专利名称：基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子单核苷酸多态性均相检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及ERCCl基因Exon4第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性的检测技术领域，尤其涉及ー种均相检测法，其通过检测改变的荧光偏振值以监测样品中存在的ERCCl基因Exon4第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)指在某一人群的正常个体的基因组内特定核酸位置上有着不同碱基，是人类DNA序列的差异，即染色体基因组序列中单核苷酸改变时发生的DNA序列的多态性变化，SNPs也被称作双等位基因标记。人类基因组30亿个碱基中，大约每300到500个碱基就有ー个SNP发生，整个人类基因组大约有2000万SNP。SNP既能在编码基因又能 在非编码基因中发生，对人类个体的表型(形态、代谢和免疫状态等)，个体对环境致病因素的易感性、抵抗力、药物和治疗的反应敏感性产生重大影响，因此，其检测对生物学研究、药物开发、医学诊断、生物医学和法医学发展有重要意义。DNA损伤修复是个复杂的过程，通过一系列的DNA修复途径完成，包括核苷酸切除修复和碱基切除修复途径等。ERCCl是碱基切除修复途径中的重要基因，在DNA修复途径中起到了关键性作用，其正常表达是维持该修复功能的分子基础。ERCCl codonll8位于第4外显子，是ー个沉默SNP，即C/Τ转换都编码同样的氨基酸天门冬氨酸(Asp)，C/T转换可能与密码子选择减半、ERCCl mRNA产物及随后的蛋白翻译降低有夫，降低了 DNA修复能力，可能与个体肿瘤易感性密切相关。同吋，DNA修复能力是影响钼类药物的疗效的重要原因。钼类药物(顺钼、卡钼)是化疗的ー类重要药物。ERCCl与着色性干皮病基因形成的异源ニ聚体，能在钼类药物引起的DNA损伤位点的5’端切开DNA单链，保证DNA的修复过程的继续进行，为细胞存活所必需。因此，基因多态不仅与肿瘤的化疗疗效有夫，对预后也有影响。在肿瘤的治疗过程中，DNA修复能力增强影响了抗肿瘤药物疗效的发挥，易产生耐药性；DNA修复能力下降有助于有抗肿瘤活性的钼-DNA加合物功能的持续存在，从而对预后产生好的影响。已有很多文献报道ERCCl的SNP与钼类药物化疗敏感性存在明显关系，ERCCl (118) C / T单核苷酸多态性与非小细胞肺癌患者钼类药物化疗后的生存期有显著相关性，ERCCl (118) C / T和T / T基因型患者化疗后的生存期及化疗敏感性明显高于携帯C / C基因型的患者。ERCCl (118) SNP与钼类药物化疗后生存期存在一定的相关性有可能作为钼类药物化疗后生存期的预测指标。提示ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性的检测不仅可广泛用于生物学研究，也能预警肿瘤发生、预测化疗疗效，为肿瘤早期诊断、预后判定及指导预见性个体化用药提供依据。而且ERCCl基因第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性不仅存在于组织中，在外周血、积液和痰液中均可检出，这ー优点对相关的生物学学研究及开展早期、敏感无创的诊断意义重大。目前，ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性分析方法有很多，RFLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、寡核苷酸连接分析、等位基因特异的PCR、DNA测序、基因芯片、TDI-FP等技术都可分别进行检测，但这些方法涉及扩增、消化纯化、灭活、杂交延伸分管等步骤，多需要电泳和多步后处理，费时费力而效率有待提高。而且在操作过程因需要更换反应管而易发生污染，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。因此，需要获得一种操作简便、特异准确、易标准化和自动化、低成本的ERCCl基因第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性检测新方法。本发明的实施方案提供了一种测定样品中ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性的均相检测法，该方法以荧光偏振的测量为基础。荧光偏振技术的原理如下具有较低分子量的荧光探针由于其快速旋转而具有较小偏振度，而具有较大分子量的荧光探针由于其慢速旋转而具有较大偏振度。因此，当与较大分子结合时，荧光团的偏振度增大，荧光偏振数值增加。
发明内容
本发明涉及一种用于测定样品中ERCCl基因第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤(1)从样品中得到提取物使用一种试·剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，得到纯化的提取物；(2)扩增结合将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液，浓度各为
