专利名称：用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法及其应用。
背景技术：
双生病毒是ー类广泛发生的植物病毒，随着全球气候变暖、农业耕作制度的改变、国际间贸易活动的迅速加强和昆虫介体在世界各地空前扩展，双生病毒在全球范围内广泛发生。目前双生病毒已经在亚洲、美洲中部、南非的中北部及地中海等地区广泛分布和流行，并且正进ー步向周边未感染地区扩展。据初步统计，至少已有40多个国家的棉花、木薯、番茄等作物遭受此类病毒的毁灭性危害。上世纪九十年代以来，随着全球气候变暖和贸易活动的増加，双生病毒在我国的危害也越来越严重。我国已在北京、上海、云南、海南、浙江、广东、广西、山东、新疆、内蒙古等二十多个省市的番茄、南瓜、番木瓜、烟草等多种作物上发现该病害，且具有逐年向北不断扩展蔓延的趋势。在云南，双生病毒引起的香料烟曲叶病在局部田块病株率达70%以上，在滇南烟区部分烤烟上病株率达15-30%，引起烟草产量质量的严重损失。而在广西的番木瓜和番茄上，双生病毒发病也很普遍，发病严重地区病株率高达30-50%，有的田块100%植株染病，损失惨重。由双生病毒引起的番茄曲叶病在我国呈现全面暴发之势，已在上海、浙江、江苏、安徽、山东、山西、陕西、河南、河北、北京、广东、广西、云南、内蒙古、辽宁、福建、海南、台湾等18个省市造成严重危害，严重发病田块病株率达95%以上，造成了毁灭性损失。据不完全统计，我国番茄黄化曲叶病毒病的年发生面积超过100万亩，年经济损失至少20亿人民币。目前该病害已经逐渐成为我国番茄生产上ー个重要的制约因素。在植物病毒研究中，病毒接种是必不可少的ー个关键环节。由于危害作物及造成重要经济损害的双生病毒大多属于菜豆金色花叶病毒属病毒，该属病毒不能通过汁液摩擦接种的方法进行传播，在自然条件下主要依靠烟粉虱传播，因此该属病毒又称为粉虱传双生病毒。长期以来对于双生病毒的研究多采用烟粉虱传毒接种的方法，但是该方法操作过程中需要烟粉虱来完成传毒，因此存在很多难于克服的问题1、烟粉虱较难饲养；2烟粉虱是否携帯病毒，所携帯病毒是否纯正単一，烟粉虱的带毒率检测困难等，造成毎次试验的毒源无法统一 ；3烟粉虱的个体极小，接种虫量也难于控制；4、烟粉虱的传毒效率更是难于控制，影响实验结果的准确性；5、由于烟粉虱可同时传播多种双生病毒及其他病害，因此接种结果往往干扰性大。最近发展起来的农杆菌菌液注射方法由于需要用接种缓冲液对菌液进行后期处理，步骤繁琐，对仪器的依赖性强，操作不便，降低了实验效率。此外，实验过程中耗费的注射器及多余菌液造成了环境污染，不利于环境保护，并且注射接种法对于茎杆粗硬的植物可操作性差，影响了双生病毒接种效率。针对烟粉虱传毒接种和农杆菌菌液注射接种方法上存在的缺陷，本发明专利提供了ー种基于侵染性克隆固体菌落接种的方法，该方法适用于我国发生严重的16种植物双生病毒接种，接种效率高达100%，操作简便，重复性强，可控性好，快速有效，并且简单易学，不依赖仪器，在生产实践中利于大規模推广应用，为多种植物双生病毒的致病性測定及选育抗性植物材料的研究提供了ー种新方法
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法及其应用。用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法包括如下步骤
1)接种毒源
从田间采集双生病毒的样本，提取基因组总DNA ;设计双生病毒特异性引物，PCR扩增病毒基因组全序列，扩增产物克隆至T-Vector中；对克隆产物进行PCR筛选和序列測定；利用限制性酶切的方法把病毒基因组全长的I. 2-2个重复序列构建到改良型植物表达载体pBinplus上，获得带有双生病毒的侵染性克隆；双生病毒侵染性克隆通过常规的三亲交配或电击的方法将其导入农杆菌细胞EHA105中，获得接种毒源；
