专利名称：一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用的制作方法
—种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用技术领域
本发明属于动物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。
背景技术：
朊蛋白类疾病(prion diseases),又叫传染性海绵状脑病(TransmissibleSpongiform Encephalopathies, TSE),是一类致命的中枢神经系统退行性疾病。该疾病的主要特点是神经细胞死亡、大脑空泡化以及伴随的星型胶质细胞增生等，这些将导致运动障碍、痴呆，最终导致患病动物的死亡。为大家比较熟悉的朊蛋白类疾病主要有:发生在绵羊和山羊上的羊搔痒病(scrapie)、发生在牛身上的牛海绵状脑病(BovineSpongiform Encephalopathy, BSE,即俗称的“疯牛病”)、以及发生在人身上的库鲁氏病(Kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD) >Gerstrnann-StraussIer-Sheinkerdisease (GSS)、致死性失眠综合症(fatal familial insomnia, FFI)、新型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD)等(参见 Prusiner SB:Prions.Proc NatlAcad Sci, USA 1998,95:13363-13383)。
目前己有很多证据表明，发生在牛身上的牛海绵状脑病可以通过一定途径传染给人，并在人身上引起一种新型的克雅氏病((vCJD)，由于朊蛋白类疾病至今仍然没有有效的治疗手段，该疾病到目前为止已经导致了大量的人员伤亡死亡，在全球范围内也引起恐慌，并导致数百万头牛羊被屠宰，造成了巨大的经济损失。
朊蛋白类疾病的病原体为PrPSG。PrPSG是细胞内正常表达的朊蛋白(PrPG)的异构体，PrPse异构体富含β_折叠，并具有抵抗蛋白酶消化的能力。当作为病原体的PrPse进入体内后，会引起PrPG转变成PrPs。，从而使PrPse得到增殖。
羊搔痒病是一种在绵羊或山羊身上自发产生的、可以在羊群之间互相传染的朊蛋白类疾病，也是第一个通过人工接种方法成功传播给啮齿类动物的朊蛋白类疾病，因而羊播库病常被用作 TSE 疾病研究的原型(Chandler R L:Encephalopathy in mice producedby inoculation with scrapie brain material.Lancetl961,1:1378-1379)。
RNA干扰(RNA interference,RNAi) 一种由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，是近年来发展起来的一项新技术。RNAi应用于哺乳动物细胞主要是通过体外合成小干扰RNA(siRNA)或体内表达·短发夹结构RNA(shRNAs)两种途径来完成。为了达到长期稳定的沉默效果，人们常通过构建shRNA表达载体转染细胞的方法抑制特定基因的表达。
但是本领域尚缺乏朊蛋白类疾病(尤其是羊搔痒病)防治的方法，也没有有效针对内源朊蛋白基因序列的RNA干扰分子和shRNA表达载体。因此本领域迫切需要开发PrP基因靶向的干扰RNA和表达载体，从根本上杜绝朊蛋白类疾病的发生。发明内容
本发明的目的就是提供一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种dsRNA构建物，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构:
Seq 正向-X-Seq 反向式 I
式中，
Seq正向为PrP基因或PrP基因片段；
Seqi^为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQ ID N0.:1_14任一所示。
在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQ ID N0.:4、SEQ ID N0.:9、SEQID N0.:11、或 SEQ ID N0.:13 所示。
在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为Ι-lOObp，较佳地为4-10bp。
在另一优选例中，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊、牛、猪、兔或鼠，较佳地来源于羊。
在另一优选例中，所述dsRNA构建物在宿主细胞中形成式II所示的dsRNA:
权利要求
1.一种dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构 Seq正向_x_Seq反向 式中， SeqMS PrP基因或PrP基因片段； 为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补。
2.如权利要求I所述的dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物在宿主细胞中形成式II所示的dsRNA
3.—种dsRNA，其特征在于，具有式II所示的结构
4.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求I所述的dsRNA构建物。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求4所述的表达载体或者染色体中整合有对应于权利要求I所述dsRNA构建物的DNA序列。
6.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求I所述的dsRNA构建物和/或权利要求3所述的dsRNA，以及动物喂食上可接受的载体。
7.权利要求I所述的dsRNA构建物，或权利要求3所述的dsRNA，或权利要求4所述的表达载体，或权利要求6所述组合物的用途，其特征在于，用于制备抑制非人哺乳动物中PrP基因表达的抑制剂。
8.一种制备dsRNA的方法，其特征在于，包括步骤 (i)制备表达dsRNA的构建物，所述构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构Seq正向_x_Seq反向 式中， SeqMS PrP基因或PrP基因片段； Seqfi^1为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补； ( )将步骤(i)所述的构建物转入宿主细胞，从而在宿主细胞中表达形成式II所示的dsRNA,
9.一种抑制非人哺乳动物中PrP基因表达的方法，其特征在于，包括步骤: 将权利要求4所述的表达载体转入所述动物细胞、组织、或器官中，从而在动物细胞、组织、或器官中形成权利要求3所述的dsRNA。
10.一种核酸序列的用途，所述核酸序列如SEQ ID N0.:1-14任一所示，其特征在于，所述核酸序列用于制备PrP基因表达抑制剂或用于制备PrP基因表达被抑制的非人哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。具体地，经过大量筛选，本发明人获得多个针对朊蛋白基因的特异siRNA序列，并构建了含所述siRNA序列的表达载体，将该载体转入宿主细胞，可以获得内源性朊蛋白被高效抑制的细胞株，该细胞株可降低对PrPsc病毒的易感性。用所述细胞株可以获得内源性朊蛋白被有效抑制的转基因动物。
文档编号C12N15/63GK103255142SQ201210039620
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者成国祥, 俞慧清, 陈建泉, 王学斌 申请人:上海转基因研究中心, 上海杰隆生物工程股份有限公司