2.O 2. 5mmol/L 的 dNTP (dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP)，2. O 3. 5mmol/L 的 MgCl2,1-5U/ μ I的TaqDNA聚合酶，浓度为O. 2-2. O μ mo I/L的ERCCl基因第4个外显子涵盖第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性区DNA的上游引物、下游引物，以及浓度为O. 05-0. 2ymol/L的ERCCl基因Codonl 18 C/T单核苷酸多态性的带荧光标记的DNA探针，所述反应条件是94-96 °C 变性 4-10min 后，95 °C 孵育 5-40 秒，53-63 V 孵育 15-60 秒，72 V 孵育 10-60 秒，35-45个循环，最后室温孵育；(3)检测检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S. D. )，t检验统计阴、阳性对照反应终液FP值分布最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonl 18单核苷酸多态性
待测样品FP值〉阴性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，
待测样品FP值< 阳性临界值Cut-of f值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源，
待测样品FP值〉阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值< 阴性临界值Cut-off，则靶位点状态无法判断，需重新检测。方法中涉及ERCCl基因Codonl 18 C / C，ERCCl基因Codonl 18 T / T的阳性和阴性对照，可通过一般的分子生物学方法利用已知的序列克隆得到。进一步，步骤(I)包括在试剂或试剂盒中进行处理获取基因组DNA;其中所述获取基因组DNA的试剂或试剂盒为内含蛋白酶K、细胞裂解液的DNA提取液，及内含酚/氯仿、乙醇或DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱的试剂；回收的DNA通过PCR来扩增，在PCR扩增过程中，第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性保持不变。进一步的，其中所述引物为ERCCl基因涵盖第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性通用的上游引物、下游引物，所述带荧光标记的探针为ERCCl基因第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性同源的探针，能够与所获得的扩增子结合以产生能够检测的荧光偏振值变化；检测所述各反应终液的荧光偏振以获得荧光偏振測量值；以及将荧光偏振測量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值为对照反应终液FP均值、Cut-off 值。在优选技术方案中，根据待测ERCCl基因涵盖Codonl 18单核苷酸多态性序列，避开Codonll8多态性位点设计通用引物，其中所述覆盖ERCCl基因涵盖Codonll8单核苷酸多态性通用上游、下游引物序列为正向引物5’-cagtccagaacactgggacatgac-3’，反向引物 5’ -ggtcatccctattgatggcttctg-3’ , Codonl 18 C/C 基因型探针序列为 5’ -ccaaattcccagggcacgttgcgcacg-3 ,或 5 -caaattcccagggcacgttgcgcacg-
3 ,或 5 -caaattcccagggcacgttgcgcac-3 ,现 5 -caaattcccagggcacgttgc gc-3',或t> -caaattcccagggcacgttgcg-3 , gk, t> -caaattcccagggcacgttgc-3 。 Codonl 18 T/T型探针序列为 5' -ccaaattcccagggcacAttgcgcacg-3',或 5' -caaattcccagggcacAttgcgcacg-3 ,或 5 -caaattcccagggcacAttgcgcac-3 ,或 t> -caaattcccagggcacAttgcgc-3 ,或D -caaattcccag ggcacAttgcg-3 ,或 D -caaattcccagggcacAttgc-3 。在优选的技术方案中，其中所述末端标记的荧光素为TAMRA (四甲基罗丹明)，或FAM (羧基荧光素)、Rl 10 (罗丹明)、FITC (异硫氰酸荧光素)、TET (四氯荧光素)、HEX (六氯荧光素)、ROX ,BTR0两种基因型探针分别用两种不同的荧光素标记。在优选的技术方案中，其进ー步包括下述步骤提供多个ERCCl基因第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性阳性对照ERCC1 Codonl 18 C / C阳性对照pGEM-T-ERCCl-C/C, ERCCl Codonl 18 T / T 阳性对照 pGEM-T-ERCCl_118T/T，且互为交叉阴性对照，即 pGEM-T-ERCCl-C/C 为 ERCCl Codonl 18T / T 的阴性对照，pGEM-T-ERCCl_118T/T为ERCCl Codonl 18 C / C的阴性对照，每个阴、阳性对照溶液具有不同的已知浓度；每个明、阳性对照加入反应试剂进行反应；以及测量每个所述标准对照反应液的荧光偏振值以提供多个对应于已知ERCCl基因第118位密码子Codonll8 C / C，T / T阴、阳性対照的荧光偏振数值。