 1%胰蛋白酶均匀地散布在细胞上以便使细胞与表面分离。当细胞开始从培养皿分离时，将BMSC培养基中的5ml的2mM CaCl2溶液添加至培养皿。将所得细胞悬液在900g下离心5分钟。去除培养基(即，去除上清液)之后，将细胞球団重悬于含有2mMCaCl2的200 u I BMSC培养基中并且用吸移管上下泵送(即，有力地吸取)若干次以便使细胞集群破裂并且获得基本上均匀的细胞悬液。为了制备大致杆形的BMSC多细胞体，将细胞悬液转移至放置在15ml离心管内部的2ml Eppendorf管中。高密度球团通过在1300g下离心2分钟来形成。将培养基(S卩，上清液)去除并且将球团(即，细胞粘团)通过抽吸转移至插入安装在Iml Eppendorf移液器上的Iml尖端中的毛细管(外径(OD)=Imm ;内径(ID)=O. 5或0. 3mm)中。将含有细胞粘团的毛细管在含有2mM CaCl2的培养基中在37°C，5%C02下孵育15分钟。将所得成形细胞粘团55以大致杆形体形式从具有柱塞的毛细管51挤出至填充有培养基的琼脂糖模型301的沟槽305中，如图3C中所示。将模型301放置在恒温箱中过夜。第二天，将大致杆形的成熟BMSC多细胞体I手动抽吸(S卩，反吸)至毛细管51'中并且放置在培养基中直到进ー步使用，如图3D中所示。
(B)混合BMSC和施万细胞的多细胞体。将培养基从施万细胞的汇合陪替氏培养皿去除并且将细胞以IOml PBS清洗。将I. 5ml的0. 1%胰蛋白酶均匀地散布在细胞上以便使细胞与表面分离。当细胞开始从培养皿分离时，将5ml施万细胞培养基添加至培养皿。所得细胞悬液在900g下离心5分钟。将BMSC从汇合陪替氏培养皿分离，重悬于BMSC培养基中的5ml的2mM CaCl2溶液中，并且在900g下离心5分钟，如上所述。为了形成包含BMSC和施万细胞的大致杆形的多细胞体，估算细胞球団的体积。含有约90%BMSC和约10%施万细胞(v/v)的细胞悬液在200 u I的BMSC培养基中制备并且在1300g下离心2分钟以便形成高密度细胞球団。根据如上所述的エ序，含有BMSC和施万细胞两者的多细胞体由此高密度球团来制备。实例2 :制备具有三个无细胞通道的生物工程轴突导向移植物。将2%琼脂糖的十毫升预温溶液沉积在IOcm陪替氏培养皿中并且均匀地散布以便形成均匀的层。将陪替氏培养皿在4°C下放置以便引起琼脂糖胶凝。将毛细管用2%琼脂糖溶液填充并且冷却(使用冷的吹入空气或冷的PBS溶液)以便形成大致杆形的填充体。·在双筒显微镜下，使用活塞或导线将填充体5从毛细管51，51’挤出，并且将5cm长琼脂糖杆(即，填充体)笔直地安放陪替氏培养皿内部的琼脂糖层上。參照图I和2，将第二填充体5与第一填充体并置(例如，相邻放置)等直到沉积10个填充体以便形成结构的第一层。将存在于结构的第二层中的六个填充体5如图I和2中所示来沉积。将三个BMSC多细胞体I’沉积于结构的第二层的第四、第五和第六位置以便形成轴突导向移植物的底层。如图I和2所示，结构的第三层通过将五个填充体5沉积在第一、第二、第四、第七和第八位置，两个BMSC多细胞体I’沉积在第三和第六位置，并且混合BMSC/施万细胞多细胞体I"沉积在第五位置来形成。在结构的第四层中，将三个填充体5沉积在第一、第五和第七位置，将两个BMSC多细胞体I’沉积在第二和第六位置，并且将两个混合BMSC/施万细胞多细胞体沉积在第三和第四位置I"。结构的第五层由三个填充体5(第一、第三和第六位置)、两个BMSC多细胞体I’ (在第二和第五位置)和ー个混合BMSC/施万细胞多细胞体I"(在第四位置)组成。为了形成结构的第六层，将两个琼脂糖填充体5沉积在第一和第五位置，并且将三个BMSC多细胞I’体沉积在第二、第三和第四位置以便形成轴突导向移植物的顶层。第七层由四个琼脂糖填充体5组成。在整个沉积过程中，将少量组织培养基(每次约IOiU)添加至构建体的侧面以便避免材料(即，琼脂糖和多细胞体)脱水。以与用于构建如上所述并且在图I中示出的结构的填充体和多细胞体垂直的取向，将琼脂糖填充体放置在构建体的顶部，并且将0. 5至Iml的液体琼脂糖倾倒至结构周围以便维持构建体的完整性。在凝胶化之后，添加组织培养基直到整个构建体完全淹没。将构建体放置在恒温箱历经10至14天成熟期，并且每隔一天更换组织培养基。14天之后，去除包围轴突导向移植物的琼脂糖并且移植物足够强固以便维持縫合和植入。图6是在14天成熟期之后使用以上エ序在IOcm细胞培养皿221中制备的轴突导向移植物的照片。实施例3 :施万细胞在生物工程轴突导向移植物中的定位。为了观测成熟轴突导向移植物中的细胞布置，将施万细胞用荧光膜染料，DiIC18 (5)-DS亲脂性羰花青示踪剂来染色。使用以上概述的エ序将这些荧光标记的施万细胞用于产生混合BMSC/施万细胞多细胞体，并且根据以上概述的エ序将所得混合BMSC/荧光标记的施万细胞多细胞体用于制备轴突导向移植物。在十天成熟期之后，将轴突导向移植物从琼脂糖去除。将横切片从成熟的轴突导向移植物切除并且使用荧光立体显微镜观察以便观测施万细胞的荧光染色和定位。如图7中可见，施万细胞(结构中的较明亮区域表示)在生物工程轴突导向移植物的中央部分1005处的浓度较高并且在周围的浓度较低。因此，应认识到形成中央部分的细胞包括的施万细胞的百分比比形成移植物的周围部分的细胞的百分比高。结构中的三个无细胞通道1007在影像中以较暗斑点形式出现。以绿色显示施万细胞的此照片的彩色版本出现在美国临时申请第61/337，307号的图2(a)中，该临时申请以引用的方式整体并入本文并且本申请要求其的优先权。在将出现在所述临时申请和Hubbard等的參考文献中的彩色照片转化为以本文中图7形式呈现的黒白照片的过程中，首先，整个影像的颜色饱和度増加，然后整个影像的亮度增加，影像转化为灰度，然后整个影像的对比度増加。此过程将移植物的绿色荧光部分加亮并且导致移植物的富含施万细胞的部分显得更亮，而移植物的其它部分在增强灰度照片中为较暗的灰色。