所述的双生病毒为中国番木瓜曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、中国番爺曲叶病毒、台湾番爺曲叶病毒、广西番爺曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、中国大青金色花叶病毒、江苏大青金色花叶病毒、一品红曲叶病毒、广东赛葵曲叶病毒、烟草曲莖病毒、云南赛葵黄脉病毒、赛葵黄脉病毒、假马鞭曲叶病毒、云南烟草曲叶病毒；
2)毒源固体平板菌落的培养
将冰箱冻存的含有双生病毒侵染性克隆的农杆菌EHA105接种至含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP固体培养基中，划线接种或均匀涂板，28°C培养24_48h，至菌落长好或长满整个平板；
3)幼苗培育
温度为25 28°C、相対湿度为75 %、光周期为16L 8D的温室或植物培养箱中育苗，2片真叶期时移栽，3-4片真叶期时进行病毒接种；幼苗包括茄科植物番茄、辣椒、茄子、普通烟、本氏烟、心叶烟、三生畑、珊西烟；葫芦科植物黄瓜、南瓜、冬瓜、丝瓜、葫芦；旋花科植物矮牵牛。4)牙签扎刺接种
用牙签挑取培养好的固体平板菌落，离根1-2厘米处扎刺植株茎杆韧皮部3-4点，接种后的植物干与幼苗培育条件相同的温室或植物培养箱中培养生长；
5)症状观察和发病情况记录及抗性分析
接种一周后记录植物发病症状，15-30天统计发病情况，计算发病率，评价病毒对不同植物的致病力或植物材料对双生病毒的抗性发病率高的植物表现感病，发病率低或不发病的植物表现抗病。用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法用于双生病毒的致病性測定、病毒基因功能的研究及抗双生病毒的抗性品种测定和抗病育种服务。本发明利用固体菌落经牙签扎刺植物茎杆就实现双生病毒的接种。避免了常规烟粉虱接种或农杆菌菌液接种方法上的缺陷，无需饲养烟粉虱，无需繁琐的操作，对仪器的依赖性低，环境的污染小，同时该方法还具有重复性好、结果准确、快速高效、简单易学、利于大規模推广等优势。本发明适用于我国发生严重的16种双生病毒的接种，接种植物包括茄科、葫芦科、旋花科植物。
图I是划线培养的平板菌落；
图2是牙 签挑取平板菌落；
图3是适合接种的植物苗；
图4是接种工具——牙签；
图5是植物接种部位；
图6是ToLCTWV单独或与TYLCCNB共同接种产生的症状；
图7番茄接种病毒后的病情指数统计。
具体实施例方式用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法包括如下步骤
1)接种毒源
从田间采集双生病毒的样本，提取基因组总DNA ;设计双生病毒特异性引物，PCR扩增病毒基因组全序列，扩增产物克隆至T-Vector中；对克隆产物进行PCR筛选和序列測定；利用限制性酶切的方法把病毒基因组全长的I. 2-2个重复序列构建到改良型植物表达载体pBinplus上，获得带有双生病毒的侵染性克隆；双生病毒侵染性克隆通过常规的三亲交配或电击的方法将其导入农杆菌细胞EHA105中，获得接种毒源；
所述的双生病毒为中国番木瓜曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、中国番爺曲叶病毒、台湾番爺曲叶病毒、广西番爺曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、中国大青金色花叶病毒、江苏大青金色花叶病毒、一品红曲叶病毒、广东赛葵曲叶病毒、烟草曲莖病毒、云南赛葵黄脉病毒、赛葵黄脉病毒、假马鞭曲叶病毒、云南烟草曲叶病毒；
2)毒源固体平板菌落的培养
将冰箱冻存的含有双生病毒侵染性克隆的农杆菌EHA105接种至含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP固体培养基中，划线接种或均匀涂板，28°C培养24_48h，至菌落长好或长满整个平板；
