专利名称：一种高虫草素含量北冬虫夏草胶囊的制备方法
技术领域：
本发明涉及保健食品。具体涉及一种高虫草素含量北冬虫夏草胶囊的制备方法。
技术背景
冬虫夏草为珍贵中草药，其主要成分为:虫草酸、虫草素、虫草多糖以及抗衰老、 抗恶性肿瘤的活性物质等，具有滋肺补肾、益精定喘、扩展血管、降低血压、抗病毒等多种功效。因而，冬虫夏草的需求量不断增加，但是，有限的天然资源，日趋枯竭，人工栽培也不易成功。因此，这是亟待解决的问题。
蛹虫草，又称北虫草、北冬虫夏草。经检测，蛹虫草的药用成分及含量和药用价值可与冬虫夏草媲美，其中虫草素含量为冬虫夏草的3-5倍，其它主要成分的含量多数高于或相当于冬虫夏草。蛹虫草可以人工栽培，培养基的原料主要为大米。本发明通过对蛹虫草菌株的筛选，得到蛹虫草C0B201，其虫草素含量平均为1.4%，最高可达1.7%。目前，现在的北冬虫夏草菌株虫草素含量为0.5-0.7%，天然虫草中虫草素含量约为0.2%。而将北冬虫夏草经低温风干后进行粉碎，再将虫草粉充填胶囊，能最大限度保持北冬虫夏草中的活性成分，而胶囊产品有利于保存、服用和携带。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计高虫草素含量北冬虫夏草胶囊的制备方法。
本发明提供了一种高虫草素含量北虫草胶囊的制备方法。
本发明方法包括下列步骤:
(I)菌种制备:从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，蛹虫草拟青霉 Cordyceps militaris,CGMCC N0.1823接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基(改良PDA培养基)中，18°C -25°C，避光培养10-12天，再接入原种培养基中进行培养，18°C _25°C，摇床培养5天，培养好的北冬虫夏草菌液于温度4-10°C储存，备用；
所述改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，每IOOOml:
土豆 190_210g蔗糖 19_21g琼脂 19_21g
加水补足IOOOml ；
原种培养基配方，每IOOOml:
土豆190-210g鹿糖9-llg蛋白胨0.9-1.1g胡萝卜9_llg洋葱9_llg蘑燕 9-llg 鸡蛋 4_6g 明帆 0.04_0.06g 碳酸氢钠 0.9-1.1g
加水补足IOOOml ;
⑵配料装瓶
培养瓶体积为255ml，每个培 养瓶中加入大米20_30g，水24_40ml，混匀后上盖，准备灭菌；
⑶灭菌
将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121°C下，高压蒸汽灭菌20-30分钟，冷却后， 取出，准备接种；
(4)接种
将步骤(I)培养的北冬虫夏草菌液原种液，按每个灭菌后的培养瓶中加入2.5ml 的原种液进行接种；
(5)培养
接种后的北冬虫夏草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度18°C _25°C，湿度控制在65% -95%，每天光照9小时，光照强度为15001x-35001x，每天通风1_3小时，培养45-60 天；
(6)采收
将培养成熟的北冬虫夏草进行采收，摆放在采收盘；
所述北冬虫夏草的成熟标准:色泽:黄色或橙黄色；组织形态:长圆柱状，表面粗糙，头部呈棒状，长度为6-10cm，直径为0.2-0.4cm ；
(7)风干
将北冬虫夏草采收盘置于风干架上，保持室内温度40-48°C，20_24小时，测北冬虫夏草子实体水分< 12% ；
(8)粉碎
风干后的北冬虫夏草粉碎至80目；
(9)胶囊充填
粉碎后的北冬虫草粉充填入胶囊，包装。
本发明的另一目的是提供了用于上述制备的一种北冬虫夏草菌株(本申请人的菌种编号C0B201),该菌株为蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris,保藏号CGMCC N0.1823。
本发明人通过长期研究和实验，筛选到该菌株，经中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定和毒理试验，鉴定为虫草属菌种，蛹虫草(蛹虫草拟青霉)Cordyceps militaris。 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。(地址:中国北京海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，邮编:100080)
(保藏日期 :2006年9月22日，附保藏中心受理通知书及存活性报告书)能用于工业化生产制备
本发明所述北冬虫夏草菌株CGMCC N0.1823蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris 通过下列方法制备:
(I)野生北冬虫夏草(采集自中国沈阳棋盘山)先用野生北冬虫夏草8-10倍量 W/W 75%酒精清洗，再用1% HgCl2溶液(以完全浸没样品为准)浸泡2min，然后用野生北冬虫夏草8-10倍量W/W无菌水分4次洗，每次2-2.5倍量W/W ；
