专利名称：萘啶霉素的生物合成基因簇的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素萘啶霉素的生物合成基因簇，基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
背景技术：
四氢异喹啉生物碱是一类结构复杂而独特的天然产物家族，均具有良好的抗菌和抗肿瘤活性[Chem. Rev. (2002) 102，1669-1730]。1974年，加拿大科学家Klu印fel等人从复活岛土壤中分离得到一种具有良好抗肿瘤活性的天然产物；并且，通过菌种分离发现，它是由土壤中的一种葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus AYB-1026)所产生的次级代谢产物。由于其良好的抗菌活性，Sygusch等人通过发酵的方法分离纯化得到了这种天然产物， 常温下它是一种宝石红的晶体。通过X-ray晶体衍射分析的方法Sygusch首次确定了这种
天然产物的化学结构，并把它命名为Naphthyridinomycin-萘唳霉素。1994年,Lederle
实验室又从Streptomyces viridostaticus ssp Iitoralis的发酵液中分离得到了萘唳霉素的四种结构类似物bioxalomycins(a i，a 2，β 17 β 2,图I),它们均表现出良好的生物活性。研究表明萘啶霉素类生物碱是一种很好DNA烷基化试剂或交联剂，它们在较低的浓度 (约O. 2 μ g/mL)下就能够很大程度地抑制DNA合成，在一定浓度下也能够抑制RNA和蛋白质的合成。基于前人的研究，Willams和Herberich的实验结果揭示出bioxalomycin a2实际上在双链的DNA之间可以形成了一个双链DNA交联。到2000年，生物学家又分离得到了一系列与之结构类似的化合物，统称为四氢异喹啉家族；这些化合物都是以苯醌并环和芳并环为基本核心骨架结构。根据结构上的细微的差异，这几十个结构相似的化合物被分作了三个家族=Naphthyridinomycins家族， Saframycins 家方矣和 Quinocarcins 家方矣。前体标记实验表明萘啶霉素腈基取代物的并环骨架主要来自于三种氨基酸一 L-tyrosine (酪氨酸)，D、L-ornithine (鸟氨酸)，glycine (甘氨酸)[J. Antibiot. 1985, 38,819]:其中苯醌的六元环来自一个L-tyrosine (实际上,酪氨酸首先是由L-methionine 甲基化，再经过一步氧化还原反应实现间位的羟化)，边上的两个六元环来自于一个鸟氨酸，而上面的五员环来则自于由两个甘氨酸缩合得到的serine (丝氨酸)，0_、C-、N-的甲基均来自于L-methionine (甲硫氨酸)。目前，一个来源于加勒比海的一种海鞘(Ecteinascidia turbinate)中的四氢异喹啉天然产物Et 743(见图I)引起了广大生物学家的关注。该化合物体外活性LC5tl <1ρΜ， ID50O. 2-0. 6nM，活性比抗肿瘤药物紫杉醇高约50倍[Clin. Can. Res. (2002)8,75-85]。作为西班牙生物技术公司PharmaMar(Zeltia)主导的抗癌药,ET-743在欧洲的上市申请已获得批准，主要用来治疗经传统化疗治疗无效的晚期软组织肉瘤患者。而在美国和其它国家， PharmaMar已将ET-743的研发和商业开发权授让给Johnson&Johnson。由于ET-743已被欧盟承认为治疗软组织肉瘤的罕用药物，PharmaMar认为该药的全球年销售额将达10亿美元。目前该药还处于治疗乳腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌、黑色素瘤、骨肉瘤、间皮瘤的II期试验和卵巢癌的III期试验。作为一种具有良好临床应用前景的抗肿瘤药物，Et 743来源十分有限。据统计， 从I吨海鞘中只能获得Ig Et 743，不能满足临床科学研究的需要。有人用培养海鞘细胞的方法获得Et 743，但是其海洋来源使得研究非常困难。目前临床研究所用Et 743主要来源于突光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2发酵产生的番红菌素B (safracin, SAC-B)的氰化衍生物经21步化学半合成得到[Chem. Rev. (2002) 102，1669-1730 ;0rg. Lett. (2000)2,2545-2548]。萘啶霉素与Et 743边链和骨架结构有一定的相似，而且其宿主菌是链霉菌，可以通过发酵的方法来获得代谢产物。我们以微生物来源的萘啶霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，阐明生物合成机理，通过代谢工程改造生产Et 743或其类似物进而结合化学半合成生成Et 743或类似物，为新活性“非天然”天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。
发明内容
本发明涉及一种链霉菌Streptomyces lusitanus NRRL8034产生的四氢异喹啉生
物碱家族中具有抗肿瘤活性抗生素-萘唳霉素(Naphthyridinomycin, NPT)的生物合成