施万细胞在轴突导向移植物的中央部分处的浓度较高并且在周围的浓度较低的此布置方式在图5中示意性地示出。在图5中，与具有较高浓度施万细胞并且含有无细胞通道1007的中央部分1005相比，外部周围部分1003具有较低浓度的施万细胞。实施例4 :在大鼠中植入轴突导向移植物ーエ序I通过轴突导向移植物实现的轴突再生已经在啮齿动物坐骨神经损伤模型中得到研究。将重约400克的雌性斯普拉-道来氏大鼠(Sprague Dawley rat)用氯胺酮(87mg/kg)和甲苯噻嗪(13mg/kg)的混合溶液经由腹膜内(IP)途径来麻酔。所述エ序在无菌制备和披盖条件下进行并且在エ序期间和恢复后使用加温垫。在术前和术后将大鼠保持于单ー笼中直到完全恢复胸骨状态为止。在镇静之后，将大鼠的左侧大腿剃光井且将大鼠后肢进行预备并且用无菌物披盖。用手木刀沿着中间侧大腿切开皮肤并且将皮瓣抬高以便暴露肌肉筋膜。将此肌肉筋膜切割并且将大腿肌肉组织之间的间隙纵向切分，以便清晰地暴露坐骨神经的分支点处以及其远端的直线趋向。将一段Icm的接近其分叉点的神经分离并且将Icm神经节段切除。将生物工程轴突导向移植物浮置至区域上并且作为插入神经移植物在每个末端用纤维蛋白胶加以固定，并且容留时间以便形成密封件。将伤ロ轻轻地冲洗并且在整个エ序中以轻微压カ实现止血。将肌肉和皮肤以4-0吸收性缝线来闭合。使大鼠在隔离笼中在加温垫上恢复至胸骨状态。图8是使用此エ序植入轴突导向移植物之后的大鼠中的手术区域的照片。轴突导向移植物1001在手术区域1009中可见。实施例5 :在大鼠中植入轴突导向移植物ーエ序2将重约400克的雌性斯普拉-道来氏大鼠用氯胺酮(87mg/kg)和甲苯噻嗪(13mg/kg)的混合溶液经由IP途径来麻酔。所述エ序在无菌制备和披盖条件下进行并且在エ序期间和恢复后使用加温垫。在术前和术后将大鼠保持于单ー笼中直到完全恢复胸骨状态为止。在镇静之后，将大鼠的左侧大腿剃光井且将大鼠后肢进行预备并且用无菌物披盖。用手木刀沿着中间侧大腿切开皮肤并且将皮瓣抬高以便暴露肌肉筋膜。将此肌肉筋膜切割并且将大腿肌肉组织之间的间隙纵向切分，以便清晰地暴露坐骨神经的分支点处以及其远端的直线趋向。将一段Icm的接近其分叉点的神经分离并且将Icm神经节段切除。将生物エ程轴突导向移植物浮置至经过切割以便适合于I厘米伤ロ(即，约12至14毫米长度)的纵向切割商购胶原神经导向装置(即，“胶原管”或“胶原导管”)，其用作工程化移植物的支承套筒。将原生坐骨神经的游离末端装入胶原支承套筒中并且用9-0尼龙加以固定。然后将伤ロ冲洗并且以轻微压カ实现止血。将肌肉和皮肤以4-0吸收性缝线来闭合。使大鼠在隔离笼中在加温垫上恢复至胸骨状态。图9是使用此エ序将轴突导向移植物植入胶原导管1011内部之后的大鼠中的手术区域1009的照片。原生神经结构的近端1013和远端1015部分也是可见的。实施例6 :植入之后三周对于轴突导向移植物进行的肉眼可见的形态和组织学评估。在植入后三周，将大鼠以如上所述相同的方式麻醉并且使植入部位暴露。将包含生物工程轴突导向移植物和原生神经轴突导向移植物近端和远端的部分的神经节段从大鼠收获并且拍照以便观察形态。图10是在植入之后三周使用如上所述的エ序2收获的含有轴突导向移植物的神经节段的照片。图10中的箭头指示获取横切片以便进行组织学评 估的位置。切片AA在近端原生神经处切割 ，切片BB在近端原生神经与轴突导向移植物的接合处 ，切片CC在轴突导向移植物的中心处；切片DD在远端轴突导向移植物与原生远端神经的接合处；并且切片EE在原生远端神经处。存在于远端原生神经(即，切片EE)中的任何轴突已经通过轴突导向移植物再生。图11显示与图10中的箭头指示的切片近似相对应的位置获取的横切片在4x和IOx放大率下的组织学影像。对于组织化学，将收获的神经节段在4%多聚甲醛中固定过夜。用こ醇系列脱水之后，将组织处理以便石蜡浸润和包埋。将4pm横切片在图10中指示的位置处切除并且进行Bielschowsky染色以便检测轴突。在图11中，轴突1017以小黑色斑点形式出现在较高放大率(即，IOx)切片中。另夕卜，胶原支承套筒1011的一部分在一些较低放大率(即，4x)影像中可见。切片中的白色区域是无细胞通道1007的剰余部分。连续切片的这些组织学影像表明轴突从近端原生神经，穿过轴突导向移植物，并且进入远端原生神经的再生。图12显示在将用作支承套筒的胶原导管内部的生物工程轴突导向移植物植入三周之后，从近端原生神经和从远端原生神经获取的横切片在40x放大率下获取的组织学影像。图12中的比例尺1019为lOOym长。轴突1017以小黑色斑点形式出现，并且影像表明在植入三周之后，约40%的存在于近端残余部分中的轴突穿越生物工程轴突导向移植物并且到达原生神经的远端残余部分，如在高倍放大影像上手动计数所获得。实施例7 :植入后十二周轴突导向移植物的总体形态根据如上所述的エ序对于雌性SpragueDawley大鼠的坐骨神经进行IOmm切除。通过用空的或以使用如上所述的方法制备的生物工程轴突导向移植物填充的胶原导管/套筒对间隙进行修复来进行比较研究。十二周之后，将胶原导管(意指在植入时是空的胶原导管和用作生物工程移植物的套筒的胶原导管)与近端和远端神经残余部分一起收获，并且拍照以便观察形态。图13显示将単独胶原导管(图(a))或将用生物工程轴突导向移植物填充的胶原导管(图(b))植入12周之后收获的导管和近端和远端神经残余部分的比较。近端原生神经结构1013在收获节段的极左末端是可见的。远端神经结构1015主要地由组织包围，但是在收获节段的极右末端是可见的。在图(b)中，胶原导管的一部分已经去除以便暴露平滑和界限分明的修复1021。胶原导管中的切ロ的边界由虚线1023指示。胶原导管1025的其余部分在虚线右側。照片指示在植入12周之后，神经的近端和远端残余部分之间的连续性已经使用任一种修复方法来重建。然而，含有轴突导向移植物的胶原导管产生更平滑并且界限更分明(即不变直径)的连接。另外，植入轴突导向移植物的胶原导管几乎完全是完整的；另一方面，在植入单独胶原导管时，其几乎完全被再吸收。在图13的图(a)中，胶原导管的唯一的剰余部分由实线1027环绕。不受任何特定理论的束缚，这被认为是由于胶原导管与轴突导向移植物一起植入其中的动物中的炎症反应减少而引起的，因为BMSC具有抗炎性质。实施例8 :修复切断的人神经的方法辨识神经需要修复的人患者。任选地对于患者进行神经切除手木。具有与待修复的神经的近端残余部分与远端残余部分之间的距离近似相等的长度的轴突导向移植物根据以上概述的エ序来制备。
