专利名称：一种简单、快速提取柳枝稷组织总rna的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及植物的基因克隆、基因功能分析等分子生物学实验，具体涉及ー种简单、快速提取植物组织总RNA的方法，适用于植物组织总RNA的提取。
背景技术：
随着现代分子生物学的发展及其向各个学科的滲透，越来越多的分子水平技术被应用于植物的研究。如采用转基因技术增强植物的抗逆性，提高光合效率，増加生物学产量等。植物总RNA提取技术是ー项植物分子生物学的基本实验技术，也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提，对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。利用分离得到的纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于Northern杂交，mRNA纯化、构建cDNA文库，通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。由于自然界和实验室都存在大量的RNA酶，因此RNA的提取产物极易降解，给实验带来较大的困难。因此如 何快速提取RNA并防止RNA的降解而使之储存较长的时间，一直是分子生物学研究人员要解决的ー个难题。尽管RNA的提取已经成为很成熟的技术，但在实际研究中经常很难做到顺利获得质量好的RNA。这归咎于很多因素，如材料保存不合理、器皿不洁净、操作不严等，造成RNA的降解。有关植物RNA的提取方法较多，现有的方法主要有异硫氰酸胍法、SDS/酚法、CTAB-LiCL法等，这些方法已经被广泛用于许多植物组织总RNA的提取，但有ー些植物组织中内含物极为复杂，尤其是在富含多糖、多酚、单宁及一些尚未能确定的次生代谢物等情况下，不利于RNA的分离纯化。这些方法在应用时均存在一定的缺陷，如提取时间长，提取所需的条件苛刻，提取率低，提取的总RNA完整性较差等缺点。然而，RNA质量的好坏，决定着实验结果的可信度高低。因此获取一种简单、快速的植物组织总RNA提取方法具有重要意义。柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名rirgai應),又称“能源草”,因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐贫瘠，生物学产量高，被国际上确定为生产染料こ醇的首选生物能源植物，并投入了大量的人力、物カ进行研究开发。其中，采用基因工程技术增加生物学产量，降低木质素含量和提高こ醇产率等方面已成为目前的研究热点之一。而高质量高纯度RNA的提取是生物技术的主要组成部分之一，在遗传转化体系的建立中具有十分重要的意义。柳枝稷因含纤维素及其他杂质较多，使其在提取RNA初期的研磨过程中较难研磨彻底，且耗费时间过长，影响柳枝稷RNA提取效率。本发明提出的一种简单、快速提取植物组织总RNA方法，是植物进行转基因技术的重要前提。本发明的目的是要提供ー种能使提取植物总RNA的时间更短、操作简单、成本低廉、提取效率更高的总RNA提取方法，是由以下方式实现的。首先在研磨过程中加入碳化钨研磨珠，使得研磨时间缩短，且研磨效果更好。其次总RNA提取液含有RNA酶的高效抑制齐U、去垢剂、PH调节剂。高效抑制剂有异硫氰酸胍、水饱和酚，去垢剂为十二烷基肌氨酸钠，PH调节剂为NaAc缓冲液。该RNA提取液成本较低，且简便易得。本发明的总RNA提取方法包括样品研磨、核酸释放、氯仿抽提、异丙醇沉淀、清洗风干五歩，提取过程简单，操作时间短(30-40min)，经济有效，提取率高，提取的总RNA完整性好，适用于植物分子生物学操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速提取植物组织总RNA的方法，操作简单，提取时间短，重复性好，适用性强，能获得高质量、高浓度的RNA，为进一歩分子生物学研究奠定了基础，结果准确有效。本发明所提供的一种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法，按照下述步骤进行
(1)样品研磨取约O.5^1g新鮮的柳枝稷叶片或茎材料于研钵中，加入3_碳化钨研磨珠Γ5个，加入液氮后迅速研磨，重复数次直至磨成粉末，研磨时间控制在lmin，将研磨后的粉末加入预冷的I. 5mL EP管中； (2)核酸释放向步骤(I)中的离心管中加入ImL配制好的RNA提取液，充分振荡，使其混合均匀，平行放置8-10min ；