基因簇，该基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。抗肿瘤活性的抗生素-萘啶霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明中整个基因簇共包含28个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中 6个(NapH、NapJ, NapL, NapM, NapN, NapO)用于编码非核糖体聚肽合成酶(NRPS)，共包含 8个模块，21个功能域，负责催化萘啶霉素聚肽链的生物合成；4个基因(NapB、NapC、NapD、 NapE)编码的蛋白负责催化二碳起始单元的合成与延伸；4个基因(NapQ、NapS、NapT、NapI) 编码的蛋白负责催化前体分子β -羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸的生物合成； 4个基因(NapA、NapU、NapW、NapV)编码的甲基化酶和氧化还原酶催化分子骨架的进一步修饰；1个基因NapX编码的Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)特异性地活化独特的
ACP-NapC ;还包括 2 个调节基因(NapR3、NapR5)、3 个抗性基因(NapRl、NapR2、NapR4)
及4个功能不确定的基因(NapF、NapG> NapK> NapP)。本发明还提供了一个编码紫外修复蛋白的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为NapRl，其基因的核苷酸序列位于序列I中第9795. . 12287碱基处。本发明还提供了一个编码整合膜蛋白的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为NapR2，其基因的核苷酸序列位于序列I中第13593. . 12328碱基处。本发明还提供了一个编码FAD依赖的单氧化酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为NapA，其基因的核苷酸序列位于序列I中第15084. . 13606碱基处。本发明还提供了一个编码丙酮酸脱氢酶α亚基的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为NapB，其基因的核苷酸序列位于序列I中第15380. . 16396碱基处。本发明还提供了一个编码酰基载体蛋白的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为NapC，其基因的核苷酸序列位于序列I中第16384. . 16641碱基处。本发明还提供了一个N端编码丙酮酸脱氢酶β亚基、C端编码丙酮酸脱氢酶系Ε2亚单位的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为NapD，其基因的核苷酸序列位于序列I中第16638. . 18812碱基处。本发明还提供了一个编码III型聚酮合成酶的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为NapE，其基因的核苷酸序列位于序列I中第18908. . 19912碱基处。本发明还提供了一个编码吲哚丙酮酸铁氧化还原酶α亚基的核苷酸序列， 由序列19中的氨基酸序列组成，命名为NapF，其基因的核苷酸序列位于序列I中第 19980. · 20492 碱基处。本发明还提供了一个编码肽酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为NapG，其基因的核苷酸序列位于序列I中第23053. . 20600碱基处。本发明还提供了一个编码AfsR家族转录调节因子的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为NapR3，其基因的核苷酸序列位于序列I中第25022. . 23034碱基处。本发明还提供了一个N端编码一个氧化还原酶、C端编码只包含A非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为NapH，其基因的核苷酸序列位于序列I中第27840. . 25201碱基处。本发明还提供了一个编码非血红素依赖的氨基酸羟基酶的核苷酸序列， 由序列23中的氨基酸序列组成，命名为NapI，其基因的核苷酸序列位于序列I中第 28925. · 27921 碱基处。本发明还提供了一个编码包括C、A、PCP、RE非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列24中的氨基酸序列组成，命名为NapJ，其基因的核苷酸序列位于序列I中第 33451. · 28997 碱基处。本发明还提供了一个编码MbtH类似蛋白的核苷酸序列，由序列25中的氨基酸序列组成，命名为NapK，其基因的核苷酸序列位于序列I中第33684. . 33487碱基处。本发明还提供了一个编码包括C、A、PCP非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列26中的氨基酸序列组成，命名为NapL，其基因的核苷酸序列位于序列I中第 36837. · 337301 碱基处。本发明还提供了一个编码II型硫酯水解酶TE的核苷酸序列，由序列27中的氨基酸序列组成，命名为NapM，其基因的核苷酸序列位于序列I中第37607. . 36834碱基处。本发明还提供了一个编码非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列28 中的氨基酸序列组成，命名为NapN，其基因的核苷酸序列位于序列I中第37940. . 39919碱基处。本发明还提供了一个编码包括C、A、PCP、C、A、PCP、C、A、PCP非核糖体聚肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列29中的氨基酸序列组成，命名为NapO，其基因的核苷酸序列位于序列I中第39989. · 49285碱基处。本发明还提供了一个编码未知功能蛋白的核苷酸序列，由序列30中的氨基酸序列组成，命名为NapP，其基因的核苷酸序列位于序列I中第49345. . 50070碱基处。本发明还提供了一个编码5-甲基-O-甲基-酪氨酸-3-羟化酶的核苷酸序列，由序列31中的氨基酸序列组成，命名为NapQ，其基因的核苷酸序列位于序列I中第 50164. · 51219 碱基处。