将人患者麻酔。将切断神经暴露并且使用本领域中已知的标准手术技术进行观測。将轴突导向移植物放置神经的近端与远端残余部分之间，并且神经的近端和远端残余部分通过缝线或手术粘附剂来固定至移植物。然后将伤ロ冲洗并且以轻微压カ实现止血。肌肉和皮肤使用本领域中已知的标准手术技术来闭合。实施例9 :修复切断的人神经的方法辨识神经需要修复的人患者。任选地对于患者进行神经切除手木。具有与待修复的神经的近端残余部分与远端残余部分之间的距离近似相等的长度的轴突导向移植物根据以上概述的エ序来制备。将人患者麻酔。将待修复的神经暴露并且使用本领域中已知的标准手术技术进行观测。将轴突导向移植物浮置至经过切割以便适合于神经的近端残余部分与神经的远端残余部分之间的空间的纵向切割胶原支承套筒中。胶原支承套筒和/或移植物的多余末端如果存在的话可加以去除。将神经的近端和远端末端装入胶原支承套筒中并且用缝线或手术粘附剂加以固定。然后将伤ロ冲洗并且以轻微压カ实现止血。肌肉和皮肤使用本领域中已知的标准手术技术来闭合。虽然已结合其具体实施方案对本发明予以描述，但是应理解本发明的方法能够进行进ー步改进。本申请_在涵盖大体上符合本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范畴但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述过的以及如以下所附权利要求范围示出的必要特征中的任何变型、用途或者变更。当介绍本文中的多细胞构建体、三维结构、轴突导向移植物和多细胞体的要素时，冠词“一”和“所述”意在表示存在一个或多个所述要素。术语“包含”、“包括”和“具有”及其变型_在表示包括在内的，并且意指可存在除所列要素以外的其它要素。因为可在上文中在不背离本发明范围的情况下做出各种改变，所以以上说明书中所包含并的且在附图中示出的所有内容均应理解为是说明性的并且不具有限制意义。
权利要求
1.一种多细胞构建体，其包含 多细胞区域，其包含多个彼此粘附的活细胞以形成细长移植物，以便恢复切断神经的末端之间的神经连接；以及 多个无细胞通道，其透过所述移植物内部轴向延伸。
2.如权利要求I所述的多细胞构建体，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
3.如权利要求I所述的多细胞构建体，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
4.如权利要求I所述的多细胞构建体，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组合。
5.如权利要求I至4中任一项所述的多细胞构建体，其中所述活细胞包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
6.如权利要求5所述的多细胞构建体，其中所述活细胞包括骨髓干细胞。
7.如权利要求6所述的多细胞构建体，其中所述活细胞包括施万细胞。
8.如权利要求I至7中任一项所述的多细胞构建体，其中所述多细胞区域中的活细胞总数的约O. 1%至约20%是施万细胞。
9.如权利要求8所述的多细胞构建体，其中所述多细胞区域中的活细胞总数的约1%至约15%是施万细胞。
10.如权利要求9所述的多细胞构建体，其中所述多细胞区域中的活细胞总数的1%至约10%是施万细胞。
11.如权利要求10所述的多细胞构建体，其中所述多细胞区域中的活细胞总数的约3%至约10%是施万细胞。
12.如权利要求11所述的多细胞构建体，其中所述多细胞区域中的活细胞总数的约5%至约10%是施万细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多细胞构建体，其中所述施万细胞的至少一些填充所述无细胞通道与所述多细胞区域之间的界面的至少部分。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多细胞构建体，其中所述移植物具有中央部分和围绕所述中央部分的周围部分，所述中央部分中的细胞，即施万细胞的百分比高于所述周围部分中的细胞，即施万细胞的百分比。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多细胞构建体，其中所述无细胞通道中的所述一种或多种无细胞材料包含琼脂糖。
16.如权利要求1-15中任一项所述的多细胞构建体，其中无细胞通道的数量的范围为2至5。
17.如权利要求1-16中任一项所述的多细胞构建体,其中所述活细胞包括具有抗炎性质的细胞。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多细胞构建体，其中所述移植物是管状的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的多细胞构建体，其中所述移植物是工程化组织。
