专利名称：一种南美蟛蜞菊总rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种菊科植物总RNA提取的优化方法，适用于南美蟛蜞菊等富含多糖、酚类化合物植物组织总RNA的提取，属于生物技术领域。
背景技术：
从植物组织中提取高质量的RNA是进行植物分子生物学研究的必要前提和关键。很多植物组织中富含多糖、酚类等次生代谢物质，造成RNA在提取过程中氧化、褐化和降解，不利于RNA的分离和纯化。针对普通多糖、酚类含量低的植物材料，Trizol类方法产品便可以提取，但ー些多糖，多酚及次级代谢产物丰富的植物组织，采用普通的提取方法并不能得到高质量的RNA，常残留大量的多糖、多酚和ー些次级代谢产物。细胞在破碎后能释放很多的酚类物质，这些酚类物质极易被氧化成褐色物质而与RNA发生不可逆结合。而多糖的许多理化性质由于与RNA极为相似而很难将两者分开，一方面在去除多糖的同时，很容易将RNA也裹携带走，造成RNA提取量减少；另一方面在沉淀RNA吋，多糖和RNA易混合产生凝胶状沉淀，由于多糖能抑制许多酶的活性，被多糖污染的RNA样品很难用于进ー步的分子生物学相关实验和研究。由此看来，能否在RNA的提取过程中有效抑制或去除多糖，酚类等次生代谢物是提取高质量RNA的关键。南美蟛蜞菊是菊科蟛蜞菊属植物，全年常緑，花朵淡雅，着生紧簇，景观效果极佳，加之生性粗放，繁殖容易，是华南地区的重要杂草和园林绿化植物。目前对于南美蟛蜞菊的研究主要集中在生长发育、繁殖特性、药用价值及对其他ー些植物化感作用的生理生化机理等方面，而对其分子水平上的研究较少。随着植物功能基因组学的发展，运用分子生物学技术和手段对重要的杂草和园林绿化植物进行遗传改造已成为当前的ー个研究热点。因而，对这些重要园林绿化植物的分子水平的研究，如构建cDNA文库、Northern杂交、RT-PCR等就显得十分重要，甚至可以运用转基因的方法对南美蟛蜞菊的花色进行遗传改造，培育具有不同花色的新品种，使其拥有更高的观赏价值，从而更好地发挥其作为地被、造景植物的优势。
发明内容
本发明的目的在于建立一种富含多糖多酚类植物总RNA的高效提取方法，实验操作简单，成本低，重复性好，能获得高质量的RNA，为进行植物分子生物学的研究奠定基础。本发明所提供的提取南美蟛蜞菊总RNA的方法，按照以下步骤进行
I)取O. 5^1. Og新鮮的南美蟛蜞菊叶片在液氮中充分研磨至细粉状，并快速转移到装有I. 5^2mL预冷RNA提取缓冲液的离心管中，振荡混匀后于65°C水浴30mirT60min。2)加入1.5 2mL氯仿，上下颠倒离心管混匀，4 °C，1200(Tl4000r/min，离心IOmin 15min。3)从上层水相中转移900 1200uL至另ー离心管中，加入300 400uL 8mol/L的LiCl 溶液，混匀后，_20°C沉淀过夜；4°C，1200(Tl4000r/min，离心 30mirT60min，弃上清，カロΛ 500ulTE 溶解。4)加入 500uL 氯仿，上下颠倒混勻，4°C, 12000 14000r/min,离心 10min 15min。5)转移400uL上层水相至新的离心管中，加入400uLこ醚，并剧烈震荡混匀，4°C，12000 14000r/min，离心 IOmin 15min。6)将300uL上层水相转移到新的离心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和750uL 无水こ醇，-50°C放置 30min 60min。7) 4°C, 12000 14000r/min 离心 IOmin 15min,弃上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 70% 80% (体积百分浓度)こ醇洗涤两次，4°C，800(Tl0000r/min离 心，弃上清，室温下自然干燥。9)用灭菌的DEPC水溶解沉淀，_80°C保存备用。