3)幼苗培育
温度为25 28°C、相対湿度为75 %、光周期为16L 8D的温室或植物培养箱中育苗，2片真叶期时移栽，3-4片真叶期时进行病毒接种；幼苗包括茄科植物番茄、辣椒、茄子、普通烟、本氏烟、心叶烟、三生畑、珊西烟；葫芦科植物黄瓜、南瓜、冬瓜、丝瓜、葫芦；旋花科植物矮牵牛；
4)牙签扎刺接种
用牙签挑取培养好的固体平板菌落，离根1-2厘米处扎刺植株茎杆韧皮部3-4点，接种后的植物干与幼苗培育条件相同的温室或植物培养箱中培养生长；
5)症状观察和发病情况记录及抗性分析
接种一周后记录植物发病症状，15-30天统计发病情况，计算发病率，评价病毒对不同植物的致病力或植物材料对双生病毒的抗性发病率高的植物表现感病，发病率低或不发病的植物表现抗病。用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法用于双生病毒的致病性測定、病毒基因功能的研究及抗双生病毒的抗性品种测定和抗病育种服务。实施例I :双生病毒侵染性克隆接种毒源的获得
从田间采集双生病毒的样本，提取基因组总DNA ;设计双生病毒特异性引物，PCR扩增病毒基因组全序列，扩增产物克隆至T-Vector中；对克隆产物进行PCR筛选和序列測定；利用限制性酶切的方法把病毒基因组全长的I. 2-2个重复序列构建到改良型植物表达载体pBinplus上，获得带有双生病毒侵染性克隆；双生病毒侵染性克隆通过常规的三亲交配或电击的方法将其导入农杆菌细胞EHA105中，获得接种毒源。 上述接种毒源获得的方法具体可參照专利发明者发表的论文及其指导研究生的毕业论文(中国番木瓜曲叶病毒毒源(具体方法參照Journal of ZhejiangUniversity-Scienceガ11 (2) : 109-114，2010)、中国番茄黄化曲叶病毒毒源(具体方法參银、Journal of Virology 78 (24) : 13966-13974, 2004)、泰国番爺黄化曲叶病毒毒源(具体方法參照Virus Genes^{2) :323-328, 2009)、中国番茄曲叶病毒毒源(具体方法參照郭维博士论文)、台湾番茄曲叶病毒毒源(具体方法參照张辉博士论文)、广西番茄曲叶病毒毒源(具体方法參照及Journal of Plant Pathology 118 (3) : 287-294, 2007)、中国胜红蓟黄脉病毒毒源(具体方法參照(4) :405-411, 2007)、中国大青金色花叶病毒毒源(具体方法參照Genes 41 (2) :250-259，2010)、江苏大青金色花叶病毒毒源(具体方法參照Kirw1S Genes 41(2) :250-259, 2010)、一品红曲叶病毒毒源(具体方法參照jrcAims of Virology 156(3) :517-521, 2011)、广东赛葵曲叶病毒毒源(具体方法參照Plant Pathology 56(5) :771-776, 2007)、烟草曲茎病毒毒源(具体方法参照、PhytopathoIogfdb (8) : 902-908，2005)、云南赛葵黄脉病毒毒源(具体方法參照江彤博士论文)、赛葵黄脉病毒毒源(具体方法參照如/and Environmental Microbiology74(6) :1909-1913, 2008)、假马鞭曲叶病毒毒源(具体方法參照jrcAims of Virology150 (11) :2257-2270, 2005)、云南烟草曲叶病毒毒源(具体方法參照及/ゾotfraa/ ofPlant Pathology 115(4) :369-375, 2006)的侵染性克隆)。实施例2 :双生病毒的致病性測定和病毒基因功能的研究(以台湾番茄曲叶病毒为例)