(3)氯仿抽提12000 14000r/min离心5 8min,取上清液600 800微升转入新的I.5mLEP管中，加入预冷的25(Γ300微升氯仿，在涡旋器上涡旋15s，使其充分混匀；
(4)异丙醇沉淀1200(Tl4000r/min离心8 lOmin，取上层水相200 300微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入200 300微升
异丙醇，上下颠倒数次；
(5)清洗1200(Tl4000r/min离心5 8min，倒掉上清液，加入体积分数为70-80%こ醇洗涤沉淀；
(6)取沉淀物于超净台吹干约8-10min，加入体积分数为O.1%。^0. 1%的焦碳酸ニこ酯(DEPC水)溶解，得总RNA。其中步骤(2)中所述的RNA提取液每IOOml含有2(T30ml的水饱和酚，4飞ml的甘油，O. I O. 2mol的异硫氰酸胍，O. 01 O. 02mol的ρΗ=4· O的NaAc缓冲液，I I. 5ml的十二烷
基肌氨酸钠。本发明的优点在于
I、提取时间短，整个提取操作流程在40min内完成。2、提取植物总RNA完整性好，植物叶片总RNA溶液在紫外吸收波长260nm和280nm下的吸光度比值接近于2 ,其中5s, 18s, 28s条带清晰,28s条带与18s条带的亮度比值接近2。3、提取效率高，RNA量大,可用于文库，Northern blot等。4、RNA提取液的成本较低，且效率较高。
图I为琼脂糖凝胶电泳检测柳枝稷组织总RNA，电泳后用凝胶成像系统拍照所记录的实验结果的效果图，其中1、2所用材料均为柳枝稷叶片和茎的混合物。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例I
A、实验药品的配制RNA提取液，体积分数为O. I %。DEPC水，体积分数为70%こ醇(O. I %。DEPC 水配制)。B、实验用品的处理器皿用体积分数为O. I %。DEPC水浸泡过夜后，120°C灭菌80min,电泳槽及加样梳用体积分数为2%双氧水浸泡30min。C、取材柳枝稷叶片和茎 D、总RNA的提取
(1)样品研磨取约O.5g新鮮的柳枝稷叶片或茎材料于研钵中，加入3mm碳化钨研磨珠3个，加入液氮后迅速研磨，重复数次直至磨成粉末，研磨时间控制在lmin，将研磨后的粉末加入预冷的I. 5mL EP管中；
(2)核酸释放向步骤(I)中的离心管中加入ImL配制好的RNA提取液，充分振荡，使其混合均匀，平行放置Smin ;
(3)氯仿抽提12000r/min离心5min,取上清液600微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入预冷的250微升
氯仿，在涡旋器上涡旋15s，使其充分混匀；
(4)异丙醇沉淀1200(Tl4000r/min离心8min，取上层水相200微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入200微升
异丙醇，上下颠倒数次；
(5)清洗1200(Tl4000r/min离心5min，倒掉上清液，加入体积分数为70%こ醇洗涤沉
淀；
(6)取沉淀物于超净台吹干约8min，加入体积分数为O.1%。的焦碳酸ニこ酯(DEPC水)溶解，得总RNA。E、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定
(O琼脂糖凝胶电泳检测以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取I微升 RNA溶液，4微升 DEPC水，I微升
6 X loading buffer上样。电泳检测条件，电压120V,电流80mA,恒压,缓冲液为体积分数为1%的TAE。柳枝稷叶片组织总RNA的电泳图片如图I所示，可见5s，18s和28s条带清晰。(2)紫外吸收光谱检测用紫外分光光度计测定所抽提RNA样品的A26tl和A28tl值。图中(O 为柳枝稷组织总 RNA 的检测结果=OD260=O. 033，OD280=O. 064，OD260/OD280=2. I，OD260/OD230=2 . 3，得率=256ng/ 微升
