专利名称：一种β-环状糊精的制备方法
技术领域：
本发明涉及酶工程技术领域，具体地说是用大肠杆菌产生的环状糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用淀粉制备β -环状糊精(β -⑶)的方法。
背景技术：
环状糊精(⑶)是由CGT酶作用于淀粉形成6-12个D-吡喃葡萄糖基以α-1，4_糖苷键连接的环状聚合物。根据葡萄糖残基个数的不同，⑶s—般分类为α-、β_、Y-、δ-、ε_、及⑶，分别由6、7、8、9、10、11及12个葡萄糖单 元组成，其中研究最多且应用最广的是α _、β _、Y-⑶。目如β -⑶的应用最广泛，这是由于β-⑶的孔径适中，性质稳定。β -环糊精是一种具有内疏水外亲水的筒状结构，能和许多疏水客体化合物或功能基团包结在其环形疏水空隙内，从而改变了客体物质的物理、化学或生物学性质，以此特性为基础衍生出环糊精的包埋、包合技术，致使其在轻工、农业、化工、环保、食品领域尤其是作为食品添加剂方面应用性很广。因此大规模生产β_⑶有重要的意义。现有的β-CD的生产方式有化学法和酶法，化学合成方法价格昂贵、产率也很低，只适合科学研究。另外一种就是用酶制备，这也是世界上最为常用的方法，和化学法相比条件温和产率也很高。⑶的生产一般过程菌种的筛选、培养；CGTase的制备；CGTase催化淀粉生成CD ；CD的分离、纯化与结晶。制备CD常用底物有玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等，不同的原料获得CD收率也不同。我国用酶法制备β-CD的方法大同小异，但依然无法克服成本、周期、产率等方面的问题。相比日本、德国、法国等国家产量不高，价格较贵且纯度不高，国内环糊精的供需也多依靠进口。在我国，最早报道环糊精生产的是谈家桢等，于1950年报道了以软化芽孢杆菌作用于淀粉制备CD，二十世纪八十年代后期又开展了利用嗜碱芽孢杆菌制备CD的研究，江苏省食品发酵研究所于1978年首先开始了 CD的制备研究，并于1982-1983年进行了扩大试验，1985年完成了年产20吨CD的工业性试验，中科院北京微生物研究所也进行过CD的中试制备和应用试验。直到1990年陕西省微生物研究所谢伯泰研究员开发出β-CD的制备新工艺之后，我国的CD产业才开始得到发展。鉴于β -⑶在轻工业中广泛的应用价值，国内对⑶的制备开发十分重视，应用研究也不断深入，目前国内CD制备厂家主要有广东郁南、陕西佳县、陕西志丹、陕西礼泉、辽宁方镇五家，另外还有苏州味精厂、山东曲阜天利药用辅料有限公司等。目前的制备方法是
I.在调好乳的淀粉浆液中加入CGT酶(此时浆液中PH约8. O)。2.升温至70_80°C，液化5-10分钟。3.降温至55°C，加CGT酶(此时PH约7. 5)。4.在温度52_56°C，PH不低于6. O条件下，进行静置反应(反应需6_12小时，仍是以CD生成量变化控制，虽然反应中PH不断下降，一般至反应终结PH降不到6. O以下，但偶然有低于6. O的情况，则需用碱调至6. O以上)。
5.加入α -淀粉酶(此时反应液中ΡΗ6. 0-6. 5)。6. 二次液化，脱色提取。然而这样的制备方法存在的缺陷就是制备步骤繁多(需要两次液化和多次调ΡΗ)，反应时间较长，增加了制备的成本降低了生产效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以缩短β-CD反应时间并提高产率的环状糊精(β-CD)的制备方法。本发明是利用实验室的重组大肠杆菌转化表达产生的酶作用于木薯淀粉，具体工艺流程为
1)取底物木薯淀粉在100°c下糊化20分钟，将温度降至55°C；
2)经过糊化后加入4-5U/g底物的环状糊精葡萄糖基转移酶，加入CaCl2保证整个体系CaCl2的浓度是lOmmol/L，用碱调pH至7. 5-8. 0，搅拌水解20 30分钟，搅拌至反应液不再粘桐为止；
3)加入O.5ml/g底物的环己烷后，将温度升至65°C搅拌反应9 10小时；
4)反应结束后将反应液于100°C灭酶活15分钟；
5)加入40U/g淀粉α-淀粉酶，调pH至6. 5，60°C下反应I 3小时后冷却至23°C ；
6)补加O.4ml/g底物的环己烧后，于150rpm恒温摇床20 30分钟；
7)23°C下IOOOOrpm离心10分钟，取下层固体就是粗制的β-⑶。与现有技术相比，本发明的具有以下优点
I.不需要静置液化，一步液化后就进行环化反应，简化了工序。2.不需要频繁调动pH值，过程中pH比较稳定。3.需要的反应温度梯度只有3个，温度调控不再繁琐。4.反应周期大大减少，中间的反应时间只需要9-10个小时，提高了生产效率。5. β -⑶的产率明显提高了 4%_5%，均在47%以上。
