专利名称：纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒。
背景技术：
鱼虾蟹贝和两栖爬行动物的病毒性疫病是严重威胁水生动物养殖业健康发展和物种多样性和环境生态安全的关键因素。如何能够高效能的从水生动物生活水体中吸附富集染疫水生动物排放到生活水体中的病毒颗粒用于实验室的疫病病原微生物检测，是一项非常有意义的工作。目前，水生动物疫病检测标准中规定的样品采集方法一般都是针对活体动物或濒死动物的组织脏器进行采样，然后研磨组织样品以后进行病毒的分离培养和病毒鉴定。如鲤春病，一般病鱼的初步诊断是根据病鱼外表特征与临床症状作出初步判断。 春季水温低于20°C时，养殖鲤易出现典型的SVC症状。有时鱼类大规模死亡时并无明显外表症状，需通过解剖观察内部器官典型症状。病料宜采集肝、肾、脾和脑。血液、脑病毒滴度不高，但持续时间最长，而鳃、血液和肠病料存在干扰物。OIE建议，幼鱼宜采集肾和脑病料为佳，较大鱼应采集肝肾、脾和脑组织为佳。实验室确诊可用EPC等敏感细胞培养分离病毒，然后采用病毒中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR等方法鉴定。上述方法可用于发病鱼或无症状染疫鱼检测。也可以采用免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验或PCR 等方法直接检测病料中的病原，但确诊须通过培养法分离病毒，以防假阳性。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法。该方法可以有效富集水生动物，例如鱼类、两栖类、爬行类动物生活水体中的水病毒(如鱼类和蛙病毒属病毒)，并能预扩增和保持富集的水病毒的活性，适用于渔场和野外水域中水病毒的监测和检测采样。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是
本发明提供一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法，该方法包括以下步骤
(1)将纳米富集材料加入到20L 30L水生动物生活水体中富集水病毒；
(2)对步骤(I)的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；
(3)将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；
(4)将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；
(5)加入磁铁，混匀后静置，使纳米磁珠吸在磁铁上；(6)取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中，病毒释放在保存液中，并在相应的敏感鱼类细胞系内进行预扩增。其中，所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体中水病毒的纳米富集材料I，该纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；或用于富集水生动物海水生活水体中水病毒的纳米富集材料II，该纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；
所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe3O4纳米磁珠；
所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，例如199细胞培养液、MEM细胞培养液、L15细胞培养液等；并且在细胞培养液中添加了相应的敏感鱼类细胞，青霉素(100U/ ML)、链霉素(O. lmg/ML)和制霉菌素(25U/ML)，并且调最终细胞培养液的pH为7. 5^8. 5。所述鱼类细胞为CO (Ovary of grass carp 草鱼性腺细胞)，EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞)，FHM(fathead minnow 胖头鱼肌肉细胞)，CLC (Carp leucocytes cell 鲤鱼白血球细胞)，CIK(kidney of grass carp 草鱼肾脏细胞)，CHSE (chinook salmon embryo 大菱大马哈鱼胚胎细胞)，CCO (Channel catfish ovary It鱼性腺细胞)，BF_2 (Bluegill fry 蓝太阳鱼觸细胞)，Rl (liver of rainbow trout 虹鳟鱼肝细胞)，RTG-2 (rainbow trout gonad虹鳟鱼性腺细胞)中的一种或几种。根据目的要富集和预繁殖的病毒种类选择相应的敏感细胞系。进一步地，步骤(I)中，富集水病毒的具体方法为将IOg 50g纳米富集材料加入到 20L 30L水生动物生活水体中，搅拌3min使之混匀，然后静置0. 5tT24h。进一步地，步骤(2)中，过滤时采用滤纸进行过滤。进一步地，步骤(3)中，所述病毒释放缓冲液为含有3%牛肉膏的0.05mol/L甘氨酸的水溶液，PH值为9. 5，所述沉淀物与病毒释放缓冲液的质量体积比为质量体积比为 Ig:I 5ml ο进一步地,步骤(4)中,所述纳米磁珠与上清液的质量体积比为lg:l、0ml。本发明还提供了一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒， 该试剂盒是由以下试剂组成