。0D26Q/0D28Q的比值越接近于2. O,说明所提取的RNA纯度越高。当0D26Q/0D23Q>2· O吋，说明所提取的RNA样品中没有盐类污染。使用方法提取的RNA得率较高，纯度符合要求。实施例2
A、实验药品的配制RNA提取液，体积分数为O. P/oDEPC水，体积分数为80%こ醇(O. 1%DEPC 水配制)。
B、实验用品的处理器皿用体积分数为O. P/oDEPC水浸泡过夜后，120°C灭菌IOOmin,电泳槽及加样梳用体积分数为3%双氧水浸泡50min。C、取材柳枝稷叶片和茎 D、总RNA的提取
(1)样品研磨取约Ig新鮮的柳枝稷叶片或茎材料于研钵中，加入3mm碳化钨研磨珠5个，加入液氮后迅速研磨，重复数次直至磨成粉末，研磨时间控制在lmin，将研磨后的粉末加入预冷的I. 5mL EP管中；
(2)核酸释放向步骤(I)中的离心管中加入ImL配制好的RNA提取液，充分振荡，使 其混合均匀，平行放置IOmin ；
(3)氯仿抽提14000r/min离心8min,取上清液800微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入预冷的300微升
氯仿，在涡旋器上涡旋15s，使其充分混匀；
(4)异丙醇沉淀14000r/min离心IOmin,取上层水相300微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入300微升
异丙醇，上下颠倒数次；
(5)清洗14000r/min离心8min,倒掉上清液,加入体积分数为80%こ醇洗漆沉淀；
(6)取沉淀物于超净台吹干约lOmin，加入体积分数为O.1%的焦碳酸ニこ酯(DEPC水)溶解，得总RNA。E、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定同实施例I。
权利要求
1.一种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)样品研磨取约O.5 lg新鮮的柳枝稷叶片或茎材料于研钵中，加入3mm碳化钨研磨珠3飞个，加入液氮后迅速研磨，重复数次直至磨成粉末，研磨时间控制在lmin，将研磨后的粉末加入预冷的I. 5mL EP管中； (2)核酸释放向步骤(I)中的离心管中加入ImL配制好的RNA提取液，充分振荡，使其混合均匀，平行放置8-lOmin ;微升 (3)氯仿抽提1200(Tl4000r/min离心5 8min，取上清液600 800微升 转入新的I. 5mL EP管中，加入预冷的25(Γ300微升氯仿，在涡旋器上涡旋15s，使其充分混匀； (4)异丙醇沉淀1200(Tl4000r/min离心8 lOmin，取上层水相200 300微升转入新的I. 5mL EP管中，加入200^300微升异丙醇，上下颠倒数次； (5)清洗1200(Tl4000r/min离心5 8min，倒掉上清液，加入体积分数为70-80%こ醇洗涤沉淀； (6)取沉淀物于超净台吹干约8-10min，加入体积分数为O.1%。^0. 1%的焦碳酸ニこ酯溶解，得总RNA。
2.根据权利要求I所述的ー种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法，其特征在于其中步骤(2)中所述的RNA提取液每IOOml含有2(T30ml的水饱和酚，Γ5ι 1的甘油，O.Γ0. 2mol的异硫氰酸胍，O. ΟΓΟ. 02mol的ρΗ=4· O的NaAc缓冲液，Γ . 5ml的十二烷基肌氨酸钠。
全文摘要
本发明一种简单、快速提取柳枝稷组织总RNA的方法，属于生物技术领域。其具体步骤包括首先实验药品的配制及柳枝稷叶片或茎取材；其次是用化学试剂将生物样品中的核酸释放出来；第三是氯仿抽提游离RNA，异丙醇沉淀得到总RNA；第四是总RNA的鉴定，分别用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳及数据结果，表明所得植物组织RNA完整性好、纯度高并且产率高，可以满足分子生物学研究应用。同时本发明实验过程简便，操作方便、安全，结果准确、有效，重复性好。
文档编号C12N15/10GK102690806SQ20121013105
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者张欣, 杜道林, 杨冉, 田远飞, 薛永来, 黄萍 申请人:江苏大学