专利名称：一种人源化三维肠黏膜模型的建立及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种人源化三维肠黏膜模型的建立及其应用。
背景技术：
口服给药作为一种传统的给药方式，以其相对的方便性与安全性而为人们所广泛接受。吸收过程是决定口服药物生物利用度的关键因素之一。而小肠是口服药物吸收的主要部位，所以目前国内外主要利用各种体外及在体肠吸收模型研究药物在小肠部位的跨膜转运过程，从而预测其口服吸收情况。其中，Caco-2单层细胞模型是目前被广泛应用于研究药物分子的生物膜通透性和跨膜转运机制的体外模型之一。该模型体系组成因素单一明确，且细胞表型及功能与体内肠上皮细胞存在部分相似性，所以它在药物的吸收特性研究方面显示出一定的优势。目前Caco-2细胞模型已经成为研究药物吸收特征的代表性体外研究体系。但需要指出:此模型尚存在很多缺陷。大量研究显示其相关性较差，不同实验室间预测结果差异较大。该模型不但缺少肠壁的黏液层以及部分代谢酶(如CYP3A)，从而影响一些化合物(如代谢酶底物)的吸收预测，而且缺乏细胞外间质(ECM)及间质细胞。事实上，ECM和间质细胞的存在及他们与上皮细胞之间复杂的相互作用在维持肠上皮细胞的表型和功能方面是至关重要的。因此，在Caco-2单层细胞模型基础上的改良就显得非常重要。最近国外有相关报道:采用Caco-2细胞与其他细胞混合培养(包括HT29-MTX细胞、人Burkitt' s淋巴瘤细胞和PC-12细胞等)，从而建立两种细胞共培养模型以模拟肠吸收代谢过程。但这些模型仅限于一种间质细胞共培养，且缺乏ECM，而且模型稳定性和重现性均较差。对比之下，动物 模型虽然具有正常肠上皮的复杂生理结构和功能，克服了体外细胞模型所存在的缺陷，但种属差异的存在大大限制了其数据在人体的外推性。此外，动物实验本身难于实现理想质控，缺少高通量筛选的优势；有关伦理学争议以及“3R”原则的提出也都大大制约了动物模型在药物吸收代谢研究中的应用。近年来，再生医学技术的发展使得三维组织化模型的体外构建成为可能。三维培养体系能够提供与体内类似的微环境，使细胞与细胞、细胞与细胞外基质间建立紧密联系并进行信号传递，从而使该体系中细胞的基因表达、基质分泌及生理功能与在体细胞更相似。迄今为止，已有多种三维组织化模型构建成功并应用于研究中。但是经文献检索，目前仍未发现构建研究药物肠道吸收代谢的三维肠黏膜模型的相关报道。基于以上原因，本发明利用肠上皮细胞、多种间质细胞以及细胞外间质构建三维肠黏膜模型。该培养体系能够提供与在体组织类似的微环境，使肠上皮细胞的生长更接近体内三维生长模式，在细胞形态及功能特征方面最大限度地模拟了在体细胞或组织，从而发挥其对外源物质吸收转运代谢的生理功能。此三维模型可以作为传统的体外单层细胞模型研究和体内实验的一个桥梁，从而更方便、更准确地评价口服药物的透膜能力及其生物利用度
发明内容
本发明的目的是提供一种人源化三维肠黏膜模型及其应用，该模型可以广泛用于药物早期发现和新药开发中预测口服药物的透膜能力及其生物利用度。小肠上皮是外源性物质(主要包括营养物质及药物)吸收的主要场所，它是一层主要由肠上皮细胞、分泌黏液的杯状细胞、成纤维细胞、内分泌细胞、神经细胞、M细胞及黏膜下的免疫细胞共同构成的生理屏障。肠上皮细胞为极性细胞，分为肠腔侧和基底侧。本发明提供了一种人源化三维肠黏膜模型的建立，步骤为将间质细胞混种于细胞外基质中，孵育2小时后细胞外基质凝固，然后在其上面种上一层混合上皮细胞，共培养两周以后，上皮细胞层达到完整致密状态(跨膜电阻值大于250Ω.cm2)，再于Transwell基底侧接种一层免疫细胞，上述四种细胞共培养一周以后，得到分化完全的三维肠黏膜模型。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，所述间质细胞包括成纤维细胞在内的所有肠黏膜内存在的间质细胞，优选为成纤维细胞。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，所述的细胞外基质包括胶原、基质胶所有天然类及合成类的细胞外基质，优选为胶原。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，所述的混合上皮细胞为黏液分泌细胞和Caco-2 (结肠腺癌)细胞，黏液分泌细胞和Caco-2细胞的接种比例为1: 9 1: 3。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，所述黏液分泌细胞包括耐甲氨蝶呤的结肠腺癌HT29-MTX细胞、适应于半乳糖培养基的结肠腺癌HT29-H细胞在内的所有具有黏液分泌功能的细胞，优选为HT29-MTX细胞。