其中所述的RNA提取缓冲液每IOOmL中含有IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL500mM EDTA pH8. 0,2% (质量体积百分浓度)的CTAB，O. HmolNaCl，2% 3% (体积百分浓度)β-巯基こ醇，O. 5mol ニ硫苏糖醇(DTT)，2°/Γ4% (质量体积百分浓度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)0其中所述的溶剂氯化锂(LiCl)、醋酸钠(NaAc)、TE缓冲液用O. 1%的焦碳酸ニこ酯(DEPC)水配制，灭菌。其中所述的70°/Γ80%的こ醇用灭菌后的O. 1%的DEPC水配制。
本发明的方法优点是特别适合一些多糖、酚类等次生代谢物质含量丰富的植物材料。利用CTAB抽提缓冲液来提取南美蟛蜞菊组织的RNA，是鉴于菊科植物中含有大量多糖和酚类等次生代谢物质。在采取CTAB法裂解南美蟛蜞菊细胞并除去其组织碎片后利用LiCl选择性地沉淀RNA，以除去其他物质对RNA提取和纯度的干扰，以获得高质量的RNA样品。
图I为1%的琼脂糖凝胶电泳检测南美蟛蜞菊组织总RNA的结果图。
具体实施例方式实施例I
1.实验药品的配制
配制 RNA 提取缓冲液(IOOmL) : IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0,2%(质量体积百分浓度)的CTAB，0. 14mol NaCl，2°/T3% (体积百分浓度)β -巯基こ醇，O. 5molニ硫苏糖醇(DTT)，2°/Γ4% (质量体积百分浓度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)。8mol/L 的 LiCl (O. 1% 的 DEPC 水配制)
TE缓冲液(O. 1%的DEPC水配制)
3mol/LNaAc (O. 1% 的 DEPC 水配制)
70% 80%こ醇(用灭菌后的O. 1%的DEPC水配制)
2.实验用品处理
实验所用的所有陶瓷玻璃器皿，离心管及枪头等均用O. 1%的DEPC水37°C浸泡过夜，120°C高压灭菌Ih以上。65°C烘干备用。电泳槽，制胶板及加样梳均用2. 59Γ3. 5%的双氧水浸泡处理。
实验步骤
I)取O. 5g新鲜的南美蟛蜞菊叶片在液氮中充分研磨至细粉状，并快速转移到装有
1.5mL预冷RNA提取缓冲液的离心管中，振荡混匀后于65°C水浴30min。2)加入I. 5mL氯仿,上下颠倒离心管混勻,4°C, 12000r/min,离心lOmin。3)从上层水相中转移900uL至另ー离心管中，加入300uL 8mol/L的LiCl溶液，混匀后，_20°C沉淀过夜；4°C，12000r/min，离心30min，弃上清，加入500ulTE溶解。4)加入500uL氯仿，上下颠倒混勻，4°C, 12000r/min,离心lOmin。5)转移400uL上层水相至新的离心管中，加入400uLこ醚，并剧烈震荡混匀，4°C，12000r/min,离心 IOmin06)将300uL上层水相转移到新的离心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和·750uL无水こ醇，-50°C放置30min。7) 4°C, 12000r/min 离心 lOmin,弃上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 70% (体积百分浓度)こ醇洗漆两次,4°C, 8000r/min离心,弃上清，
室温下自然干燥。. RNA样品纯度和完整性的检测