5
本发明还提供了一个编码甲基化酶的核苷酸序列，由序列32中的氨基酸序列组成，命名为NapS，其基因的核苷酸序列位于序列I中第51387. . 52451碱基处。本发明还提供了一个编码甲基化酶的核苷酸序列，由序列33中的氨基酸序列组成，命名为NapT，其基因的核苷酸序列位于序列I中第52611. . 53657碱基处。本发明还提供了一个编码转运蛋白的核苷酸序列，由序列34中的氨基酸序列组成，命名为NapR4，其基因的核苷酸序列位于序列I中第53803. . 55392碱基处。本发明还提供了一个编码氧化还原酶的核苷酸序列，由序列35中的氨基酸序列组成，命名为NapU，其基因的核苷酸序列位于序列I中第55718. . 57340碱基处。本发明还提供了一个编码甲基转移酶的核苷酸序列，由序列36中的氨基酸序列组成，命名为NapV，其基因的核苷酸序列位于序列I中第57685. . 58527碱基处。本发明还提供了一个编码编码短链脱氢酶的核苷酸序列，由序列37中的氨基酸序列组成，命名为NapW，其基因的核苷酸序列位于序列I中第59620. . 58685碱基处。本发明还提供了一个编码Sfp型PPTase的核苷酸序列，由序列38中的氨基酸序列组成，命名为NapX，其基因的核苷酸序列位于序列I中第60785. . 60126碱基处。本发明还提供了一个编码MerR家族转录调节因子的核苷酸序列，由序列39中的氨基酸序列组成，命名为NapR5，其基因的核苷酸序列位于序列I中第61771.. 61106碱基处。序列I的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列I的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列I中DNA序列的重组DNA 质粒的途径。本发明还提供了产生萘啶霉素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列I中的核苷酸序列。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与NPT 生物合成基因相似的基因。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces lusitanus NRRL8034基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有Streptomyces lusitanus NRRL8034基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling),或通过紫外线或化学试剂诱变等。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成β_羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸、3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸及NPT聚肽骨架，进一步催化合成抗生素NPT及其结构类似物。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断NPT生物合成的一个或几个步骤而得到新的NPT结构类似物或前体。包含DNA 片段或基因可以用来提高NPT或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。包含本发明所提供的非核糖体聚肽合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的非核糖体聚肽合成酶系统的一个或多个非核糖体聚肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体聚肽合成酶库或非核糖体聚肽合成酶衍生库或组合库。本发明所提供的成β -羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸、3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸生物合成基因可用于合成NPT家族独特的 β -羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸、3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸和5-甲基-O-甲基酪氨酸及其他酪氨酸类似物。本发明所提供的NPT骨架的后修饰基因提供了通过遗传修饰得到类似物的途径， 所包含的氧化还原反应也可有其他应用。总之，本发明所提供的包含萘啶霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解萘啶霉素家族乃至四氢异喹啉生物碱家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
