专利名称：一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测和/或鉴定分枝杆菌菌种的方法和试剂盒，属于医学分子生物学诊断技术领域。
背景技术：
结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1/3有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染,是全世界感染性疾病中的第一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44. 5%，全国约5. 5亿人受到结核菌感染。同时，非结核分枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势，2000年，卫生部组织的调查数据显示，NTM菌株分离率上升至11. 1%, NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。大量研究及临床治疗病例表明非结核分枝杆菌对大多数一线抗结核药物具有天然耐药性，采用目前标准的化疗方案治疗无效。目前，非结核分枝杆菌病通常依据传统的分枝杆菌菌种鉴定来确诊，然而，传统的分枝杆菌菌种鉴定繁琐、费时，需I 2个月的时间，不能满足临床开展早期有效治疗的需要，使非结核分枝杆菌病人通常被作为结核病人按常规治疗，病人经长期常规治疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治病人，细菌在局部播散。因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定对结核病和非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效治疗和控制传播都有重要意义。传统诊断临床标本的分枝杆菌感染是基于镜下抗酸染色，进而特殊培养及生化实验鉴定菌种，最后检测药物敏感性。抗酸染色只能鉴别属与属外的特征，且只有在标本带菌量在104/ml以上时才能看见。由于多数分枝杆菌生长缓慢，鉴别到种的水平需要耗时4 8周，且影响因素多，重复性差。近年来，一直在开发于基因水平鉴定分枝杆菌菌种的技术，主要是利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。目前利用PCR鉴定分枝杆菌菌种的方法主要是通过PCR扩增目标片段后，通过膜杂交或基因芯片检测，但这些方法普遍存在一些问题，不适合在临床上开展。(I)PCR菌种鉴定法。用各种分枝杆菌特异性引物对标本DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩增产物所产生的特异性片段进行鉴定；或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌种特异的内部引物进行巢氏扩增鉴定。该法灵敏、快速，但目前能够鉴定的菌种尚不多，主要有结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，而且鉴定未知的感染菌，需采用一系列种特异性引物进行扩增。(2)PCR-直接测序鉴定法。用分枝杆菌属特异的引物对标本的16SrRNA或16S-23S rRNA间隔区序列或65kD或32kD抗原基因进行PCR扩增，然后直接测定扩增产物的核苷酸序列，比较其核苷酸的差异来鉴定菌种。但该方法无法鉴别少数分枝杆菌，而且技术要求高，需昂贵的特殊仪器，而难以推广。(3)PCR-DNA探针鉴定法用分枝杆菌属特异的引物对标本中分枝杆菌16S或16S-23S rDNA进行扩增，然后与各种分枝杆菌特异的寡核苷酸探针进行反向、斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌种。该法较灵敏、快速，但目前只能鉴定部分菌种。(4)PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定法。PCR-RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对标本中分枝杆菌65KD蛋白编码基因、16S或16-23S rDNA进行扩增，然后用不同的限制性内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种。目前只能鉴定部分菌种，重复性还不够理想。(5)PCR-基因芯片鉴定法。基因芯片技术是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法。但这种方法操作复杂，易造成交叉污染，所需的点样系统和荧光分析系统昂贵，而难以推广应用。近年来出现的实时突光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。本发明利用荧光定量PCR技术平台结合双标记探针熔解曲线技术进行分枝杆菌菌种鉴定，实现了快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌种鉴定的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌种鉴定的方法，以及利用所述方法同时鉴定多种分枝杆菌菌种的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案本发明所述方法的基本原理为基于荧光定量PCR技术平台，结合多重不对称PCR技术和熔解曲线技术，并运用多个荧光检测通道在一个PCR反应中检测多种不同荧光标记的探针与扩增产物所形成的熔解峰，利用熔解峰所示的Tm值来鉴定分枝杆菌菌种。一方面，本发明提供了一种用于鉴别临床常用分枝杆菌的鉴别试剂I，其中包括两对引物和三条探针，所述两对引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBrightl和TBright2，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 所示，所述三条探针TBProbeI、TBProbe2、TBProbe3的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID N0:15所示。