将台湾番爺曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus, ToLCTWV)侵染性克隆农杆菌接种含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP液体培养基中活化，28°C 200rpm培养至0D_达到0. 8-1. O。将上述活化好的菌液吸取50ul至含100mg/l的卡那霉素和50mg/I的利福平的YEP固体培养基中，均匀涂板，28°C培养24-48h，至菌落长满整个平板。挑取平板菌落，以牙签扎刺法接种原始寄主番茄，及其他寄主本氏烟、矮牵牛、心叶烟。ToLCTWV在其原始寄主番茄上表现极强的致病性，接种植株全部表现症状。接种14天后番茄植株表现出叶片下卷，这与其田间症状一致(图6a)。但该病毒在本氏烟、矮牵牛及心叶烟均不能产生明显症状(图6c，6e, 6g)。提取表现症状的番茄植株系统叶总DNA作为模板，用ToLCTWV特异全长引物进行PCR扩增，均能得到大约2. 7kb的目的片段，但在未表现症状的本氏畑、心叶烟和矮牵牛植株上均扩不到目的片段，表明ToLCTWV単独不能侵染本氏烟、心叶烟和矮牵牛。
将ToLCTWV侵染性克隆与伴随中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlChina virus, TYLCCNV)的卫星DNA P (TYLCCNB)侵染性克隆混合接种番茄、本氏烟、矮牵牛及心叶畑。混合接种后在番茄上可以产生叶脉黄化及顶端扭曲的症状(图6b)，该症状在病毒単独接种时观察不到；在本氏烟上产生严重的叶片下卷，叶脉黄化及叶背面出现耳突(图6d);在矮牵牛上也出现严重的叶片下卷，背面有耳突(图6f);在心叶烟上也产生了叶片下卷但没有黄脉和耳突现象(图6h)。以上混合接种的植株均100%表现症状。提取发病植株的总DNA进行PCR扩增，分别可以扩增到ToLCTWV和TYLCCNB的特异条带。这表明ToLCTWV的确可以与TYLCCNB互作，不仅产生更严重的症状，还使得其寄主范围扩大。实施例3 :植物抗双生病毒的抗性品种测定
以番茄品种浙A、浙B、浙C、红宝石为研究对象，通过平板菌落牙签扎刺韧皮部接种，鉴定各番茄品种对中国番木瓜曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒的抗性。
I、实验处理
a)将含有中国番木瓜曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒的侵染性克隆的农杆菌EHA105接种含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP液体培养基中活化，280C 200rpm培养至OD6tltl达到0. 8-1. O。将上述活化好的菌液吸取50ul至含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP固体培养基中，均匀涂板，28°C培养24-48h，至菌落长满整个平板。番茄品种浙A、浙B、浙C、红宝石25°C温室条件下育苗，2片真叶期时移至一次性营养钵中，3-4片真叶时进行接种处理。用牙签挑取培养好的平板菌落，扎刺3-4片真叶期番茄茎杆韧皮部3-4点，接种后的番茄于温室(温度为20-30°C)内放置并观察发病情況。接种一周后记录植物发病症状，15-30天统计发病情況，计算发病率，评价不同番茄品种对中国番木瓜曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、台湾番茄曲叶病毒的抗性。2、实验结果