在优选技术方案中，其中所述Cut-off值为用SPSS软件计算阴性对照、阳性对照反应终液FP值均值和标准差，t检验法统计阴、阳性对照反应终液FP值分布，所得到的Cut-off值，满足最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性。在优选技术方案中，其中所述待测样品FP值与阴性对照反应终液FP均值、Cut-off值比较即知ERCCl基因第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性具体是指如待测样品FP值〉阴性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，如待测样品FP值<阳性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源，如待测样品FP值 > 阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值<阴性临界值Cut-off，则靶位点状态无法判断，需重新检测。本发明进ー步提供实施所述检测的试剂盒、弓丨物和探针等。
与现有技术相比，本发明的优点是
I)、本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。2)、成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性，检测结果更客观准确。3)、结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于研究和检测样本ERCCl基因第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性。
、图I为患者甲DNA样本的ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性T / T测序结果。图2为患者乙DNA样本的ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性C / C测序结果。图3为患者丙DNA样本的ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性C / T测序结果。
具体实施例方式 本发明中，从样品中提取到DNA，与引物和探针发生扩增结合反应，由此而引起荧光偏振度数值的变化，该变化随ERCCl基因第118位密码子Codonl 18单核苷酸多态性状态的改变而改变。本发明的优选实施方案提供了一种ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性状态的均相检测法，该方法灵敏、快速、简单且成本低。下面将结合实施例对本发明进行详细描述。优选的实施方案描述
实施方案I
肺癌患者外周血ERCCl基因第118位密码子上C/T单核苷酸多态性的均相检测预测钼类耐药性
I)、材料和方法
多名健康志愿者外周血提取DNA，用ERCCl基因涵盖Codonll8单核苷酸多态性通用引物正向引物5’-cagtccagaacactgggacatgac-3’ ,反向引物5’-ggtcatccctattgatggcttctg-3’，扩增，扩增产物克隆入
pGEM-T-easy Vectors (Promega, USA)构建标准对照克隆。测序法筛选鉴定对照品的单核苷酸多态性。提取含ERCCl基因第118位密码子上T/T单核苷酸多态性的质粒pGEM-T-ERCCl-118T/T和含ERCCl基因第118位密码子上C/C单核苷酸多态性的pGEM-T-ERCCl-C/C作为对照标准品，于260nm检测OD值定量。分别抽取甲、乙、丙患者外周血I毫升，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(天根生物，北京)进行外周血样品DNA提取，基因组DNA的提取，按照说明书程序操作。ERCCl基因Codonl 18 C单核苷酸多态性的均相检测以本室克隆的含1_1000拷贝/毫升的质粒pGEM-T-
ERCCI-C/C作为阳性对照标准品，以含IO7拷贝/毫升的质粒pGEM-T-ERCCl-T/T作为交叉阴性对照标准品。分别取阳、阴性对照标准品及甲、乙、丙患者外周血DNA模板5 μ L加入反应试剂50 μ L进行扩增所述试剂包括10XPCR缓冲液5 μ L ;浓度各为2. 5mM的dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP, 3. 5mmol/L 的 MgCl2,1. 5U 的 TaqDNA 聚合酶，浓度 500nM 正向引物 -cagtccagaacactgggacatgac-3 ,反向引物 5 -ggtcatccctattgatggcttctg