在本发明中，所述的“临床常见分枝杆菌”是指临床上常见的分枝杆菌，包括但不限于结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M. scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M. simiae)、胃分枝杆菌(M. gastri)、海分枝杆菌(M. marmum)、溃瘍分枝杆菌(M. ulcerans)、不产色分枝杆菌(M. nonchromogenicum)、爱知分枝杆菌(M. aichiense)、鸟分枝杆菌(M. avium)、迪氏分枝杆菌(M. diernhoferi)、次要分枝杆菌(M. triviale)、偶然分枝杆菌(M. fortuitum)、土地分枝杆菌(M. terrae)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M. xenopi)、龟分枝杆菌龟亚种(M. chelonae subsp. chelonae)、龟分枝杆菌胺肿亚种(M. chelonae subsp.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)、抗热分枝杆菌(M. thermoresistibile)、田野分枝杆菌(M. agri)、母牛分枝杆菌(M. vaccae)、草分枝杆菌(M. phlei)。在本发明的一个具体实施方案中，所述三条探针TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端分别用报告荧光染料FAM、HEX、ROX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQl或BHQ2
T 己 O、
另一方面，本发明提供了一种用于鉴别临床常用分枝杆菌的鉴别试剂II，其中包括四对引物和三条探针，所述四对引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分别如 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO -J、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12所示，所述三条探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18所
/Jn ο在本发明的一个具体实施方案中，所述三条探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端分别用报告荧光染料FAM、ROX、HEX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQl或BHQ2标记用本发明所述鉴定试剂I进行多重不对称荧光定量PCR。实验证明，根据荧光颜色和熔解曲线中Tm值的不同，本发明所述的鉴定试剂I能够鉴别分枝杆菌属中的结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌、爱知分枝杆菌、田野分枝杆菌、草分枝杆菌、母牛分枝杆菌、耻垢/抗热分枝杆菌。在本发明中，表述菌种鉴定结果时使用的“/”表示“或”的意思，例如“耻垢/抗热分枝杆菌”意指菌株可鉴定为耻垢分枝杆菌或抗热分枝杆菌，排除二者之外的其他分枝杆菌，可视需要进一步鉴定获知所述菌株确切是耻垢分枝杆菌还是抗热分枝杆菌。在使用本发明所述鉴定试剂I鉴定后，进一步用本发明所述的鉴定试剂II进行多重不对称荧光定量PCR。根据荧光颜色和熔解曲线中Tm值的不同，本发明所述的鉴定试剂II能够将分枝杆菌属中海分枝杆菌、溃瘍分枝杆菌、堪萨斯/胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、鸟分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、次要分枝杆菌、偶然分枝杆菌、土地分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种区分开来。因此，本发明提供了一种用于鉴定临床常见分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒包括所述鉴别试剂I，即包括两对引物和三条探针，所述两对引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBrightl 和 TBright2，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示，所述三条探针TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQID NO 15 所示。所述试剂盒还可以进一步包括所述鉴定试剂II，即鉴别试剂II，其中包括四对引物和三条探针，所述四对引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 所示，所述三条探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18所示。本发明所述试剂盒，还可以进一步包括核酸序列扩增所需的其它各种试剂，包括但不限于DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等，其中DNA聚合酶优选为热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整，其可以是但不限于是aTaq 酶。另一方面，本发明还提供了一种鉴定临床常见分枝杆菌的方法，该方法包括