(2)菌种培养:清洗干净的野生北冬虫夏草进行蛹虫草孢子分离:野生北冬虫夏草用改良PDA培养基(改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板培养，形成分生孢子，再挑取分生孢子用10-20ml无菌水制成孢子菌悬液；将该孢子菌悬液，再接种至改良PDA培养基中进行第二次培养，分离得到纯的菌株北冬虫夏草菌株CGMCC N0.1823。
所述步骤⑵的菌种培养条件(每次):
改良PDA培养基配方，每IOOOml:
土豆 190_210g 蔗糖 19_21g 琼脂 19_21g
加水补足IOOOml ；
避光，温度18°C -25°C，培养 10-12 天。
本发明方法采用筛选的菌株北冬虫夏草菌株CGMCC N0.1823蛹虫草拟青霉 Cordyceps militaris进行优化培养，制得高虫草素含量的北冬虫夏草胶囊，经检测产品北冬虫夏草中的虫草素含量达到1.4% -1.7%,(现有的其他人工培养的北冬虫夏草虫中的草素含量小于1%，约为0.53% -0.9% )。本发明方法简单，适于规模型的工业化生产。
具体实施方式
实施例1北冬虫夏草CGMCC N0.1823菌液制备
(I)筛选:野生北冬虫夏草(采集自中国沈阳棋盘山)(10克)先用100ml75%酒精清洗，再用11^HgCl2溶液(以完全浸没样品为准)浸泡2min，然后用无菌水洗4次，(每次用量25ml)。清洗干净的野生北冬虫夏草(5克)进行蛹虫草孢子分离，用改良PDA培养基平板培养10-12天，避光，温度19°C，形成大量的分生孢子。挑取分生孢子，用无菌水(20ml) 制成孢子菌悬液。将孢子菌悬液(0.2ml)，接种至改良PDA培养基中(IOml)平板培养10-12 天，避光，温度19°C，分离得到纯的北冬虫夏草菌株。经中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定和毒理试验，鉴定为虫草属菌种，蛹虫草(蛹虫草拟青霉)Cordyceps militaris。已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC N0.1823。
(2)北冬虫夏草CGMCC N0.1823菌液制备
上述从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草,蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris, CGMCC N0.1823接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基(改良PDA培养基10-15ml)中，19°C，避光培养10天，再接入改良PDA培养基中进行培养，19°C，摇床培养5天，培养好的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823菌液放入冰箱，温度4_10°C储存，备用。
改良PDA培养基配方，每IOOOml
土豆 190-210g 蔗糖 19-21g 3
加水补足IOOOml0
实施例2
(I)菌种制备
(改良PDA培养基):
土豆 190g
蔗糖21g
琼脂20g
加水补足IOOOml ；
(原种培养基):
土豆 200g
蔗糖IOg
蛋白胨1.0g
胡萝卜IOg
洋葱IOg
蘑燕IOg
鸡蛋5g
明矾0.05g
碳酸氢钠1.0g
加水补足IOOOml
实施例1从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823菌液，(0.2ml) 接入改良PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基(IOml)中，201:，避光培养11天，再接入原种培养基中(200ml)进行培养，20°C，摇床培养5天，即得到北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823原种液。培养好的北冬虫夏草菌液于温度4-10°C储存，备用；
每个培养瓶(200ml)中加入大米20g，水34ml，混匀后上盖，灭菌(将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121 °C下，高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后，取出，准备接种)；按每个培养瓶中加入2.5ml的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823原种液进行接种。接好种的培养瓶， 移至培养架中，控制培养温度18°C，湿度控制在65%，每天光照9小时，光照强度为15001x， 每天通风I小时以上。培养45天，待北冬虫夏草成熟后(直径3mm，长8cm)，进行采收，再移入风干室保持室内温度40°C，24小时进行风干，风干后的北虫草进行粉碎过80目筛，然后充填进无色透明胶囊后装瓶，进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.7%。
实施例3
(改良PDA培养基):
土豆 200g
鹿糖20g
琼脂20g
加水补足IOOOml ；
(原种培养基):
土豆 204g
蔗糖9g
蛋白胨1.0g
胡萝卜9g
洋葱9g
蘑菇9g
鸡蛋5g
明帆0.05g
碳酸氢钠1.0g
加水补足IOOOml