图I是本发明制备出来的β_⑶在薄层层析上的图谱，图中，I是β_⑶标品，2是糊精标品，3是实验样品。图2是分光光度计法测定β -⑶含量的标准曲线。图3是本发明的β -环状糊精(β -⑶)的制备流程图。
具体实施方式
、
实施例I :
称取木薯淀粉15g至250ml的锥形瓶中，100°C下糊化20分钟；温度降至55°C，取环化活性5U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaC12保证体系中CaCl2的浓度为10mmol/L,用碱调pH为8. O搅拌水解20分钟,搅拌到体系不再粘稠为止；加入O. 5ml/g底物的环己烷，温度升至65°C搅拌反应9个小时；将反应液于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/g α -淀粉酶，pH用酸调到6. 5，60°C反应Ih水解剩余的淀粉，然后冷却至23°C后加入O. 4ml/g环己烧于23°C 150rpm恒温摇床30分钟。23°C下IOOOOrpm离心10分钟弃去液体，余下的固体即是粗制β_⑶，质量是7. 083g，产率为47. 22%。实施例2
称取木薯淀粉IOg至于250ml的锥形瓶中，100°C下糊化20分钟，温度降至55°C，取环化活性4U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaC12保证体系中CaCl2的浓度为lOmmol/L，用碱调pH为7. 5搅拌水解20分钟，搅拌到体系不再粘稠为止；加入O. 5ml/g底物的环己烷，温度升至65°C搅拌反应10个小时；将反应液至于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/ga -淀粉酶，pH用酸调到6. 5，60°C反应2h水解剩余的淀粉.然后冷却至23°C后加入O. 4ml/g环己烷于23°C 150rpm恒温摇床30分钟；23°C下IOOOOrpm离心10分钟弃去液体，余下的固体即是粗制β-CD，质量是4. 714g，产率为47. 14%。 实施例3
称取木薯淀粉20g至于250ml的锥形瓶中，100°C下糊化30分钟，温度降至55°C，取环化活性4U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaC12保证体系中CaCl2的浓度为10mmol/L,用碱调pH为8. O搅拌水解30分钟,搅拌到体系不再粘稠为止；加入O. 5ml/g底物的环己烷，温度升至65°C搅拌反应9个小时；将反应液于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/g α -淀粉酶，pH用酸调到6. 5，60°C反应3h水解剩余的淀粉.然后冷却至23°C后加入O. 4ml/g环己烧于23°C 150rpm恒温摇床30分钟；23°C下IOOOOrpm离心10分钟弃去液体，余下的固体即是粗制β_⑶，质量是9. 436g，产率为47. 18%。
权利要求
1 .一种3 -环状糊精的制备方法，其特征是按以下步骤进行 1)取底物木薯淀粉在100°C下糊化20分钟，将温度降至55°C； 2)经过糊化后加入4-5U/g底物的环状糊精葡萄糖基转移酶，加入CaCl2保证整个体系CaCl2的浓度是lOmmol/L，用碱调pH至7. 5-8. 0，搅拌水解20 30分钟，搅拌至反应液不再粘桐为止； 3)加入0.5ml/g底物的环己烷后，将温度升至65°C搅拌反应9 10小时； 4)反应结束后将反应液于100°C灭酶活15分钟； 5)加入40U/g淀粉a-淀粉酶，调pH至6. 5，60°C下反应I 3小时后冷却至23°C ； 6)补加0.4ml/g底物的环己烧后，于150rpm恒温摇床20 30分钟； 7)23°C下IOOOOrpm离心10分钟，取下层固体就是粗制的P -CD。
全文摘要
本发明是一种β-环状糊精的制备方法。用重组大肠杆菌表达的环状糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用于淀粉底物生产β-CD，整个反应的体系液化和环化都是维持PH8.0，液化的时间为20分钟-30分钟，环化的时间为9-10个小时。反应时间的大大缩短很大程度上降低了成本，提高了生产效率。
文档编号C12P19/18GK102660608SQ20121012367
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者周峻沛, 唐湘华, 宋拓, 李俊俊, 杨云娟, 许波, 黄遵锡 申请人:云南师范大学