试剂A :纳米富集材料I，所述纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；
试剂B :纳米富集材料II，所述纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；
试剂C :滤纸；
试剂D :病毒释放缓冲液；
试剂E :纳米磁珠，所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe3O4纳米磁珠，分散性能良好，粉体饱和磁化强度为64-65emu/g,超顺磁性能良好；
试剂F :磁铁；
试剂G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，并且在细胞培养液中添加了相应的敏感鱼类细胞、100U/ML青霉素、0. lmg/ML链霉素和25U/ML制霉菌素，所述细胞培养液的PH为7. 5^8. 5。所述鱼类细胞为草鱼性腺细胞、鲤鱼上皮瘤细胞、胖头鱼肌肉细胞、鲤鱼白血球细胞、草鱼肾脏细胞、大菱大马哈鱼胚胎细胞、鲶鱼性腺细胞、蓝太阳鱼鳃细胞、虹鳟鱼肝细胞、虹鳟鱼性腺细胞中的一种或几种。所述病毒释放缓冲液为含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值为
9.5。本发明的有益效果
(I)本发明利用纳米材料对病毒颗粒高吸附性能，以及磁性纳米颗粒的磁性能有效地从水体中富集分离出一系列水病毒，例如鲤春病病毒、传染性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病病毒、流行性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、蛙病毒属病毒、鲑鱼传染性贫血症病毒、对虾白斑症病毒、对虾桃拉综合征病毒、黄头病病毒、传染性皮下和造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒病等。所述方法及试剂盒的应用能够替代采集活体水生动物送检实验室的工作，对水生动物个体没有损伤，减少了样品运输费用和剖检动物的工作量。降低了水生动物疫病在样品运输过程中造成的疫病流行的可能性。(2)本发明的水生动物病毒保存液可以达到将相应的病毒加入相应的敏感细胞系培养悬液中进行病毒预繁殖扩增的效果，以及保证水生动物病毒在长途运输中的活性的保护，以及防范细菌和真菌污染的措施，较高的pH值可以保证病毒从磁珠上的释放效果和防范培养液PH值下降带来的病毒降解的可能。具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I纳米富集材料的制备
所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体中水病毒的纳米富集材料I，该纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土(型号TP950)和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；或用于富集水生动物海水生活水体中水病毒的纳米富集材料II，该纳米富集材料II 是由滑石粉、硅藻土 (型号TP950)和商品化的固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成。通常在富集20L-30L生活水体中的病毒时，加入10g^50g的上述纳米富集材料。实施例2纳米磁珠的制备
本发明所述的Fe3O4纳米磁珠可以通过现有技术公开的方法来制备，但为了获得更好的富集效果，本发明在此提供一种优选的制备方法。I.准确称取FeCl3 · 6H20 21. 6g，FeCl2 · 4H20 9. 95g，将二者混合，加去离子水溶于500 ml容量瓶中，配置成一定浓度的铁盐溶液。2.准确称取NaOH 20g,加蒸馏水溶于500ml容量瓶中，配置成lmol/L的NaOH溶液。3.将上述两种溶液水浴加热至70°C，保温。4.取IOOmlNaOH溶液置于1200ml烧杯中，水浴锅中加热，温度保持在70°C，并且进行机械搅拌，搅拌速率为200 r/rnin,用pH计实时监测溶液pH。5.用两支酸式滴定管分别滴加铁盐溶液和NaOH溶液，调整酸式滴定管开关，使铁盐溶液的滴加速度为O. lml/s.根据反应溶液的pH变化，调整NaOH溶液的滴加速度，使整个反应过程中溶液PH保持在11 士 O. 2。
6.待铁盐溶液或NaOH溶液任何一种滴加完毕，则立刻终止反应。7.停止搅拌和水浴，将反应所得悬浊液置于永磁体上，在磁场条件下进行洗涤和分离。8.洗涤6-8次(约)后，向残液中滴加硝酸银溶液，若无白色沉淀产生，则证明产物己经洗涤干净。9.将沉淀物置于表面皿中放入真空干燥箱进行干燥，干燥温度为70°C，干燥时间为8 h.