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本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，，所述免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞所有肠黏膜内存在的具有免疫调节功能的免疫细胞，优选为THP-1 (人单核白血病)细胞来源的巨噬细胞。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型的建立，所述的共培养中所用的培养基为含FBS (胎牛血清)、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和抗生素等多种成分优化的细胞共培养培养基。本发明提供的人源化三维肠黏膜模型适用于天然产物、化学合成药物、生物药物所有来源的用于人体的口服药物。本发明同现有Caco-2单层细胞模型相比具有如下优点:1.该三维模型具有与体内肠黏膜类似的黏液层，它本身可以作为某些药物分子穿过肠道的屏障。2.该模型的胞间连接蛋白的表达量更低，使得胞间连接较疏松，更接近真实的小肠上皮细胞胞间连接状态。3.该三维模型的转运蛋白水平更接近真实的肠上皮细胞的表达水平。4.该三维模型的代谢酶表达水平(羧酸酯酶)更高，弥补了 Caco-2细胞代谢酶表达较低的缺点。5.该三维模型提供细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间复杂的相互作用，形成与体内小肠上皮部位类似的微环境，使肠上皮细胞的生长更接近体内三维生长模式。本发明主要利用Transwell体系建立并评价三维的肠黏膜模型，该三维培养体系主要包括人肠上皮细胞(Caco-2细胞和黏液分泌细胞)、间质细胞、免疫细胞以及细胞外基质，从而更好地模拟体内正常肠黏膜生理结构。本发明所建立的三维肠黏膜模型可以广泛用于具有不同理化性质的口服药物吸收代谢研究中。该模型利用多种细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间直接或间接的相互作用，建立一种生理结构及功能更接近体内环境的三维体外吸收代谢模型，同时可以保证该模型具有理想的稳定性和可重复性，从而能够更加准确地预测未知化合物的透膜能力，并深入了解它们在体内的跨膜转运机制，为类药化合物的筛选及新药的开发提供方便可靠的工具。
图1三维肠黏膜模型示意图；图2建立三维肠黏膜模型流程图；图3Caco-2单层细胞模型和三维肠黏膜模型中的高碘酸-希夫试剂黏液定量分析；图4Caco-2单层细胞模型和三维肠黏膜模型不同培养时间跨膜电阻值(TEER)变化；图5不同转运途径的标志化合物在Caco-2单层细胞模型和三维肠黏膜模型的透膜系数比较；图6不同透膜能力的标志化合物在Caco-2单层细胞模型和三维肠黏膜模型的透膜系数比较；图7酯酶底物(依那普利)在Caco-2单层细胞模型和三维肠黏膜模型的透膜系数比较；图8酯酶代谢产物(依那普利拉)及其底物(依那普利)在Caco-2细胞中蓄积的浓度比。
具体实施例方式下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。实施例1利用Transwell体系构建具有极性的三维肠黏膜模型如下图1所示，将间质细胞(如成纤维细胞)接种于细胞外基质(如胶原)中，孵育2小时以后细胞外基质凝固，在其上面种上一层混合上皮细胞，即一定比例的Caco-2细胞和黏液分泌细胞(如HT29-MTX细胞)，共培养两周以后，再于Transwell的基底侧接种一层免疫细胞(如THP-1细胞来源的巨噬细胞)。上述四种细胞共培养一周以后，该模型分化完全，利用电阻率仪测定跨膜电阻值(TEER)确定上皮细胞层紧密性和完整性后，即可用于药物的跨膜转运实验。共培养模型的培养基采用含FBS，L-谷氨酰胺和抗生素等优化的细胞共培养培养基，模型的建立完全按照图2的时间设计。