20.如权利要求1-19中任一项所述的多细胞构建体，其中所述移植物是不受神经支配的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的多细胞构建体，其中所述移植物包含组织培养基。
22.—种细长三维结构，其包含 多个工程化多细胞体，每个多细胞体包含多个彼此粘附的活细胞；以及 多个离散填充体，每个填充体包含抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料， 其中所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
23.—种细长三维结构，其包含 多个不受神经支配的多细胞体，每个多细胞体包含多个彼此粘附的活细胞；以及 多个离散填充体，每个填充体包含抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料， 其中所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
24.一种细长三维结构，其包含 多个多细胞体，每个多细胞体包含组织培养基和多个彼此粘附的活细胞；以及 多个离散填充体，每个填充体包含抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料， 其中所述多细胞体以使得每个多细胞体接触至少一个其它多细胞体的方式来布置，并且所述填充体经过安放和布置以便形成多个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
25.如权利要求22-24中任一项所述的细长三维结构，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
26.如权利要求22-24中任一项所述的细长三维结构，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
27.如权利要求22-24中任一项所述的细长三维结构，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组合。
28.如权利要求22-27中任一项所述的细长三维结构，其中所述无细胞通道具有彼此并排的取向并且通过所述多细胞体彼此隔开。
29.如权利要求22-28中任一项所述的细长三维结构，其中存在至少三个在所述结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
30.如权利要求22-29中任一项所述的细长三维结构，其中所述多个活细胞包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
31.如权利要求22-30中任一项所述的细长三维结构，其中所述多个活细胞包括施万细胞。
32.如权利要求22-31中任一项所述的细长三维结构，其中所述多个活细胞包括骨髓干细胞。
33.如权利要求22-32中任一项所述的细长三维结构，其中所述多细胞体包含具有相对较高百分比的施万细胞的第一类型的多细胞体以及具有相对较低百分比的施万细胞的第二类型的多细胞体。
34.如权利要求33所述的细长三维结构，其中所述第二类型的多细胞体经过布置以便围绕所述第一类型的多细胞体和所述填充体。
35.如权利要求33或34中任一项所述的细长三维结构，其中所述第一类型的多细胞体与所述填充体相邻安放。
36.如权利要求33-35中任一项所述的细长三维结构，其中所述第二类型的多细胞体包含骨髓干细胞。
37.如权利要求36所述的细长三维结构，其中所述第一类型的多细胞体包含骨髓干细胞，并且其中所述第二类型的多细胞体中的骨髓干细胞的百分比高于所述第一类型的多细胞体中的骨髓干细胞的百分比。
38.如权利要求22-37中任一项所述的细长三维结构，其中所述多细胞体的至少一些是大致杆形的。
39.如权利要求22-38中任一项所述的细长三维结构，其中所述填充体的至少一些是大致杆形的。
40.如权利要求22-37中任一项所述的细长三维结构，其中所述多细胞体的至少一些是大致球形的。
41.如权利要求22-37和40中任一项所述的细长三维结构，其中所述填充体的至少一些是大致球形的。
42.如权利要求22-41中任一项所述的细长三维结构，其中所述填充体的所述生物相容性材料抵抗所述多细胞体中的细胞粘附在所述填充体上。
43.如权利要求22-42中任一项所述的细长三维结构，其中所述填充体的至少一个包含琼脂糖并且至少一个多细胞体中的活细胞包括施万细胞，所述至少一个多细胞体与所述至少一个填充体接触，以使得存在与含有琼脂糖的填充体相邻的施万细胞。
44.一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能，所述移植物包含 细长三维结构，其包含多个活细胞；以及 多个离散的无细胞通道，其在所述细长三维结构的相反末端之间延伸。
45.如权利要求44所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
46.如权利要求44所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
47.如权利要求44所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组合。
48.如权利要求44-47中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
49.如权利要求44-48中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述三维结构是不受神经支配的。
50.如权利要求44-49中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构是工程化组织。