实施例1从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823菌液(0.2ml)，接入改良PDA (马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中(约10ml)，20°C，避光培养11天，再接入原种培养基中(200ml)进行培养，21°C，摇床培养5天，即得到北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823菌液原种液，于温度4-10°C储存，备用。
每个培养瓶(200ml)中加入大米25g，水35ml，混匀后上盖，灭菌(将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121 °C下，高压蒸汽灭菌25分钟，冷却后，取出，准备接种)；按每个培养瓶中加入2.5ml的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823原种液进行接种。接好种的培养瓶， 移至培养架中，控制培养温度22°C，湿度控制在75%，每天光照9小时，光照强度为20001x， 每天通风I小时以上。培养50天，待北冬虫夏草成熟后(直径3mm，长8cm)，进行采收，再移入风干室保持室内温度45°C，22小时进行风干，风干后的北虫草进行粉碎过80目筛，然后充填进无色透明胶囊后装瓶，进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.5%。0089]实施例40090](改良PDA培养基):0091]土豆 190g0092]蔗糖21g0093]琼脂20g0094]加水补足IOOOml ；0095](原种培养基):0096]土豆 196g0097]蔗糖Ilg0098]蛋白胨1.0g0099]胡萝卜Ilg0100]洋葱Ilg0101]蘑菇Ilg0102]鸡蛋5g0103]明帆0.05g0104]碳酸氢钠1.0g0105]加水补足IOOOml0106]实施例1从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823菌液(0.2ml)，接入改良PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中(IOml)，25°C，避光培养12天，再接入原种培养基中(200ml)进行培养，22°C，摇床培养5天，即得到北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823原种液，于温度4-10°C储存，备用。
每个培养瓶(200ml)中加入大米24g，水32ml，混匀后上盖，灭菌(将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121 °C下，高压蒸汽灭菌30分钟，冷却后，取出，准备接种)；按每个培养瓶中加入2.5ml的北冬虫夏草菌液CGMCC N0.1823原种液进行接种。接好种的培养瓶， 移至培养架中，控制培养温度25°C，湿度控制在85%，每天光照9小时，光照强度为35001x， 每天通风I小时以上。培养60天，待北冬虫夏草成熟后(直径3mm，长8cm)，进行采收，再移入风干室保持室内温度48°C，20小时进行风干，风干后的北虫草进行粉碎过80目筛，然后充填进无色透明胶囊后装瓶，进行检验和包装成品。经检测，虫草素含量为1.4%。
实施例5
本发明产品的检测结果
北冬虫夏草中腺苷和虫草素的检测方法
(该方法参考孙月等蛹虫草虫草酸虫草素含量测定与分析中国食用菌第18卷第6 期第19页1999年)
1. 原理
虫草素和腺苷的酸碱性不同以及结构差异，导致他们与柱内载体吸附能力的不同，同时利用缓冲溶液加大虫草素和腺苷的洗脱时间差，从而达到分离的目的。腺苷在 256nm处有最大吸收，虫草素在此波长接近最大吸收，且吸收值与浓度呈线形关系。
2.试剂
2.1磷酸二氢钾(分析纯)、乙醇(优级纯)、甲醇(优级纯)、腺苷标准品、虫草素标准品、双蒸水
2.2溶液的配制
腺苷标准溶液的配制:精确称取腺苷标准品0.0lOOg，加水溶解并定容到50ml，放置冰箱，备用。
虫草素标准溶液的配制:精密称取虫草素标准4.2mg，加水溶解并定容到100ml， 放置冰箱，备用。
0.01mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾1.3609g，加双蒸水溶解，定容至 IOOOml0
3.仪器
高效液相色谱仪、超声波清洗器、离心机
4.分析步骤
4.1样品溶液的制备
精密称取100目虫草粉0.2g，于50ml三角烧瓶中，加20ml提取液，超声提取15 分钟，3000rpm离心5分钟，残渣重复操作一次，合并滤液，定容至50ml，再吸取5ml定容到 IOOmlo
4.2色谱柱条件:
色谱柱:C18柱4.6X150mm，5ym柱温:室温
紫外检测器:检测波长256nm流动相:甲醇:0.01mol/L
磷酸二氢钾溶液=10: 90
流速:1.0mL/min
4.3 测定
4.3 测定
取20 μ L标准溶液和试样溶液注入色谱柱，以保留时间定性，以峰面积比较定量。
4.4标准曲线的·制备
腺苷标准溶液:分别配制浓度为0.200、1.00,2.00,5.00、10.00 μ g/ml腺苷标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度做标准曲线。