图I :Α、萘唳霉素(Naphthyridinomycin, NPT)及其类似物；B、番红霉素 (Saframycin, SFM)、番红菌素(Safracin, SAC)、Et743 的化学结构式图2 :萘啶霉素生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶谱。(A)4个交叠的黏粒代表了相应链霉菌基因组已测序的92. 6kbDNA区域，B代表限制性内切酶BamH I ; (B)全部测序黏粒的位置与序列关系；(C)蔡唳霉素生物合成基因族的基因组成。图3 :萘啶霉素与番红霉素生物合成基因簇的对比图4 :萘啶霉素各组成单元可能的生物合成途径。㈧二碳起始单元；⑶酪氨酸前体衍生物；
图5 :萘啶霉素可能的生物合成途径图6 =NRPS相关基因置换突变菌株发酵产物的高效液相-质谱联用(LC-MS)分析 A0 :野生型发酵产物；A :NapH基因置换的突变体发酵产物；B :NapJ基因置换的突变体发酵产物；C :NapL基因置换的突变体发酵产物；D :NapM基因置换的突变体发酵产物；E :NapN基因置换的突变体发酵产物；F :NapO基因置换的突变体发酵产物图7 :前体及上下游边界相关基因置换突变菌株发酵产物的高效液相(HPLC)分析A :WT，野生型发酵产物；B =ANapS,酪氨酸前体相关napS基因置换突变株发酵产物；C ΛNapT，酪氨酸前体相关napT基因置换突变株发酵产物；D : △ NapI，酪氨酸前体相关napl 基因置换突变株发酵产物；E =ANapB, 二碳单元前体相关napB基因置换突变株发酵产物； F : ΛNapD，二碳单元前体相关napD基因置换突变株发酵产物；G : Λ orf (-1)，基因簇上游边界orf (-1)基因置换突变株发酵产物；H : Λ orf I，基因簇下游边界orfl基因置换突变株发酵产物；图8 :NRPS相关基因的功能分析:A腺苷化结构域保守区域和底物识别相关核心氨基酸残基分析缩合结构域和肽酰载体蛋白保守区域分析；CTEII功能分析图9 :萘啶霉素生物合成基因在大肠杆菌中的表达泳道1，蛋白分子量标准，泳道2，重组蛋白。(A)NapL，(B)NapN, (C)NapB, (D)NapE, (E)NapI，F)NapQ0图10 :链霉菌S. lusitanus NRRL8034野生型菌株及napV基因置换突变菌株发酵产物的高效液相-质谱联用(LC-MS)分析A :质谱特征峰检测，I :野生型菌株发酵产物m/z = 418. 2离子峰检测，表征萘啶霉素[M+H]+ ；11 :甲基转移酶napV基因置换突变株发酵产物(ANapV)m/z = 404. 2离子峰
检测，表征萘唳霉素类似物-cyanocycline B [M+H]+ ；B :野生型菌株的萘唳霉素质谱信
号；C :突变株中萘啶霉素类似物cyanocycline B的质谱信号。符号说明
图I
Naphthyridinomycin :萘唳霉素；cyanocline :氰基化萘唳霉素衍生物；
bioxalomycin :萘唳霉素衍生物；Saframycin :番红霉素；Saffacin :番红菌素；
Ecteinascidin :海鞘素。
图2
cPC072104, cPC092102，3B3，6G10，10H9 :测序相关黏粒；数字标记基因表示边界之外。
图3
sfmsafrmycin ；nap :Naphthyridinomycin。
图4
ACP酰基载体蛋白；KS :酮基合酶。
图5
PCP肽酰载体蛋白；c :缩合酶；A :腺苷化酶；X :未知功能结构域；Re :末端还原酶；KS:酮基合酶。
图6
8
①[M+H]+ = 418. 2(萘啶霉素)；@:[M+H]+ = 402. I (萘啶霉素类似物——
bioxalomycin α 2) ; [M+H] + = 404. I (萘卩定霉素类似物·-cyanocycline B) [M+H] +
=400. I (萘唳霉素类似物-bioxalomycin β 2)图8PCP :肽酰载体蛋白；C :缩合酶;A :腺苷化酶；TE II型硫酯酶
具体实施例方式以下结合图I-图10对本发明进一步详细说明。I.克隆蔡唳霉素的生物合成基因族萘啶霉素的前体标记实验证明，萘啶霉素腈基取代物的并环骨架主要来自于
三种氨基酸-L-tyrosine (酪氨酸),D、L-ornithine (鸟氨酸),glycine (甘氨酸):。Pospiech等通过转座子插入失活的方法克隆到来源于粘细菌Myxococcus xanthus的四氢异喹啉家族类生物碱SFM-Mxl 18 kb的部分生物合成基因，表明其中含有两个非核糖体聚肽合成酶(NRPS)和一个O-甲基转移酶，证明SFM-Mxl 的生物合成是采用 NRPS 机理[Microbiol. (1995) 141,1793-1803 ；Microbiol. (1996) 142， 741-746]。最近来源于突光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2的化合物番红菌素 B(SAC-B)生物合成基因簇的克隆和分析表明SAC-B的生物合成也是采用NRPS机理[Mol. Microbiol. (2005)56,144-154];李磊博士克隆得到番翻红霉素A (SFM-A)生物合成基因簇的分析结果也显示SFM-A的生物合成同样是采取了 NRPS机理[J Bacteriol 2008，190， 251-63]。这些研究为克隆萘啶霉素的生物合成基因提供了极为重要的信息。我们推测萘啶霉素的生物合成可能也是采用NRPS机理。因此克隆策略就是从克隆NRPS基因入手。典型NRPS是以模块形式存在的多功能酶，每一模块含有一套独特的，非重复使用的催化功能域，即催化功能域与产物合成顺序是一一对应的(图2A)。我们基于已有的一些化合物和四氢异喹啉家族类化合物的生物合成序列A功能域分别设计了 NRPS通用引物和特异性引物，希望得到相关的NRPS基因片断，但是，很可惜并没有得到相应可能的NRPS基因片段。于是，我们采用兼并性引物(5，-TACACG TCC GGC ACS ACS GGC AAR CCN AAR GGHP5’-AW CGA GKS GCC GCC SRR GSM GAA GAA-3’)对基因文库进行 PCR 筛选的方法