(I)样本处理及DNA提取；(2)配制PCR反应体系；(3)在荧光定量PCR仪上PCR扩增靶序列；(4)PCR扩增结束后,进行熔解曲线(Melting curve)分析。本发明中，步骤(I)中所述的样本包括但不限于痰液、病理组织切片或细菌培养物。在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为痰液，所述样本处理及DNA提取包括取痰液2ml，加入2. 5倍体积4% Na0H，37°C温育30min。将液化后的痰液，离心，去上清，向沉淀中加入裂解液100 μ I,沸水中煮lOmin, 4°C下12000rpm离心IOmin,取上清液进行检测或_20°C储存备用。在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为病变组织切片，所述样本处理及DNA提取包括取病变组织切片2-5片加入I. 5ml离心管中，向管中滴加300 μ I提取液，100°C煮沸IOmind11C下12000rpm离心IOmin,取上清液进行检测或_2(TC储存备用。在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为细菌培养物，所述样本处理及DNA提取包括取经培养后临床样本分离株，高温灭活，用溶菌酶和蛋白酶K处理后，再用苯酚/氯仿提取DNA。将获得的基因组DNA直接用于菌种鉴定检测或_20°C储存备用。本发明中，步骤(2)配制的PCR反应体系优选使用一种热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整。另外，所加各引物对的上游弓I物和下游引物浓度不同。扩增探针互补链的引物的浓度高于与之配对的另一条引物浓度。一对PCR引物浓度的比例为不超过2 1，或者不超过3 1，或者不超过4 1，或者不超过5 1，最佳的PCR引物浓度比例取决于具体的实验。在本发明的一个具体优选实施方案中，所配制的PCR反应体系为
成分浓度加入量
PCR缓冲液10倍浓缩2μ1
MgCl225mM1.6μ1
dNTPsIOmM0.4μ1
引物1(限制性引物)IOmMΟ. μ
引物 2IOmM0.6μ1
探针IOmM0.4μ1
aTaq DNA 聚合酶5υ/μ1Ο. μ
、 模板2μ1
无菌超纯水补足至20μ1通常，首先使用本发明所述的鉴定试剂I代替上述反应体系中的引物和探针。另外可能视情况需要在使用鉴定试剂I后，用本发明所述鉴定试剂II代替上述反应体系中的引物和探针配制PCR反应体系。本发明中，步骤(3)中PCR扩增所采用的程序为95°C预变性Imin ;40 50个循环 95 变性 6sec，58°C退火 30sec，72°C 延伸 10sec，58°C退火 15sec，72°C延伸 5sec ；95°C变性30sec ;40°C保温20sec ；40 85°C做熔解曲线分析，每步升温1°C，保温5 30sec，选择FAM、HEX、ROX通道检测荧光。PCR反应开始后，在最初的10 15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。在溶液中，双标记寡核苷酸探针未与靶序列杂交时通常呈“线团”状的单链构象，此时由于报告基团和猝灭基团距离很近，猝灭基团能够猝灭报告基团所发出的荧光。当探针与单链PCR产物退火形成双链时，由于报告基团的荧光不能够被猝灭，从而产生可以检测到的荧光信号，可以实时监测PCR反应。在本发明中，“报告基团”和“报告荧光染料”具有相同涵义，可交互使用，包括但不限于 FAM、ROX、HEX、JOE 等。 “猝灭基团”和“淬灭荧光染料”具有相同涵义，可交互使用，包括但不限于BHQ1、BHQ2、Eclipse、TAMRA 等。本发明中，步骤⑷中所述熔解曲线(Melting curve)分析是指，由于不同菌种的序列间存在区别，探针与不同菌种的序列杂交产生不同Tm值的熔解峰，用实际获得的Tm值与表I中Tm值比对,从而鉴定分枝杆菌菌种。表I中probe I、probe2和probe3是试剂I检测后各分枝杆菌菌种在3个检测通道中的Tm值；probe4、probe5和probe6是试剂II检测后各分枝杆菌菌种在3个检测通道中的Tm值。在实际应用中首先使用试剂I检测，将获得的Tm值与表中probel、probe2和probe3对应的Tm值比对,若为唯一分枝杆菌菌种，则完成鉴定，否则需用试剂II进一步检测，并与probe4、probe5和probe6的Tm值比对,从而完成鉴定。表I
权利要求
1.一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中包括两对引物和三条探针，所述两对引物包括引物TBleftu TBleft2、TBrightl和TBright2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO I、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 所示，所述三条探针 TBProbeI、TBProbe2、TBProbe3的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 所示。
2.权利要求I所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其进一步还包括另外四对引物和三条探针，所述四对引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、TBright5、TBright6，其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 所示，所述三条探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光 染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:18所示。
3.权利要求I或2所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中所述的报告荧光染料选自 FAM、ROX、HEX 或 JOE。
4.权利要求I或2所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中所述的淬灭荧光染料选自 BHQ1、BHQ2、Eclipse 或 TAMRA。