虫草素标准曲线:分别配制浓度为0.42、1.005,5.025、10.050、15.075 μ g/ml腺苷标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度做标准曲线。
5.结果计算A =峰面积/100
虫草素％= (0.0017A+0.0142) *20*50/1000/(M*1000) *100
本发明实施例2、3、4得到高虫草素含量的北冬虫夏草，经检测产品中虫草素含量为 1. %Λ.5%Λ.4%。
实施例6
市售得到样品:隆力奇北冬虫夏草(江苏隆力奇生物科技股份有限公司)
经用实施 例5方法检测，产品中虫草素含量为1.1%。
权利要求
1.一种高虫草素含量北虫草胶囊的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(1)菌种制备从野生虫草中分离得到的北冬虫夏草母种，蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris，CGMCC NO. 1823接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，18°C _25°C，避光培养 10-12天，再接入改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养，180C -25°C，摇床培养5天，培养好的北冬虫夏草菌液原种液于温度4-10°C储存，备用；(2)配料装瓶培养瓶体积为255ml，每个培养瓶中加入大米20-30g，水24_40ml，混匀后上盖，准备灭囷；(3)灭菌将培养瓶排列整齐放入灭菌锅内，在121°C下，高压蒸汽灭菌20-30分钟，冷却后，取出，准备接种；(4)接种将步骤(I)培养的北冬虫夏草菌液原种液，按每个灭菌后的培养瓶中加入2. 5ml的原种液进行接种；(5)培养接种后的北冬虫夏草培养瓶，移至培养架中，控制培养温度18°C -25°C，湿度控制在 65% -95%，每天光照9小时，光照强度为15001x-35001x，每天通风1_3小时，培养45-60 天；(6)米收将培养成熟的北冬虫夏草，长度为6-lOcm，直径为O. 2-0. 4cm进行采收，摆放在采收盘；(7)风干将北冬虫夏草采收盘置于风干架上，保持室内温度40-48°C，20-24小时，测北冬虫夏草子实体水分< 12% ；(8)粉碎风干后的北冬虫夏草粉碎至80目；(9)胶囊充填粉碎后的北冬虫草粉充填入胶囊。
2.根据权利要求I所述的一种高虫草素含量北虫草胶囊的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，每IOOOml 土豆 190-210g 蔗糖 19-21g 琼脂 19_21g 加水至IOOOml ；原种培养基配方，每IOOOml 土豆190-210g 鹿糖9-llg 蛋白胨O. 9-1. Ig 胡萝卜9_llg洋葱9_llg 蘑燕 9-llg 鸡蛋 4_6g 明帆 0.04_0.06g 碳酸氢钠 O. 9-1. Ig 加水至IOOOml0
3.根据权利要求I所述的一种高虫草素含量北虫草胶囊的制备方法，其特征在于，所述制得的的北冬虫草胶囊中北冬虫夏草的虫草素含量为1.4% -1.7%。
4.一种用于权利要求I所述高虫草素含量北虫草胶囊制备方法的北冬虫夏草菌株，其特征在于，所述菌株为蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris,保藏号CGMCC NO. 1823。
5.根据权利要求4所述的北冬虫夏草菌株，其特征在于，所述菌株通过下列方法制备(1)野生北冬虫夏草先用野生北冬虫夏草8-10倍量W/W75%酒精清洗，再用I1^HgCl2 溶液以完全浸没样品为准，浸泡2min，然后用野生北冬虫夏草8-10倍量W/W无菌水分4次洗，每次2-2. 5倍量W/W;(2)菌种培养清洗干净的野生北冬虫夏草进行蛹虫草孢子分离野生北冬虫夏草用改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养，形成分生孢子，再挑取分生孢子用10_20ml无菌水制成孢子菌悬液；将该孢子菌悬液，再接种至改良PDA培养基中进行第二次培养，分离得到纯的菌株北冬虫夏草菌株CGMCC NO. 1823。
6.根据权利要求5所述的北冬虫夏草菌株，其特征在于，所述步骤(2)的每次菌种培养条件(1)改良PDA培养基配方每IOOOml土豆 190-210g 蔗糖 19-21g 琼脂 19_21g加水补足IOOOml ；(2)避光，温度18°C-25°C，培养10-12天。
全文摘要
本发明提供了一种高虫草素含量北虫草胶囊的制备方法。本发明方法采用筛选的菌株北冬虫夏草菌株CGMCC NO.1823蛹虫草拟青霉Cordyceps militaris进行优化培养，经菌种制备、培养、采收、风干、粉碎、胶囊灌装等步骤，制备高虫草素含量的北冬虫夏草胶囊，经检测产品北冬虫夏草中的虫草素含量达到1.4％-1.7％，本发明方法简单，适于规模型的工业化生产。
文档编号A23L1/28GK103251034SQ20121003554
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者张刚, 范培萍, 费翅鲲, 黄克文, 范连花, 沈珍芳, 许瑨 申请人:上海高博特生物保健品有限公司