10.待干燥箱中温度降至室温后，取出干燥粉体，研磨，既得Fe3O4纳米磁珠，其分散性能良好，粉体饱和磁化强度为64-65emu/g,超顺磁性能良好。实施例3纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒的组成及使用
试剂A :纳米富集材料I，所述纳米富集材料I是50g由滑石粉、硅藻土 (型号TP950)和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；共70g。试剂B :纳米富集材料II，所述纳米富集材料II是50g由滑石粉、硅藻土 (型号 TP950)和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；共7(^。试剂C :滤纸；直径9cm的快速定性滤纸。试剂D :病毒释放缓冲液，所述缓冲液为含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH 值为 9.5 ; 100ml。试剂E :纳米磁珠，所述纳米磁珠为粒径10_12nm的Fe3O4纳米磁珠，分散性能良好，粉体饱和磁化强度为64-65emu/g,超顺磁性能良好；lg。试剂F :磁铁，直径lcm。试剂G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的199细胞培养液，并且在该细胞培养液中添加了铺满瓶底80%以上的鱼类细胞，青霉素(100U/ML)、链霉素(O. lmg/ML)和制霉菌素(25U/ML)，调最终细胞培养液的pH为8. 5左右。根据目的要富集和预繁殖的病毒种类选择相应的敏感鱼类细胞系。例如C0(0vary of grass carp 草鱼性腺细胞),EPC(Epithelioma Papulosum Cyprini鲤鱼上皮瘤细胞)， FHM (fathead minnow 胖头鱼肌肉细胞)，CLC (Carp leucocytes cell 鲤鱼白血球细胞)， CIK(kidney of grass carp 草鱼肾脏细胞)，CHSE (chinook salmon embryo 大菱大马哈鱼胚胎细胞)，CCO (Channel catfish ovary It鱼性腺细胞)，BF-2 (Bluegill fry 蓝太阳鱼觸细胞)，Rl (liver of rainbow trout 虹蹲鱼肝细胞)，RTG-2 (rainbow trout gonad虹鳟鱼性腺细胞)。利用本发明试剂盒富集水生动物生活水体中水病毒的具体方法
(1)先将50g纳米富集材料I或II加入20L 30L水生动物生活水体中，搅拌3min使之混匀；然后常温静置0. 5tT24h;
(2)再轻轻搅匀上述经过吸附的生活水体，通过漏斗用滤纸进行粗过滤，得到沉淀物；
(3)将沉淀物放入50ml病毒释放缓冲液中，混匀后静置10min，得到上清液；
(4)将上清液与Ig纳米磁珠混匀，静置lOmin，使病毒吸附在纳米磁珠上；
(5)加入磁铁，颠倒混匀后，静置5min，使纳米磁珠吸在磁铁上；
(6)取出磁铁，将磁铁放入20ml的病毒活性保存液中即可。在4°C条件下保存液中的病毒活性可至少保持10天，冷冻条件下保存液中的病毒活性至少可以保存I年。实施例4大体积水生动物生活水体中水病毒的检测及结果分析 I、淡水大体积生活水体中水病毒的检测及结果分析
1.I模拟添加病毒检测富集试剂盒的效果在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入 ImLSVCV细胞培养悬液(其TCID5tl为I. O X 10_6)中，充分均匀搅拌，然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行TCID5tl测试，结果为1.0X10'I. 2添加I尾注射感染SVCV鲤鱼后病毒检测富集试剂盒的效果在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入I尾注射感染SVCV的鲤鱼，控制水温在15°C左右，养殖10天，充分均匀搅拌水样，然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行TCID5tl测试，结果为I. OX 10_3。I. 3添加I尾注射感染SVCV鲤鱼，4尾正常鲤鱼后检测富集试剂盒的效果在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入I尾注射感染SVCV的鲤鱼，4尾正常鲤鱼，控制水温在15°C 左右，养殖10天，循环水泵充分均匀搅拌水样，然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行TCID5tl测试，结果为 I. 0X10'、海水大体积水生动物生活水体中水病毒的检测及结果分析
2.I模拟添加病毒检测富集试剂盒的效果在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入ImL 病毒性出血性败血症病毒(VHSV)细胞培养悬液(其TCID5tl为I. OX 10_6)中，充分均匀搅拌， 然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行TCID5tl测试，结果为I. OX 10_2。I. 2添加I尾注射感染VHSV大菱鲆后病毒检测富集试剂盒的效果在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入I尾注射感染VHSV的大菱鲆，控制水温在15°C以下，养殖10天， 充分均匀搅拌水样，然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3， 直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行TCID5tl测试，结果为I. OX 10_3。