51.如权利要求44-50中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构包含组织培养基。
52.如权利要求44-51中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括施万细胞。
53.如权利要求44-52中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述施万细胞的至少一些沿着所述无细胞通道的表面安置。
54.如权利要求44-53中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括具有抗炎性质的细胞。
55.如权利要求44-54中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括骨髓干细胞。
56.如权利要求44-55中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道具有彼此并排的取向并且通过所述细长三维结构中的所述活细胞的一些彼此隔开。
57.如权利要求44-56中任一项所述的轴突导向移植物，其中存在至少三个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
58.如权利要求44-57中任一项所述的轴突导向移植物，其进一步包含在所述无细胞通道的至少一个中的琼脂糖填充体。
59.如权利要求44-58中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述活细胞包括施万细胞并且所述施万细胞的至少一些接触所述琼脂糖填充体。
60.一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能，所述轴突导向移植物包含 由多个活细胞组成的细长三维结构，所述活细胞包括施万细胞，其中所述细长三维结构是工程化组织，不是自体移植物，是不受神经支配的，或包含组织培养基。所述细长三维结构是工程化组织，不是自体移植物，是不受神经支配的，或包含组织培养基。
61.如权利要求60所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构不是自体移植物。
62.如权利要求60或61所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞进一步包括具有至少一种抗炎性质的细胞。
63.如权利要求62所述的轴突导向移植物，其中所述具有至少一种抗炎性质的细胞包括骨髓干细胞。
64.如权利要求61-63中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞进一步包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
65.如权利要求61-64中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构是不受神经支配的。
66.如权利要求61-65中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构是工程化组织。
67.如权利要求60-66中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构包含组织培养基。
68.如权利要求61-67中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述三维结构包括外侧部分和中央部分，所述中央部分在所述外侧部分的相反末端之间轴向延伸，以使得所述外侧部分围绕所述中央部分，所述中央部分的活细胞群包含的施万细胞的百分比高于所述外围部分的活细胞群中的施万细胞的百分比。
69.如权利要求61-67中任一项所述的轴突导向移植物，其进一步包含至少一个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
70.如权利要求61-69中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述三维结构包括多个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的离散的无细胞通道。
71.如权利要求69或70所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
72.如权利要求69或70所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
73.如权利要求69或70所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组合。
74.如权利要求70-73中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述施万细胞的至少一些沿着所述无细胞通道的表面安置。
75.如权利要求69-74中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道具有彼此并排的取向并且通过所述细长三维结构中的所述活细胞的一些彼此隔开。
76.如权利要求70-75中任一项所述的轴突导向移植物，其中存在至少三个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
77.如权利要求70-76中任一项所述的轴突导向移植物，其进一步包含在所述无细胞通道的至少一个中的琼脂糖填充体。