接种后的番茄于15天左右出现症状。接种中国番木瓜曲叶病毒的番茄呈现叶片下卷、扭曲、皱缩，植株矮化，新叶舒展不完全等症状；接种番茄黄化曲叶病毒的番茄表现叶片皱缩、细化、边缘上卷，叶脉外突，植株矮化，新叶舒展不完全等症状；接种中国番茄黄化曲叶病毒的番茄表现叶片严重下卷，叶背叶脉外突、增厚，黄脉，植株矮化，后期出现耳突等症状；接种泰国番茄黄化曲叶病毒的番茄呈现叶片下卷、皱缩，植株矮化等症状；接种台湾番茄曲叶病毒的番茄呈现叶片下卷、边缘黄化，叶脉外突、增厚，新叶细化等症状。与田间番茄病株发病症状一致，30天统计发病率如表I所示，病情指数如图7所示。表I抗双生病毒的番茄抗性品种测定
权利要求
1.一种用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法，其特征在于包括如下步骤 .1)接种毒源 从田间采集双生病毒的样本，提取基因组总DNA ;设计双生病毒特异性引物，PCR扩增病毒基因组全序列，扩增产物克隆至T-Vector中；对克隆产物进行PCR筛选和序列測定；利用限制性酶切的方法把病毒基因组全长的I. 2-2个重复序列构建到改良型植物表达载体pBinplus上，获得带有双生病毒的侵染性克隆；双生病毒侵染性克隆通过常规的三亲交配或电击的方法将其导入农杆菌细胞EHA105中，获得接种毒源； 所述的双生病毒为中国番木瓜曲叶病毒、中国番茄黄化曲叶病毒、泰国番茄黄化曲叶病毒、中国番爺曲叶病毒、台湾番爺曲叶病毒、广西番爺曲叶病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、中国大青金色花叶病毒、江苏大青金色花叶病毒、一品红曲叶病毒、广东赛葵曲叶病毒、烟草曲莖病毒、云南赛葵黄脉病毒、赛葵黄脉病毒、假马鞭曲叶病毒、云南烟草曲叶病毒； .2)毒源固体平板菌落的培养 将冰箱冻存的含有双生病毒侵染性克隆的农杆菌EHA105接种至含100mg/l的卡那霉素和50mg/l的利福平的YEP固体培养基中，划线接种或均匀涂板，28°C培养24_48h，至菌落长好或长满整个平板； .3)幼苗培育 温度为25 28°C、相対湿度为75 %、光周期为16L 8D的温室或植物培养箱中育苗，.2片真叶期时移栽，3-4片真叶期时进行病毒接种；幼苗包括茄科植物番茄、辣椒、茄子、普通烟、本氏烟、心叶烟、三生畑、珊西烟；葫芦科植物黄瓜、南瓜、冬瓜、丝瓜、葫芦；旋花科植物矮牵牛； .4)牙签扎刺接种 用牙签挑取培养好的固体平板菌落，离根1-2厘米处扎刺植株茎杆韧皮部3-4点，接种后的植物干与幼苗培育条件相同的温室或植物培养箱中培养生长； .5)症状观察和发病情况记录及抗性分析 接种一周后记录植物发病症状，15-30天统计发病情况，计算发病率，评价病毒对不同植物的致病力或植物材料对双生病毒的抗性发病率高的植物表现感病，发病率低或不发病的植物表现抗病。
2.一种如权利要求I所述的用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法的应用，其特征在于用于双生病毒的致病性測定、病毒基因功能的研究及抗双生病毒的抗性品种测定和抗病育种服务。
全文摘要
本发明公开了一种用含双生病毒侵染性克隆的固体菌落扎刺接种植物的方法及其应用。将含有双生病毒侵染性克隆的农杆菌EHA105涂布于含100mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的YEP固体培养基中于28℃培养成菌落，牙签挑取菌落，离根1-2厘米处，在3叶期以上植株扎刺韧皮部3-4点，接种后的植物在温室中培养，并观察病毒症状。该发明专利的接种方法无需饲养烟粉虱、接种效率高、重复性强、操作简便，快速、易于大规模推广。本发明专利适用于我国发生严重的16种双生病毒，接种植物包括茄科、葫芦科及旋花科。本发明可用于双生病毒致病性鉴定和病毒基因功能研究，还可用于植物抗双生病毒的抗性品种测定，为植物抗病育种服务。
文档编号C12N15/34GK102640642SQ20121012332
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者周雪平, 矫晓阳, 谢艳 申请人:浙江大学