用两种方法检测紫外吸收光谱检测、琼脂糖凝胶电泳检测。(I)紫外分光光度计检测用紫外分光光度计测定所抽提的南美蟛蜞菊RNA样品在 230nm、260nm 和 280nm 处的吸光光度值 A23tl=O. 031、A260=O. 068、A280=O. 035. A260A280 值为I. 94，A260A230值为2. 19。一般RNA的A260/A280的值在I. 8—2. O之间，且越接近于
2.O, RNA的纯度越高；A260/A230的值大于2. 0，表明所提RNA样品没有盐类污染，RNA纯度较闻。(2)琼脂糖凝胶电泳检测用I. 0%的含EB的琼脂糖凝胶，在120V的电压下电泳15min。15min后关闭电泳仪开关,在凝胶成像系统下拍照。图I电泳图结果显示三条RNA条带，分别为28S、18S、5S。28S与18S的宽度和亮度比接近2 : 1，5S带的亮度则比较浅，并且没有DNA的污染，说明按上述方法所提取的RNA质量较好，达到纯度要求。与其他方法相比，所提取的南美蟛蜞菊的RNA发生降解和DNA残留情况都不明显，RNA质量高，可以用于后续实验。实施例2
1.实验药品的配制
配制 RNA 提取缓冲液(IOOmL) : IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0,2%(质量体积百分浓度)的CTAB，0. 14mol NaCl，2°/T3% (体积百分浓度)β -巯基こ醇，O. 5molニ硫苏糖醇(DTT)，2°/Γ4% (质量体积百分浓度)聚こ烯吡咯烷酮(PVP)。8mol/L 的 LiCl (O. 1% 的 DEPC 水配制)
TE缓冲液(O. 1%的DEPC水配制)
3mol/LNaAc (O. 1% 的 DEPC 水配制)
70% 80%こ醇(用灭菌后的O. 1%的DEPC水配制)
2.实验用品处理
实验所用的所有陶瓷玻璃器皿，离心管及枪头等均用O. 1%的DEPC水37°C浸泡过夜，120°C高压灭菌Ih以上。65°C烘干备用。电泳槽，制胶板及加样梳均用2. 59Γ3. 5%的双氧水浸泡处理。实验步骤
I)取I. Og新鲜的南美蟛蜞菊叶片在液氮中充分研磨至细粉状，并快速转移到装有2mL预冷RNA提取缓冲液的离心管中，振荡混匀后于65°C水浴60min。2)加入2mL氯仿,上下颠倒离心管混勻，4°C, 14000r/min,离心15min。3)从上层水相中转移1200uL至另ー离心管中，加入400uL 8mol/L的LiCl溶液，混匀后，_20°C沉淀过夜；4°C，14000r/min，离心60min，弃上清，加入500ulTE溶解。4)加入500uL氯仿，上下颠倒混勻，4°C, 14000r/min,离心15min。
5)转移400uL上层水相至新的离心管中，加入400uLこ醚，并剧烈震荡混匀，4°C，14000r/min,离心 15min。6)将300uL上层水相转移到新的离心管中，加入IOOuL 3mol/LNaAc (ρΗ5· 2)和750uL无水こ醇，-50°C放置60min。7) 4°C, 14000r/min 离心 15min,弃上清，收集沉淀。8)沉淀用ImL 80% (体积百分浓度)こ醇洗涤两次，4°C，10000r/min离心，弃上
清，室温下自然干燥。本发明中CTAB是ー种较强的阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中能与蛋白质、多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸，通过抽提能将核酸从蛋白、多糖等杂质中分离出来。缓冲液中的EDTA能螯合Mg2+等金属离子，从而抑制RNase的活性。β -巯基こ醇和ニ硫苏糖醇(DTT)—方面能抑制RNase和酚类氧化酶的活性，同时作为抗氧化剂，可以与酚类竞争性氧化，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚类在提取过程中更易被除去。聚こ烯吡咯烷酮(PVP)能与酚类形成一种不溶的的络合物，有效地去除多酚，減少酚类对RNA的影响；同时也能与多糖结合，去除多糖。