-3',浓度 50nM 突光标记探针 5’ TAMRA-ccaaattcccagggcacgttgcgcacg-3’ ,反应条件94-95 V 变性 4-10min 后，95 °C 孵育 5_40 秒，55-60 V 孵育 15-60 秒，72 V 孵育 10-60 秒，35-45个循环，最后室温孵育检测。每个反应均作复孔。ERCCl基因Codonl 18 T单核苷酸多态性的均相检测以上述步骤克隆的含1-1000拷贝/毫升的质粒pGEM-T-ERCCl-118T/T作为阳性对照标准品，以含IO7拷贝/毫升的质粒pGEM-T-ERCCl-C/C作为交叉阴性对照标准品。分别取阳、阴性对照标准品及甲、こ、丙患者外周血的DNA模板5 μ L加入反应试剂50 μ L进行扩增50ηΜ的荧光标记探针5’ FAM-ccaaattcccagggcacAttgcgcacg-3’， 其他试剂和反应条件同上。姆个反应均作复孔。奴用 Fluorescence Polarization Capable Instrument Victor (PerkinElmerLife Science,美国)荧光偏振检测仪检测对照品和样本反应产物的荧光偏振值FP。荧光偏振測定在室温下进行，分别于激发波长535nm，吸收波长590nm检测每个对照品及样本反应产物的TAMRA荧光的偏振值FP，分别于激发波长485nm，吸收波长530nm检测每个对照品及样本反应产物的FAM荧光的偏振值FP，以mP为国际单位。应用SPSS统计软件对实验结果进行分析，计算姆个对照及样本的FP均值(means)及标准差(S. D.)ユ检验统计阳性对照及阴性对照反应终液FP值分布，得到最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonl 18单核苷酸多态性。如待测样品FP值〉阴性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，如待测样品FP值<阳性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源，如待测样品FP值 > 阳性临界值Cut-off值，但同时< 阴性临界值Cut-off，则靶位点状态无法判断，需重新检测。患者外周血DNA同时以测序法检测，以验证荧光偏振检测結果。DNA 5μ L加入普通测序反应试剂50yL进行扩增所述PCR扩增结合试剂包括IOXPCR缓冲液 5μ L ;浓度各为 2. 5mM 的 dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP, 2. 5mmol/L 的 MgCl2,1. 5 U的 TaqDNA 聚合酶，500nM 的正向引物 5’ -cagtccagaacactgggacatgac-3'，反向引物5’ -ggtcatccctattgatggcttctg-3’,反应条件是95°C变性 4min 后，95°C孵育 20 秒,55。。孵育40秒，72°C孵育20秒，35个循环，72°C延伸5min，反应结束后样品经I. 2%琼脂糖凝胶电泳验证，应用紫外光凝胶成像系统观察。扩增产物纯化送测序(ABI 377 instrument,AmpliCycle sequencing kit, Perkin Elmer, USA).
2)、结果总结于下列表1，2
ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性C基因型的均相检测
表I.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S. D.)ERCTI 118 ΑΜΜΑ_ 雛:i I)」
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*数据以FP值均值(means) 土标准差(S. D)表示.
这些结果显示了本发明的TAMRA荧光偏振FP值与ERCCl (118)单核苷酸多态性具有良好的相关性，阴性对照PGEM-T-ERCC1-118T/T荧光偏振FP值与阳性对照最低检测下限pGEM-T-ERCCl-118 C/C荧光偏振FP值有显著的分布差异。最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) (160. 4+7. 3=167. 7) <阴性对照反
应终液FP均值-FP标准差(S. D.) (189. 88-13. 75=176. 13)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)=160. 4，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)+FP标准差(S. D.)=160. 4 +7. 3=167. 7，该法灵敏度高、最低检测下限达100拷贝/毫升，特异性强，即使阴性对照高达IO7拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，故据此判断患者甲外周血DNA样本的ERCCl基因Codonll8位点无C基因型，患者乙、丙外周血DNA样本的ERCCl基因Codonl 18位点含C基因型，该判断与测序法结果一致(附图1，2，3)。ERCCl基因Codonl 18单核苷酸多态性T基因型的均相检测
表2.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S. D.)