得到了相应的阳性黏粒。进一步的端基和亚克隆测序的结果显示，相应黏粒中很有可能包含了萘啶霉素生物合成相关基因。基因中断实验结果也证实相应基因中断突变菌株完全丧失了产生萘啶霉素的能力，说明黏粒包含的基因是与萘啶霉素的的生物合成相关的。2.萘啶霉素的生物合成基因簇的功能分析通过染色体步移的方法，本发明成功地克隆到了包含萘啶霉素生物合成基因簇信息的相关黏粒。结合克隆测序，获得了可能与萘啶霉素生物合成相关的一段连续核苷酸序列，共92，587bp，G+C含量为72. 81%，与链霉菌基因组G+C含量一致。使用基因簇序列同源性在线分析软件 FramePlot 4. Obeta (http: //nocardia. nih. ro. jp/fp4/),对所获得的 92，587bp核苷酸序列进行的分析发现了 54个orf和I个不完整的orf。目的蛋白氨基酸序列同源性分析是使用美国国家生物信息中心提供的Blast搜索引擎(http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/blast/)。序列中各个基因对应的核苷酸位置和编码蛋白功能的生物信息学分析结果如表I所示。
表I :全序列功能分析
蛋白名称位置起始-终止bp氨基酸数目相似蛋白同一性/ 相似性％认为的功能orf (-11)12..1103363PaaA(CAJ89356.1)89/92乙酸苯酯辅酶A氧化酶20120216orf (-10)1100..1411103PaaB(CAJ89355.1)90/94乙酸苯酯辅酶A氧化酶orf (-9 )1395..2213272PaaC(CAJ89354.1)80/84苯乙酸降解蛋白orf (-8)2210..2722170PaaD(CAJ89353.1)84/86苯乙酸降解蛋白
权利要求
1.一种抗肿瘤活性的抗生素-萘啶霉素的生物合成基因簇，其特征在于所述的基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的萘啶霉素生物合成基因簇，其特征在于编码的非核糖体聚肽合成酶包含模块或结构域肽酰缩合酶结构域C、腺苷化酶结构域A、肽酰基载体蛋白PCP、 端基还原酶结构域RE。
3.一种根据权利要求I所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于所述的基因簇用于编码蛋白催化合成抗生素萘啶霉素。
4.根据权利要求3所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于所述的基因簇用于编码蛋白催化合成3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸或β_羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基酪氨酸。
5.根据权利要求3所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于所述的基因簇用于编码蛋白催化合成四氢异喹啉生物碱核心骨架结构。
6.根据权利要求3所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于对所述的基因簇进行遗传改造获得的突变体经生物发酵获得萘啶霉素的类似物。
7.根据权利要求3所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于所述的基因簇中的NRPS基因NapH、NapJ, NapL, NapN在大肠杆菌中获得了异源表达，经分离纯化得到的重组蛋白NapL、NapN。
8.根据权利要求3所述的萘啶霉素生物合成基因簇的用途，其特征在于所述的基因簇中的特殊二碳起始单元生物合成基因NapB、NapC, NapD, NapE ;前体分子合成基因NapQ、 NapI ;氧化还原酶基因NapA ;环合酶基因NapU、NapW均在大肠杆菌中获得异源表达，经分离纯化得到的重组蛋白NapB、NapE> NapI、NapQ。
全文摘要
本发明是由一种萘啶霉素的生物合成基因簇，是链霉菌产生的具有抗肿瘤活性的四氢异喹啉生物碱家族类抗生素。整个基因簇共包含28个基因6个非核糖体聚肽合成酶相关基因；4个前体分子β-羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸合成基因；4个特殊二碳起始单元生物合成基因；2个肽骨架环合相关基因；2个后修饰基因；2个调节基因；3个抗性基因；1个编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶相关基因；4个功能不确定的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断萘啶霉素的生物合成或产生结构类似物。该基因簇可用于四氢异喹啉生物碱家族化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。
文档编号C12N9/00GK102586290SQ20121003540
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者唐功利, 彭超, 浦津越 申请人:中国科学院上海有机化学研究所