I. 3添加I尾注射感染VHSV的大菱鲆，4尾正常大菱鲆后检测富集试剂盒的效果 在静态观赏鱼养殖水族箱1000L水加入I尾注射感染VHSV的大菱鲆，4尾正常大菱鲆，控制水温在15°C以下，养殖10天，循环水泵充分均匀搅拌水样，然后取20L水样，利用本试剂盒进行病毒的富集，富集方法同实施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC细胞进行 TCID5tl测试，结果为1.0X10'显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)将纳米富集材料加入到20L 30L水生动物生活水体中富集水病毒；(2)对步骤(I)的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；(3)将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；(4)将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；(5)加入磁铁，混匀后静置，使纳米磁珠吸在磁铁上；(6)取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中；其中，所述纳米富集材料为用于富集水生动物淡水生活水体中水病毒的纳米富集材料 I，该纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成； 或用于富集水生动物海水生活水体中水病毒的纳米富集材料II，该纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；所述纳米磁珠为粒径10-12nm的Fe3O4纳米磁珠；所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，并且在细胞培养液中添加了鱼类细胞、100U/ML青霉素、O. lmg/ML链霉素和25U/ML制霉菌素，所述细胞培养液的pH为7.5 8. 5o
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，富集水病毒的具体方法为将 IOg 50g纳米富集材料加入到20L 30L水生动物生活水体中，搅拌3min使之混匀，然后静置O. 5h 24h。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，过滤时采用滤纸进行过滤。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述病毒释放缓冲液为含有 3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值为9. 5，所述沉淀物与病毒释放缓冲液的质量体积比为Ig: I 5ml。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述纳米磁珠与上清液的质量体积比为Ig: I 50mlO
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述鱼类细胞为草鱼性腺细胞、鲤鱼上皮瘤细胞、胖头鱼肌肉细胞、鲤鱼白血球细胞、草鱼肾脏细胞、大菱大马哈鱼胚胎细胞、鲶鱼性腺细胞、蓝太阳鱼鳃细胞、虹鳟鱼肝细胞、虹鳟鱼性腺细胞中的一种或几种。
7.—种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由以下试剂组成试剂A :纳米富集材料I，所述纳米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:1混合制成；试剂B :纳米富集材料II，所述纳米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固体安全酸按照质量比为10:3:2混合制成；试剂C :滤纸；试剂D :病毒释放缓冲液；试剂E :纳米磁珠,所述纳米磁珠为粒径10-12nm的纳米磁珠；试剂F :磁铁；试剂G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液为含2%小牛血清的细胞培养液，并且在细胞培养液中添加了鱼类细胞、100U/ML青霉素、O. lmg/ML链霉素和25U/ML制霉菌素，所述细胞培养液的PH为7. 5 8. 5。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述鱼类细胞为草鱼性腺细胞、鲤鱼上皮瘤细胞、胖头鱼肌肉细胞、鲤鱼白血球细胞、草鱼肾脏细胞、大菱大马哈鱼胚胎细胞、鲶鱼性腺细胞、蓝太阳鱼鳃细胞、虹鳟鱼肝细胞、虹鳟鱼性腺细胞中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒释放缓冲液为含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值为9. 5。
全文摘要
本发明公开了一种纳米吸附富集大体积水生动物生活水体中水病毒的方法及试剂盒。所述方法包括以下步骤(1)将纳米富集材料加入到20L~30L水生动物生活水体中富集水病毒；(2)对步骤(1)的水生动物生活水体进行粗过滤，得到沉淀物；(3)将沉淀物放入病毒释放缓冲液中，混匀后静置，得到上清液；(4)将上清液与纳米磁珠混匀，静置，使病毒吸附在纳米磁珠上；(5)加入磁铁，混匀后静置，将纳米磁珠吸在磁铁上；(6)取出磁铁，将磁铁放入病毒活性保存液中。本发明可以有效富集水体中的水病毒，并能预扩增和保持富集的水病毒的活性，适用于渔场和野外水域中水生动物生活水体中水病毒的监测和检测采样。
文档编号C12N7/02GK102586197SQ201210059499
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者张利峰, 张旻, 张雷, 王姝, 高隆英 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局