ERCCI 11SFAM* .. Wi:.; ■一 s. D. ·*
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*数据以FP值均值(means) 土标准差S. D表示·
这些结果显示了本发明的FAM荧光偏振FP值与ERCCl (118)单核苷酸多态性具有良好的相关性，阴性对照PGEM-T-ERCC1-118C/C荧光偏振FP值与阳性对照最低检测下限PGEM-T-ERCC1-118T/T荧光偏振FP值有显著的分布差异。最低检测下限阳性对照反应终液FP 值 +FP 标准差(S. D.) (170. 7+10. 5=181. 2) < 阴性对照反
应终液FP均值-FP标准差(S. D.) (203. 12-16. 7=196. 42)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) =170. 7，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.) =170. 7+ 10. 5 =181. 2，该法灵敏度高、最低检测下限达100拷贝/毫升，特异性強，即使阴性对照高达IO7拷贝/毫升，仍未出现假阳性结果，故据此结果，判断患者こ外周血DNA样本的ERCCl基因Codonll8位点无T基因型，患者甲、丙外周血DNA样本的ERCCl基因Codonll8位点含T基因型，该判断与测序法结果一致(附图1，2，3)。我们的方法对ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性C/C、T/T及C/Τ基因型成功检测，并通过基因测序验证了该法准确性。证明该法检测外周血ERCCl CodonllS单核苷酸多态性准确可靠，适用进行临床检测。实施方案2
胃癌患者外周血ERCCl基因第118位密码子上C/Τ单核苷酸多态性的均相检测预测钼类耐药性
I)、材料和方法
分别抽取丁、戍、己患者外周血I毫升，分别使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(天根生物，北京)进行外周血样品DNA提取，基因组DNA的提取，按照说明书程序操作。ERCCl基因CodonllS C单核苷酸多态性的均相检测分别取阳、阴性对照标准品及丁、戊、己患者外周血DNA模板5 μ L加入反应试剂50 μ L进行扩增所述试剂包括浓度50ηΜ的突光标记探针5’ FITC -caaattcccagggcacgttgcgcacg-3’，其他试剂和反应条件、步骤同实施方案I。ERCCl基因CodonllS T单核苷酸多态性的均相检测分别取阳、阴性对照标准品及丁、戊、己患者外周血的DNA模板5 μ L加入反应试剂50 μ L进行扩增所述试剂包括浓度为50ηΜ的突光标记探针5’ R110-caaattcccagggcacAttgcgcacg-3’，其他试剂和反应条件、步骤同实施方案I。患者外周血DNA同时以测序法检测，所述试剂和反应条件同实施方案I。2)、结果总结于下列表3，4
ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性C基因型的均相检测
表3.样品、阳性及阴性对照反应终液FP值均值(means)及标准差(S. D.)