78.如权利要求77所述的轴突导向移植物，其中所述施万细胞的至少一些接触所述琼脂糖填充体。
79.—种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能，所述移植物包含 包含多个活细胞的细长三维结构，所述三维结构包括外围部分和中央部分，所述中央部分在所述外侧部分的相反末端之间轴向延伸，以使得所述外侧部分围绕所述中央部分，所述中央部分的活细胞群包含的施万细胞的百分比高于所述外侧部分的活细胞群中的施万细胞的百分比，其中所述细长三维结构是工程化组织，不是自体移植物，是不受神经支配的，或包含组织培养基。
80.如权利要求79所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构不是自体移植物。
81.如权利要求79或80所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构进一步包含至少一个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
82.如权利要求81所述的轴突导向移植物，其中所述三维结构包括多个在所述相反末端之间延伸的离散的无细胞通道。
83.如权利要求82所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道围绕所述中央部分。
84.如权利要求81-83中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述外侧部分围绕所述无细胞通道。
85.如权利要求81-84中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道具有彼此并排的取向并且通过所述细长三维结构中的所述活细胞的一些彼此隔开。
86.如权利要求81-85中任一项所述的轴突导向移植物，其中存在至少三个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
87.如权利要求81-86中任一项所述的轴突导向移植物，其进一步包含在所述无细胞通道的至少一个中的琼脂糖填充体。
88.如权利要求81-87中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述施万细胞的至少一些接触所述琼脂糖填充体。
89.如权利要求81-88中任一项所述的轴突导向移植物，其中至少一些所述施万细胞沿着所述无细胞通道的表面安置。
90.如权利要求79-89中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述活细胞包括骨髓干细胞。
91.如权利要求79-90中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞进一步包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
92.如权利要求79-91中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构是不受神经支配的。
93.如权利要求79-91中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构是工程化组织。
94.如权利要求79-93中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述细长三维结构包含组织培养基。
95.如权利要求81-94中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
96.如权利要求81-94中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
97.如权利要求81-94中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组合。
98.一种轴突导向移植物，所述移植物在被移植到具有神经系统的活有机体中并且被安放在切断神经的末端之间的间隙中时通过促进再生轴突生长穿过所述移植物来恢复神经功能，所述移植物包含 包含多个活细胞的细长三维结构，所述多个活细胞包括施万细胞； 至少一个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道；以及 在所述无细胞通道中的至少一个填充体，所述至少一个填充体包含琼脂糖，其中所述施万细胞的至少一些沿着所述无细胞通道与所述填充体相邻安置。
99.如权利要求98所述的轴突导向移植物，其中所述三维结构包括多个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的离散的无细胞通道。
100.如权利要求98或99所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞进一步包括选自由间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞及其组合组成的组的细胞。
101.如权利要求98-100中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括具有抗炎性质的细胞。
102.如权利要求98-101中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述多个活细胞包括骨髓干细胞。
103.如权利要求99-102中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道具有彼此并排的取向并且通过所述细长三维结构中的所述活细胞的一些彼此隔开。