通过高碘酸-希夫试剂组织化学染色实验结果(图3)可以看出该模型可以分泌出大量的黏液，使肠上皮细胞表面形成一层黏液层，弥补了 Caco-2单层细胞模型缺少黏液层的不足；活性染色实验结果显示该模型中四种细胞的活性均较好，证明在整个三维培养体系中传质较好；利 用Picogreen突光染料精确测定21天内不同时间点三维模型中总DNA含量，结果表明该模型中总的细胞增殖能力较强；Z0-1紧密连接蛋白免疫荧光实验及不同培养时间测得的跨膜电阻值(图4)表明该模型中上皮细胞胞间连接更疏松，克服了 Caco-2单层细胞模型过于紧密的弊端；P_gp免疫荧光实验表明该三维模型中P-gp的表达略有下降，从而优化了 Caco-2单层细胞模型中P-gp过表达的特性；与此同时，RT-PCR实验结果显示该模型与Caco-2单层细胞模型相比P-gp表达含量略有减低，而MRP2和BCRP表达含量有所提高，表明该模型中转运蛋白的表达量更接近体内的肠上皮细胞表达水平。实施例2利用该三维模型研究被动胞旁转运标志化合物的透膜能力采用荧光黄作为胞旁转运的标志化合物，Caco-2单层细胞模型作为对照，三维模型按前述方法建立，培养期间每隔一天换液，直到孵育21天左右，上皮细胞分化完全，同时通过测定跨膜电阻(TEER)检测上皮细胞层的紧密性和完整性，TEER值达到250 Ω.cm2的三维模型可以用于转运实验。在细胞层顶侧(绒毛面，A面)培养液中加入0.5ml 20 μ g/ml的荧光黄药液，同时在底侧(基底面，B面)加入1.5ml空白缓冲溶液，开始转运实验，分别在30min、60min、90min、120min在底侧取100 μ I药液，并同时补足100 μ I空白缓冲溶液。利用荧光分光光度计测定荧光黄含量，激发波长和发射波长分别是490nm和514nm。利用公式:Papp = Δ Q/( Δ t.A.C。)计算突光黄的表观渗透系数(apparent permeabilitycoefficients, Papp)，其中AQ为At内的转运量，A为膜面积，C0为药物的初始浓度，根据算得的Papp值评价其透膜能力变化，结果(图5)表明荧光黄在三维模型中表观渗透系数增力口，即通透性增加，这与测得的TEER值减小及ZO-1免疫荧光实验胞间连接变疏松的结果是一致的，说明此三维模型改善了 Caco-2单层细胞模型过于紧密的不足，它能够更加准确地预测胞旁转运药物的透膜能力。实施例3利用该三维模型研究被动跨细胞转运标志化合物的透膜能力采用普萘洛尔作为被动跨细胞转运的标志化合物，Caco-2单层细胞模型作为对照，三维模型按前述方法建立，培养期间每隔一天换液，直到孵育21天左右，上皮细胞分化完全，同时通过测定跨膜电阻( TEER)检测上皮细胞层的紧密性和完整性，TEER值达到250 Ω.cm2的三维模型可以用于转运实验。在细胞层顶侧(绒毛面，A面)培养液中加入
0.5ml 50 μ M的普萘洛尔药液，同时在底侧(基底面，B面)加入1.5ml空白缓冲溶液，开始转运实验，分别在30min、60min、90min、120min在底侧取100 μ I药液，并同时补足100 μ I空白缓冲溶液。利用UFLC测定普萘洛尔含量，检测波长分别是290nm。利用公式:Papp =Λ Q/ ( Λ t.A.Ctl)计算普萘洛尔的Papp值，结果(图5)表明普萘洛尔在三维模型中表观渗透系数也有所增加，即通透性增强。实施例4利用该三维模型研究转运蛋白介导转运标志化合物的透膜能力同样按照前述方法建立三维肠黏膜模型，采用地高辛作为P-gp介导转运的标志化合物，甲氨蝶呤作为BCRP介导转运的标志化合物，依托泊苷作为MRP2介导转运的标志化合物，Caco-2单层细胞模型作为对照，分别研究以上三个标志化合物在三维肠黏膜模型中透膜能力的变化，进而了解三种转运蛋白在三维模型的功能变化。同样利用UFLC对三种标志化合物进行含量测定，地高辛、甲氨蝶呤和依托泊苷的检测波长分别为220nm、302nm和254nm。结果(图5)表明地高辛的透膜系数有所增加，表明P_gp介导的外排转运有所减少，即P-gP功能略有下降，这与P-gp免疫荧光实验结果具有一致性；而甲氨蝶呤和依托泊苷的透膜系数有所减少，表明BCRP和MRP2介导的外排转运有所增加，即三维模型中BCRP和MRP2的功能略有增强。以上结果说明三维肠黏膜模型中不同转运蛋白的功能有所变化，改善了 Caco-2单层模型中P-gp功能过强，而BCRP和MRP2功能相对较弱的不足。