权利要求
1.一种用于测定样品中ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤(1)从样品中得到提取物使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，并纯化，得到纯化的提取物；(2)扩增结合将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.O 2. 5mmol/L 的 dNTP (dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP)，2. O 3. 5mmol/L 的 MgC12，1-5U/ μ I的TaqDNA聚合酶，浓度为O. 2-2. O μ mo I/L的ERCCl基因第4个外显子涵盖第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性区DNA的上游引物、下游引物，以及浓度为O. 05-0. 2ymol/L的ERCCl基因Codonl 18 C/T单核苷酸多态性的带荧光标记的DNA探针，所述反应条件是94-96 V 变性 4-10min 后，95 °C 孵育 5-40 秒，53-63 V 孵育 15-60 秒，72 V 孵育 10-60 秒，35-45个循环，最后室温孵育；(3)检测检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S. D. )，t检验统计阴、阳性对照反应终液FP值分布最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonl 18单核苷酸多态性 待测样品FP值〉阴性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源， 待测样品FP值< 阳性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源， 待测样品FP值〉阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值< 阴性临界值Cut-off，则靶位点状态无法判断，需重新检测。
2.权利要求I的检测法，其中步骤(I)包括在试剂或试剂盒中进行处理获取基因组DNA ;其中所述获取基因组DNA的试剂或试剂盒为内含蛋白酶K、细胞裂解液的DNA提取液，及内含酚/氯仿、乙醇或DNA纯化用DEAE树脂或DNA吸附柱的试剂，回收的DNA通过PCR来扩增，在PCR扩增过程中，ERCCl基因第4个外显子涵盖第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性保持不变。
3.权利要求I或2的检测法，其中所述引物为ERCCl基因第4个外显子涵盖第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性区DNA的通用的上游引物、下游引物，所述5’端带荧光标记的探针为ERCCl基因第4个外显子涵盖第118位密码子CodonllS单核苷酸多态性同源的探针，能够与所获得的扩增子结合以产生能够检测的荧光偏振值变化；荧光偏振仪检测所述各反应终液以获得荧光偏振测量值；以及将荧光偏振测量值与特征性荧光偏振数值相比较，所述特征性荧光偏振数值为对照反应终液FP均值、Cut-off值。
4.权利要求I或2的检测法，根据待测ERCCl基因第118位密码子Codonl18单核苷酸多态性附近的DNA序列，避开单核苷酸多态性位点设计通用引物，其中所述覆盖ERCCl基因第118位密码子Codonll8单核苷酸多态性通用引物序列为正向引物5’ -cagtccagaacactgggacatgac-3’，反向弓丨物 5’ -ggtcatccctatt gatggcttctg-3’，Codonl 18 C/C 基因型探针序列为 5’ -ccaaattcccagggcacgttgcgcacg-3 ，或 5’ -caaattcccagggcacgttgcgcacg-3J，或 5’ -caaattcccagggcacgttgcgcad， 或 5’ -caaattcccagggcacgttgcgd，或 5’ -caaattcccagggcacgttgcg-3J，或 5’ -caaattcccagggcacgttgc-3’，Codonl 18 T/T 基因型探针序列为 5’-ccaaattcccagggcacAttgcgcacg-3 ,或 5 -caaattcccagggcacAttgcgcacg-3 ,或 5 _caaattcccagggcacAttgcgcac_3 ,或 5 -caaattcccagggcacAttgcgc-3’ , 或 5 -caaattcccag ggcacAttgcg-3’ , 或D -caaattcccagggcacAttgc—3 。
5.权利要求I或2的检测法，其中所述末端标记的荧光素为TAMRA(四甲基罗丹明)，或FAM (羧基荧光素)、RllO (罗丹明)、FITC (异硫氰酸荧光素)、TET (四氯荧光素)、HEX (六氯荧光素)、ROX、BTR。
6.权利要求I的检测法，其进ー步包括下述步骤提供多个ERCCl基因第118位密码子Codonl 18 单核苷酸多态性对照ERCCl Codonl 18 C / C 阳性对照 pGEM-T-ERCCl-C/C，ERCClCodonl 18 T / T 阳性对照 pGEM-T-ERCCl_118T/T，且互为交叉阴性对照，S卩 pGEM-T-ERCCl-C/C为 ERCCl Codonl 18T / T 的阴性对照，pGEM-T-ERCCl_118T/T 为 ERCCl Codonl 18 C / C 的阴性对照每个阳、阴性对照溶液具有不同的已知浓度；每个阴、阳性对照加入扩增结合反应试剂进行反应；以及测量每个所述标准对照反应液的荧光偏振值以提供多个对应于已知ERCClCodonllS单核苷酸多态性的荧光偏振数值，满足最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)。