104.如权利要求99-103中任一项所述的轴突导向移植物，其中存在至少三个在所述细长三维结构的相反末端之间延伸的无细胞通道。
105.如权利要求98-104中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述施万细胞的至少一些接触填充体。
106.如权利要求98-105中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的或以一种或多种无细胞材料填充。
107.如权利要求98-105中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充或全部以一种或多种无细胞材料填充。
108.如权利要求98-105中任一项所述的轴突导向移植物，其中所述无细胞通道是中空的、部分以一种或多种无细胞材料填充、全部以一种或多种无细胞材料填充或其任意组口 ο
109.—种多细胞体，其包含多个活细胞，其中所述细胞彼此粘附并且所述多个活细胞包括第一类型的活细胞和第二类型的活细胞，其中所述第一类型的活细胞是施万细胞并且所述施万细胞占所述多个活细胞的约O. 1%至约20%。
110.如权利要求109所述的多细胞体，其中所述施万细胞占所述多个活细胞的约1%至约 15%。
111.如权利要求110所述的多细胞体，其中所述施万细胞占所述多个活细胞的约1%至约 10% O
112.如权利要求111所述的多细胞体，其中所述施万细胞占所述多个活细胞的约3%至约 10% ο
113.如权利要求112所述的多细胞体，其中所述施万细胞占所述多个活细胞的约5%至约 10% ο
114.如权利要求109-113中任一项所述的多细胞体，其中所述第二类型的细胞是骨髓干细胞。
115.如权利要求114所述的多细胞体，其中所述骨髓干细胞占所述多个活细胞中的大多数。
116.如权利要求109-115中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度为至少约I厘米。
117.如权利要求109-116中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度为至少约2厘米。
118.如权利要求109-117中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度为至少约3厘米。
119.如权利要求109-118中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度小于约7厘米。
120.如权利要求109-119中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度小于约5厘米。
121.如权利要求109-120中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度小于约3厘米。
122.如权利要求109-115中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度范围为约I厘米至约7厘米。
123.如权利要求109-115中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度范围为约2厘米至约6厘米。
124.如权利要求109-115中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体的长度范围为约3厘米至约5厘米。
125.如权利要求109-124中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体是大致圆柱形的并且具有大致圆形的横截面。
126.如权利要求109-125中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体进一步包含组织培养基。
127.如权利要求109-126中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体是不受神经支配的。
128.如权利要求109-127中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体是工程化组织。
129.如权利要求109-128中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体中的所述细胞的粘附力足够强，以使得当所述多细胞体由平坦表面支承时所述多细胞体可保持三维形状，所述三维形状包括宽度和高度，所述高度是所述宽度的至少约一半。
130.如权利要求109-129中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体中的所述细胞的粘附力足够强，以使得当所述多细胞体由平坦表面支承时所述多细胞体可保持三维形状，所述三维形状被构造为(i)在所述多细胞体的底部包括接触表面，在此处所述多细胞体与所述表面接触；以及(ii)使得所述多细胞体的三维形状在所述平面上的二维投影的面积比所述接触表面的面积大。
131.如权利要求109-130中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体中的细胞的粘附力足够强，以使得当与所述多细胞体基本上相同的另一个多细胞体在所述多细胞体的顶部时所述多细胞体可支承所述另一个多细胞体的重量。
132.如权利要求109-111中任一项所述的多细胞体，其中所述多细胞体中的细胞的粘附力足够强，以使得所述多细胞体可用器械来捡起。
133.—种包含多个活细胞的多细胞体，其中所述细胞彼此粘附并且所述多个活细胞包括第一类型的活细胞和第二类型的活细胞，其中所述第一类型的活细胞是骨髓干细胞并且所述骨髓干细胞占所述多个活细胞的约80%。
