专利名称：一种运用于法医鉴定痕量dna的预扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种高效的运用于法医鉴定痕量DNA的预扩增方法，属于法医物证生物学、人类学、刑侦学等领域。
背景技术：
在现行的法医鉴定方面，DNA扩增技术趋于成熟，但当模板量低于IOOpg时就很难通过常规的方法进行检测，同时指纹在犯罪侦查中十分重要，但犯罪现场的一些特征点不全的残缺指纹往往会给法医鉴定造成阻碍，通常指纹中会存在极少的脱落细胞，由于细胞数目较少，DNA总量不高很难成为DNA检材。在实际案例中，在犯罪现场往往会有嫌疑人或事件责任人遗留的指纹，常规的指纹检测是通过形态学线条特征点来认定个体，但一些残缺的指纹特征点较少往往不能作为个人认定的手段，指纹中的DNA总量又比较低，很难直接运用于DNA检测。随着DNA扩增技术的发展，一些痕量DNA成为指证犯罪嫌疑人的另一有效途径。随着对短串联重复序列(short tandem repeat, STR)的研究逐渐深入,特别是STR-DNA分型技术的科学性和实用性得到广大司法部门和社会各界的一致认可和高度重视，从而在各类案件和事件的调查中发挥其作用。然而，由于犯罪现场的DNA残留量甚微，痕量法医物证DNA采集、回收率低进一步导致了后续的DNA检出率低，STR分型失败，不能指认犯罪个体的主要原因。目前，已有大量研究和文献报道痕量DNA扩增技术(Cheung VG. Nelson etal. 2005、Hanson EK. Ballantyne J et al. 2005、Marchion A. et al. 2001> Sun G.,2005、陈玲et al. 2007, Li Y. et al. 2008)。其主要的技术包括
I、 基于热循环以PCR为基础的WGA技术，如简并寡核苷酸引物、连接反应介导的PCR、扩增前引物延伸反应等。2、基于等温反应不以PCR为基础的WGA技术，如多重置换扩增和基于引物酶的全基因组扩增技术。3、 在STR-DNA扩增条件方面，主要采用Profiler Plus (美国ABI公司)试剂盒的IOul扩增体系。目前的技术在实际应用中，对于DNA含量高的样本检出率较高，分型较容易，如从现场遗留的血痕，体液痕迹(郑会芬，董研et al. 2006)，甚至吃剩的食物上可以检测到罪犯的DNA (张晓红，唐建新et al. 2006)，然而对于DNA含量低于IOOpg的样本容易出现等位基因的失衡甚至丢失分型困难(Sun G. et al. 2005，刘维瑜and金春莲2007、HellaniA. et al. 2004 ,Ballantyne KN. et al. 2007)。而残缺的指纹则是犯罪现场较为常见的法医物证,对这一样品DNA的成功检出可以极大地提高法医物证DNA的检出率。痕量DNA的前期扩增能有效的提高的STR-DNA分型的成功率，为指证犯罪嫌疑人提供很大的帮助。参考文献[1]Cheung VGj Nelson SF. Whole genome amplification using a degenerateoligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on lessthan one nanogram of genomic DNA. Proc Natl Acad Sci USA， 1996，93(25):14676-14679.
[2]Hanson EKj Ballantyne J. Whole genome amplification strategy forforensic genetic analysis using single or few cell equivalents of genomic DNA.Anal Biochem, 2005，346(2): 246-257.
[3]Marchio A， Terris B， Meddeb M， Pineau P， Duverger A， Tiollais P，Bernheim A，Dejean A. Chromosomal abnormalities in liver cell dysplasia detectedby comparative genomic hybridisation. Mol Pathol，2001，54(4): 270-274.
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[8]刘维瑜，金春莲.多重置换扩增——一种新的全基因组扩增技术.国际遗传学杂志，2007，30 (4): 265-268.
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发明内容
本发明的目的是针对IOOpg以下不利于STR分型的DNA模板，改进了针对STR分型预扩增的条件，优化了引物组合和扩增体系，提供了一种运用于法医鉴定痕量DNA的扩增技术，能最大程度的对痕量DNA进行扩增，为下一步STR成功分型奠定基础。本发明中运用于法医鉴定痕量DNA扩增方法的试剂，主要由Primer Mix、dNTP、牛血清白蛋白(BSA)、10X反应缓冲液(Reaction Buffer)、Phi29 DNA聚合酶；其中，PrimerMix为primer I至primer36的36种引物混合物(36种引物序列见表I)，dNTP为DNA合成的原料，扩增的酶为Phi29，BSA是协助扩增的佐剂，其在反应体系中的含量为
Primer Mix (primerI 和 primer2 终浓度为 l-3uM，primer3_primer36 终浓度0.005-0. IuM) Each 2. 5mM dNTP4_8ul
权利要求
1.一种运用于法医鉴定痕量DNA预扩增方法，其特征在于按如下步骤进行 (1)准备预扩增反应体系中各反应试剂，反应体系总体积为70-100ul，反应体系包含 IX 反应缓冲液、IO-IOOpg 痕量 DNA 模板、l_3uM 的 primerl、l_3uM 的 primer2、0.005-0. I u M primer3-primer36 的 34 个引物、4-8ii I 的 dNTP、2_4iil 的 0. 5%BSA 和l-2uL的Phi29 DNA聚合酶，余量用双蒸水补足； 首先将36种引物混合均匀，在混合溶液中加入7-lOiU的IOX反应缓冲液和IO-IOOpg痕量DNA模板，用双蒸水补足58-93ul ； (2)将步骤(I)中混合物置于PCR仪中98°C预变性5-10min；(3)取出变性后溶液，在冰上放置10-20min，然后向其中加入dNTP4_8U I、0.5%BSA2-4 u l、l-2uL 5000U的Phi29 DNA聚合酶，混匀后放回PCR仪中扩增，其中每种dNTP 浓度为 2. 5mM, PCR 扩增条件为 30_35°C扩增 10_18h ；65°C 10_30min ；4°C^ ； (4)_20°C保存痕迹DNA预扩增后产物，备用。
2.根据权利要求I所述运用于法医鉴定痕量DNA预扩增方法，其特征在于primerl-primer36 的 36 种引物序列如 SEQ ID NO. I- SEQ ID NO. 36 所不序列。
3.根据权利要求I所述运用于法医鉴定的痕量DNA扩增方法中所用试剂制成的痕量DNA预扩增试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种运用于法医鉴定痕量DNA的预扩增方法，该方法旨在将痕量的DNA通过扩增得到较高浓度的DNA模板便于后续法医鉴定，其主要方法是通过多引物组合，探究出组合引物的最佳的浓度和配比体积；同时还优化了扩增条件，力争使得痕量DNA高效率、高保真的扩增，为下一步法医甄别个体提供可能。
文档编号C12Q1/68GK102634510SQ20121012772
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者史斌, 唐文如, 朱晖, 李安, 柳海涛, 罗瑛, 蔡海强 申请人:昆明理工大学