实施例5利用该三维模型研究高渗透标志化合物的透膜能力同样按照前述方法建立三维肠黏膜模型，选取三种高渗透的标志化合物，即咖啡因、安替比林和酮洛芬，研究它们在Caco-2单层模型和三维模型中通透性的变化。利用UFLC对咖啡因、安替比林和酮洛芬进行含量测定，它们的检测波长分别为275nm、241nm和256nm。结果(图6)表明三种高渗透标志化合物在三维模型中的透膜系数都有一定程度的降低，这表明三维模型中的细胞外基质及其中的间质细胞对高渗透化合物可能发挥一定的屏障作用。实施例6利用该三维模型研究中、低渗透标志化合物的透膜能力同样按照前述方法建立三维肠黏膜模型，选取两种中、低渗透的标志化合物，即呋塞米和雷尼替丁，研究它们在Caco-2单层模型和三维模型中通透性的变化。利用UFLC对它们进行含量测定，呋塞米和雷尼替丁的检测波长分别为271nm和314nm。结果(图6)表明两种中、低渗透标志化合物在三维模型中的透膜系数略有增加。实施例7利用该三维模型研究羧酸酯酶底物的透膜能力及代谢程度同样按照前述方法建立三维肠黏膜模型，选取依那普利作为酯酶的阳性底物，研究它在Caco-2单层模型和三维模型中通透性的变化，同时考察依那普利在此模型中的代谢程度，即提取上皮细胞内蓄积的依那普利及其代谢产物(依那普利拉)并利用UFLC对它们进行含量测定，检测波长为215nm。结果表明依那普利在三维模型中的透膜系数降低(图7)，同时上皮细胞内依那普利拉与依那普利的浓度比有所提高(图8)，以上结果证实三维模型中的酯酶活性有明 显提高。
权利要求
1.一种人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于将一种间质细胞混种于细胞外基质中，鮮育后细胞外基质凝固，然后在其上面种上两种混合上皮细胞，共培养两周以后，再于Transwell基底侧接种一层免疫细胞，上述四种细胞共培养一周以后，得到分化完全的三维肠黏膜模型。
2.按照权利要求I所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述间质细胞包括成纤维细胞在内的所有肠黏膜内存在的间质细胞。
3.按照权利要求2所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述间质细胞为成纤维细胞。
4.按照权利要求I所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述的细胞外基质包括胶原、基质胶在内的所有天然类及合成类的细胞外基质。
5.按照权利要求4所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述细胞外基质为胶原。
6.按照权利要求I所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述的混合上皮细胞为黏液分泌细胞和结肠腺癌Caco-2细胞，黏液分泌细胞和Caco-2细胞的接种比例为I : 9 I : 3。
7.按照权利要求6所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述黏液分泌细胞包括耐甲氨蝶呤的结肠腺癌HT29-MTX细胞、适应于半乳糖培养基的结肠腺癌HT29-H细胞在内的所有具有黏液分泌功能的细胞。
8.按照权利要求7所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述黏液分泌细胞为HT29-MTX细胞。
9.按照权利要求I所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞所有肠黏膜内存在的具有免疫调节功能的免疫细胞。
10.按照权利要求9所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述免疫细胞为人单核白血病THP-I细胞来源的巨噬细胞。
11.按照权利要求I所述人源化三维肠黏膜模型的建立，其特征在于所述的共培养中所用的培养基为含胎牛血清FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺和抗生素多种成分优化的细胞共培养培养基。
12.权利要求I所述建立的人源化三维肠黏膜模型适用于研究包括天然产物、化学合成药物、生物药物所有来源的用于人体的口服药物。
全文摘要
本发明提供了一种人源化三维肠黏膜模型的建立及其应用，该模型主要基于小肠上皮正常的生理结构特点，对传统Caco-2单层细胞模型进行改进，即Caco-2细胞在加入细胞外基质的基础上，与黏液分泌细胞、间质细胞以及免疫细胞进行共培养一段时间后，形成一种与体内小肠上皮结构类似、功能相近的三维肠黏膜结构，利用它可以预测口服药物分子的小肠上皮透膜能力及代谢程度；其主要作用是在体外研究药物分子在小肠部位的跨膜转运吸收及代谢过程。
文档编号C12N5/071GK103255097SQ20121003558
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者杨凌, 李娜, 王秀丽 申请人:中国科学院大连化学物理研究所