Li+能将步骤ー种未被氧化的酚类化合物去除，同时将部分多糖留在上清液中，使RNA更易沉淀。NaAc能选择性沉淀RNA,而不沉淀多糖和蛋白质等,达到进ー步使RNA和蛋白质、多糖分离的效果。在提取RNA的过程中，防止RNA的降解是关键的一歩，所以在实验过程中使用ー些变性剂使RNA酶失活，防止酚类氧化，如β -巯基こ醇、ニ硫苏糖醇(DTT)、聚こ烯吡咯烷酮(PVP)等。こ醚能够使混杂在RNA中的多糖在离心后分布于有机相，以达到分离多糖和RNA的目的。在整个实验过程中，由于RNA很容易降解，故实验操作尽可能在低温下进行。
权利要求
1.ー种南美蟛蜞菊总RNA的方法，其特征在于按照以下步骤进行 I)取O. 5^1. Og新鮮的南美蟛蜞菊叶片在液氮中充分研磨至细粉状，并快速转移到装有I. 5^2mL预冷RNA提取缓冲液的离心管中，振荡混匀后于65°C水浴30mirT60min ； 2)加入I.5 2mL氯仿，上下颠倒离心管混匀，4で，1200(Tl4000r/min，离心IOmin 15min ； 3)从上层水相中转移90(Tl200uL至另ー离心管中，加入30(T400uL8mol/L的LiCl溶液，混勻后，-20°C沉淀过夜；4°C, 12000 14000r/min,离心30min 60min,弃上清，加入500ulTE 溶解；4)加入500uL氯仿，上下颠倒混勻，4°C,12000 14000r/min,离心10min 15min ； 5)转移400uL上层水相至新的离心管中，加入400uLこ醚，并剧烈震荡混匀，4°C，12000min 14000r/min,离心 IOmin 15min ； 6)将300uL上层水相转移到新的离心管中，加入IOOuLpH5. 2的3mol/LNaAc和750uL无水こ醇，-50°C放置30mirT60min ；7)4°C, 12000 14000r/min 离心 10min 15min,弃上清，收集沉淀； 8)沉淀用ImL体积百分浓度为70% 80%こ醇洗涤两次，4°C，800(Tl0000r/min离心，弃上清，室温下自然干燥； 9)用灭菌的DEPC水溶解沉淀，_80°C保存备用。
2.根据权利要求I所述的ー种南美蟛蜞菊总RNA的方法，其特征在于其中所述的RNA提取缓冲液每 IOOmL 中含有IOmL IM Tris-HCl pH8.0，4mL 500mM EDTA pH8. 0，质量体积百分浓度为2%的CTAB，0. 14molNaCl，体积百分浓度2% 3% β -巯基こ醇，O. 5mol ニ硫苏糖醇，质量体积百分浓度2°/Γ4%，聚こ烯吡咯烷酮。
3.根据权利要求I所述的ー种南美蟛蜞菊总RNA的方法，其特征在于其中所述的溶剂氯化锂、醋酸钠、TE缓冲液用O. 1%的焦碳酸ニこ酯水配制，灭菌。
4.根据权利要求I所述的ー种南美蟛蜞菊总RNA的方法，其特征在于其中所述的70% 80%的こ醇用灭菌后的O. 1%的DEPC水配制。
全文摘要
本发明一种南美蟛蜞菊总RNA的提取方法,属于生物技术领域。将新鲜的南美蟛蜞菊材料用液氮研磨成细粉状，65℃温浴30分钟后加入等体积的氯仿混匀，4℃低温离心。加入LiCl溶液进行沉淀，离心弃上清，用TE溶解沉淀后加入等体积的氯仿，离心，取上清至新的离心管中，加入乙醚离心取上清，重复乙醚操作两次后，再加入NaAc和无水乙醇沉淀RNA。离心后弃上清，用70%的乙醇洗涤一次，获得的沉淀室温下干燥，用灭菌的DEPC水溶解，-80℃中保存备用。本发明实验过程简单，设备和实验条件要求低，结果准确、有效，重复性好，对于富含酚类、多糖的植物组织总RNA的提取具有重要的指导和实际意义。
文档编号C12N15/10GK102676502SQ20121013105
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者付卫国, 杜道林, 杨冉, 田远飞, 薛永来, 黄萍 申请人:江苏大学