5.权利要求I或2所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中探针TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5’端分别用报告荧光染料FAM、HEX、ROX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQl或BHQ2标记。
6.权利要求1、2或5所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端分别用报告荧光染料FAM、ROX、HEX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQl或BHQ2标记。
7.权利要求I至6中任一项所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中所述的分枝杆菌为临床常见分枝杆菌，包括但不限于结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M. scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M. simiae)、胃分枝杆菌(M. gastri)、海分枝杆菌(M. marinum)、溃瘍分枝杆菌(M. ulcerans)、不产色分枝杆菌(M. nonchromogenicum)、爱知分枝杆菌(M. aichiense)、鸟分枝杆菌(M. avium)、迪氏分枝杆菌(M. diernhoferi)、次要分枝杆菌(M. triviale)、偶然分枝杆菌(M. fortuitum)、土地分枝杆菌(M. terrae)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M. xenopi)、龟分枝杆菌龟亚种(M. chelonae subsp. chelonae)、龟分枝杆菌胺肿亚种(M. chelonae subsp. abscessus)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)、抗热分枝杆菌(M. thermoresistibiIe)、田野分枝杆菌(M. agri)、母牛分枝杆菌(M. vaccae)、草分枝杆菌(M. phlei)。
8.权利要求I至7中任一项所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，进一步还包括热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列扩增所需的其它各种试剂。
9.一种用于鉴定分枝杆菌菌种的方法，该方法包括(1)样本处理及DNA提取；(2)配制包括权利要求I或2所述试剂盒中引物对和探针的PCR反应体系；(3)在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；(4)PCR扩增结束后,进行熔解曲线(Meltingcurve)分析。
10.权利要求9所述的鉴定分枝杆菌菌种的方法，其中步骤(2)配制的PCR反应体系优选使用一种热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整。另外，所加各引物对的上游引物和下游引物浓度不同。扩增探针互补链的引物的浓度高于与之配对的另一条引物浓度。一对PCR引物浓度的比例为不超过2 1，或者不超过3 I,或者不超过4 I,或者不超过5 I。
11.权利要求9所述的鉴定分枝杆菌菌种的方法，其中步骤(2)中配制的PCR反应体系为成分浓度加入量PCR缓冲液10倍浓缩2μ1 MgCl225mM1.6μ1dNTPsIOmM0.4μ1引物1(限制性引物) IOmMΟ. μ 引物 2IOmM0.6μ1探针IOmM0.4μ1aTaqDNA 聚合酶5υ/μ1Ο. μ 模板2μ1无菌超纯水补足至20μ1通常，使用本发明所述的鉴定试剂I代替上述反应体系中的引物和探针，另外可能视情况需要在使用鉴定试剂I后，用本发明所述鉴定试剂II代替上述反应体系中的引物和探针配制PCR反应体系。
12.权利要求9中步骤(3)中PCR扩增所采用的程序为95°C预变性Imin;40 50个循环 95 变性 6sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 10sec，58°C退火 15sec，72°C延伸 5sec ；95°C变性30sec ;40°C保温20sec ；40 85°C做熔解曲线分析，每步升温1°C，保温5 30sec，选择FAM、HEX、ROX通道检测荧光。
13.权利要求I至8中任一项所述的用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒在制备用于鉴定分枝杆菌的各类产品或试剂的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于分枝杆菌菌种鉴定的双标记探针检测和溶解曲线分析方法，以及利用所述方法同时鉴定多种分枝杆菌的试剂盒。本发明中的试剂盒包括针对分枝杆菌16S rRNA基因设计的引物和能够鉴定分枝杆菌菌种的双标记寡核苷酸探针，以及一种热稳定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。本发明中的检测方法和试剂盒能检测和/或鉴定24种常见分枝杆菌。根据探针与不同菌种的序列杂交产生不同Tm值的熔解峰判读结果，可同时快速、准确地检测分枝杆菌，鉴别分枝杆菌与非分枝杆菌及结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，鉴定分枝杆菌菌种，3-4小时即可报告结果，从而辅助临床诊断、指导临床开展早期有效的化疗。
文档编号C12Q1/04GK102634575SQ20121008266
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者吴雪琼, 孙伟民, 富国良, 张俊仙, 梁艳, 阳幼荣 申请人:中国人民解放军第三O九医院, 无锡锐奇基因生物科技有限公司