134.一种三维结构，其包含 多个细长的多细胞体，每个多细胞体包含多个彼此粘附的活细胞，所述多细胞体具有相反的轴向末端； 其中所述多细胞体以使得所述多细胞体具有彼此并排的取向并且一个所述多细胞体的至少一个末端相对于相邻的一个所述多细胞体的对应末端轴向偏置的三维方式来布置。
135.如权利要求134所述的三维结构，其进一步包含一个或多个填充体，每个填充体包含抵抗细胞从所述多细胞体迁移和向内生长至所述填充体中的生物相容性材料，其中所述填充体与所述多细胞体一起以所述三维方式布置。
136.如权利要求135所述的三维结构，其中所述填充体包含细长填充体，所述细长填充体以与所述一个多细胞体的偏置末端首尾相连衔接的方式安放。
137.如权利要求135所述的三维结构，其中所述多细胞体包含第一组多细胞体和第二组多细胞体，所述第一组多细胞体所具有的末端相对于所述第二组多细胞体的对应末端轴向凹陷，所述填充体包含一组细长填充体，所述细长填充体以与所述第一组多细胞体的凹陷末端首尾相连衔接的方式安放，所述第二组中的多细胞体具有与所述组中的填充体的所述衔接末端重叠的足够长度。
138.—种制备具有由施万细胞填充的多个轴向通道的多细胞构建体的方法，其包括以下步骤 1)制备多种类型的细胞粘团，所述细胞粘团在所选定的活细胞当中具有不同浓度的施万细胞， 2)使每个细胞粘团成形为细长的形状， 3)将所述成形的细胞粘团在受控环境中孵育以使得所述细胞彼此粘附以便形成细长的多细胞杆， 4)制备具有与所述多细胞杆相似大小的无细胞填充杆或支承杆， 5)根据一定的方式来布置多个多细胞杆和无细胞杆，所述方式使得每个所述多细胞杆接触至少一个其它多细胞杆，并且使得所述具有较低浓度施万细胞的多细胞杆放置在所述周围层中，而具有所述较高浓度施万细胞的多细胞杆放置在所述中心，以及 6)使所述多细胞杆与至少一个其它多细胞杆融合以便形成所需的构建体。
139.—种三维神经移植物构建体，其包含 (a)多个第一工程化多细胞体，其中所述多个第一工程化多细胞体中的每个工程化多细胞体包含多个第一活细胞； (b)多个第二工程化多细胞体，其中所述多个第二工程化多细胞体中的每个工程化多细胞体包含多个第二活细胞； (c)多个离散填充体，其中所述多个离散填充体中的每个离散填充体包含抵抗所述多个第一活细胞或第二活细胞迁移或向内生长的生物相容性材料；并且 其中所述多个离散填充体形成多个在所述三维结构的第一末端和第二末端之间纵向延伸的无细胞通道。
140.如权利要求139所述的三维神经移植物构建体，其中所述多个第一活细胞和所述多个第二活细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞或其任意组合。
141.如权利要求139所述的三维神经移植物构建体，其中所述多个第一活细胞包括施万细胞。
142.如权利要求139所述的三维神经移植物构建体，其中所述多个第二活细胞包括骨髓干细胞。
143.如权利要求141所述的三维神经移植物构建体，其中所述多个第一工程化多细胞体集聚在所述多个无细胞通道的周围。
144.如权利要求142所述的三维神经移植物构建体，其中所述多个第二工程化多细胞体集聚在所述移植物的外围。
145.如权利要求139所述的三维神经移植物构建体，其中所述填充体包含琼脂糖。
146.一种槽形生物结构，其包含 (a)多个第一活细胞； (b)多个第二活细胞；以及 (c)多个无细胞通道； 其中所述多个无细胞通道在所述三维结构的第一末端与第二末端之间纵向延伸。
147.如权利要求146所述的槽形生物结构，其中所述无细胞通道是中空的。
148.如权利要求146所述的槽形生物结构，其中所述无细胞通道以填充体填充或部分填充。
149.如权利要求146所述的槽形生物结构，其中所述多个第一活细胞和所述多个第二活细胞包括间充质干细胞、骨髓干细胞、毛囊干细胞、嗅鞘细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、施万细胞，或其任意组合。
150.如权利要求146所述的槽形生物结构，其中所述多个第一活细胞包括施万细胞。
151.如权利要求146所述的槽形生物结构，其中所述多个第二活细胞包括骨髓干细胞。
152.如权利要求150所述的槽形生物结构，其中所述多个第一活细胞集聚在所述多个无细胞通道的周围。
153.如权利要求151所述的槽形生物结构，其中所述多个第二活细胞集聚在所述移植物的外围。
154.如权利要求146-153中任一项所述的槽形生物结构用于重新接合受损轴突的近端和远端残余部分的用途。
155.如权利要求146-153中任一项所述的槽形生物结构用于制备重新接合受损轴突的近端和远端残余部分的神经移植物的用途。
全文摘要
一种工程化三维结构包括彼此粘附的活细胞。所述活细胞适当地包括施万细胞和至少一种其它类型的细胞。伴随施万细胞的细胞可以适当地为骨髓干细胞或具有一种或多种抗炎性质的另一种类型的细胞。所述结构适当地为移植物，该移植物在被移植到活有机体的切断神经的近端残根与远端残根之间时促进恢复性轴突生长。所述移植物可任选地包括多个在所述移植物的相反轴向末端之间延伸的无细胞导管。生物打印(Bio-printing)技术可以用于通过堆叠多个多细胞体来组装三维构建体，所述三维构建体通过成熟而变为轴突导向移植物，每个多细胞体包括多个活细胞，这些活细胞彼此充分粘附以便在堆叠所述多细胞体来形成所述结构时避免发生塌陷。
文档编号C12N5/071GK102869391SQ201180017227
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者G·弗尔加克斯, S·H·科尔伯特, B·A·哈伯德, F·马尔加, D·克里斯蒂安森 申请人:密苏里大学管理者