7.权利要求1-6任ー项的检测法，其中所述Cut-off值为用SPSS软件计算阴、阳性对照反应终液FP值均值和标准差，t检验法统计阴、阳性对照反应终液FP值分布，所得到的Cut-off值，满足最低检测下限阳性对照反应终液FP值+FP标准差(S. D.) <阴性对照反应终液FP均值-FP标准差(S. D.)，阳性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means)，阴性临界值Cut-off=最低检测下限阳性对照FP均值(means) +FP标准差(S. D.)，待测样品FP值与Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性。
8.权利要求1-7任ー项的检测法，其中所述待测样品FP值与阴性对照反应终液FP均值、Cut-off值比较即知ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性具体是指如待测样品FP值〉阴性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列非同源，如待测样品FP值<阳性临界值Cut-off值，靶位点与反应中所加入相应荧光标记的探针序列同源，如待测样品FP值 > 阳性临界值Cut-off值，但同时待测样品FP值<阴性临界值Cut-off,则靶位点状态无法判断，需重新检测。
9.实施权利要求1-8中任一项检测的试剂盒，其包括DNA提取试剂，DNA纯化试剂，扩增结合试剂，明、阳性对照、引物以及特异性探针。
10.权利要求9所述试剂盒，其中特异性引物序列为正向引物t> -cagtccagaacactgggacatgac-3',反向 引物 -ggtcatccctattgatggcttctg-3 ,Codonl 18 C/C 基因型探针序列为 5’-ccaaattcccagggcacgttgcgcacg-3’，或 5 -caaattcccagggcacgttgcgcacg-3 , 或 5 _caaattcccagggcacgttgcgcac_3 ,或 5 -caaattcccagggcacgttgcgc-3 , 或 5 -caaattcccagggcacgttgcg-3 ,或 5’-caaattcccagggcacgttgc-3’ ， Codonl18 T/T 基因型探针序列为 5’-ccaaattcccagggcacAttgcgcacg-J’ , 或 5 -caaattcccagggcacAttgcgcacg-3 , 或D -caaattcccagggcacAttgcgcac-3 , 现 D -caaattcccagggcacAttgcgc-3 , 或D -caaattcccag ggcacAttgcg-3 ,或 D -caaattcccagggcacAttgc-3 。
11.一种用于测定样品中ERCCl基因Codonll8单核苷酸多态性的探针，其序列为 Codonl 18 C/C 基因型探针序列为 5’_ccaaattcccagggcacgttgcgcacg_3’，或 5’-caaattcccagggcacgttgcgcacg-3J ， 或 5’-caaattcccagggcacgttgcgcac-3J ，或 5’-Caaattcccagggcacgttgcgc-Si， 或 5’ -caaattcccagggcacgttgcg-3J，或 5’-caaattcccagggcacgttgc-3’ ， Codonl18 T/T 基因型探针序列为 5’-ccaaattcccagggcacAttgcgcacg-3’ ， 或 5’-caaattcccagggcacAttgcgcacg-3’ ， 或.5’-caaattcccagggcacAttgcgcac-3’ ， 或 5’-caaattcccagggcacAttgcgc-3’ ， 或.5’-caaattcccagggcacAttgcg-3’，或 5’_caaattcccagggcacAttgc_3’。
12.—种用于测定样品中ERCCl基因CodonllS单核苷酸多态性的引物，其序列为正向弓丨物 5’ -cagtccagaacactgggacatgac-3’，反向弓丨物 5’ -ggtcatccctattgatggcttctg-3’。
13.权利要求11或12所述的探针或引物在制备检测ERCCl基因Codonl18单核苷酸多态性的试剂或试剂盒中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种基于荧光偏振的ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性的均相检测方法。本发明克服了现有技术存在的成本高、操作步骤繁琐、易发生污染和影响检测结果准确性问题，本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测ERCC1基因第ll8位密码子Codon118单核苷酸多态性，检测结果更客观准确。结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于检测临床血液或组织标本。
文档编号C12N15/11GK102676661SQ20121012767
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者姜英浩, 张菊, 梁平, 王萌 申请人:中国人民解放军第四军医大学