专利名称：梅山猪fut1基因及其克隆和原核表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种梅山猪FUTl基因的克隆和原核表达方法，属于生物技术领域。
背景技术：
F18+肠毒素性大肠杆菌是引起仔猪腹泻和水肿病的主要病原，仔猪发病率为30% 40%，对养猪业造成巨大的危 害。F18+大肠杆菌进入猪肠道后，依靠其菌毛黏附在肠上皮细胞表面，与猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘F18+受体结合，进而定居繁殖并产生肠毒素，通过渗透作用引发组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出，从而引起水肿病和腹泻。F18肠毒素大肠杆菌能否致病直接取决于仔猪肠黏膜上皮细胞刷状缘有无与F18黏附素相应的受体(ETEC F18R) ( F18产肠毒素大肠杆菌)。Vogeli等研究表明，α-I-岩藻糖转移酶基因(Futl)是ETEC F18受体蛋白最佳候选基因，位于猪染色体6qll区段，开放阅读框(ORF)的长度为I 098 bp。该基因307位点存在多态性，该处碱基由G突变为A，从而失去一个Hin6 I酶切位点，这个突变也使得苏氨酸代替了丙氨酸，从而改变了蛋白质的构象和功能，导致了猪对ETEC F 18的敏感性差异，其中AA型为抗性基因型，GG和AG型为敏感性基因型。据此可以通过在猪的育种群体中对FUTl基因型的选择，来培育抗E. coli F18 (F18大肠杆菌)腹泻的品系。而晏学明等，施启顺等，包文斌等究了国内外部分猪种FUTl基因M307位点的多态性，均认为群体AA抗性型个体占少数且只出现在外来猪种中。这就充分表明国外猪种的F18大肠杆菌在抗性遗传基础与国内地方猪种存在着明显的差异，适用于国外猪种的通过筛选获得抗性基因型的育种方法并不能同样适合于中国地方猪种。
发明内容
本发明的目的是提供一种梅山猪FUTl基因的克隆和原核表达方法，对梅山猪的FUTl基因进行基因克隆、原核表达，本发明获得了 FUTl蛋白为体外菌毛粘附试验以及制备单克隆抗体提供了良好的实验基础。本发明的目的是保护一种梅山猪FUTl蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO I所示。本发明的另一目的是保护编码上述梅山猪FUTl蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述梅山猪FUTl蛋白基因的原核表达载体同时也是本发明的保护范围。梅山猪FUTl蛋白基因的原核表达载体的构建方法，具体包括如下步骤(I)FUTl基因的克隆取猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA ;以cDNA为模板，以FUTl-EcoRI-Fl和FUTl-SalI-Rl为引物，进行PCR扩增，得扩增产物，所述FUTl-EcoRI-Fl 和 FUTl-SalI-Rl 引物如下FUTl-EcoRI-Fl :5' -ggagaattcatgtgggtccccagcc-3'
FUTl-SalI-Rl:5' -ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3'；(2) FUTl基因克隆载体的构建将步骤(I)所获得回收扩增产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16°C连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUTl，将重组质粒转化至感受态E. coli DH5a菌中，筛选阳性克隆，进行序列分析，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的pMD-18-T-FUTl 重组质粒；(3) FUTl蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计通过信号肽预测工具预测FUTl蛋白在1-11氨基酸存在信号肽；设计一对引物去除信号肽;上游引物FUTl-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUTl_SalI_R2引入SalI 酶切位点；上游引物 FUTl-EcoRI_F2 :5' gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3';下游引 物 FUTl_SalI_R25' caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3';目的片段大小 1059b ;(4) FUTl去信号肽基因的扩增以步骤(2)中所得的重组质粒pMD-18-T-FUTl为模板，以步骤(3)所述FUTl-EcoRI-F2和FUTl_SalI_R2为引物体外扩增出FUTl基因；25μ I反应体系包括模板
1μ l,2XTag PCR master mix 12. 5 μ 1，FUTl-EcoRI_F2 I. 5 μ I, FUTl-Sal I-R2 I. 5μ I,dd H2O 8· 5 μ I . PCR 参数为 94°C 5min,然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,共 30 个循环，最后72°C延伸lmin。扩增出目的序列，胶回收目的序列；(5) FUTl基因原核表达载体的构建 用限制性内切酶EcoRI及Sal I双酶切回收的目的片段，同时将原核表达载体PGEX-6P-1进行双酶切，再将酶切过的目的片段和载体用T4DNA连接酶16°C连接过夜构建重组质粒PGEX-6P1-FUT1 ;将重组质粒转化至BL21菌株，培养后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切鉴定，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的PGEX-6P-1-FUT1 BL21 菌株。FUTl基因的表达的方法将转化有重组表达质粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接种到含IOOmg / L氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜；次日以I %的接种量接种到5 m L含100 m g / L氨苄青霉素的L B液体培养基，扩大培养3h后，用终浓度为Immol /L的IPTG进行诱导，于37°C在180r / min摇转培养4h ;取菌液离心后用PBS重悬，加入
2X SDS上样缓冲溶液，煮沸5min，冰浴5min后离心取上清进行SDS-PAGE分析。本发明通过RT-PCR方法克隆得到梅山猪FUTl基因ORF序列，构建了含FUTl基因重组表达质粒，并将重组原核表达质粒转化至BL21菌株体内进行诱导表达。梅山猪FUTl基因的表达成功，为研究FUTl作为ETEC F18受体蛋白对菌毛的粘附作用以及FUTl特异性抗体的制备奠定了基础。
图I为FUTl目的基因的PCR扩增图其中泳道I: Marker 2000 ;泳道 2: FUTl 基因图2-1、2-2为pMD-18-T -FUTl的PCR鉴定及其酶切鉴定图其中图2-1自左向右依次为泳道I: IOOOObp Marker ;泳道2: pMD-18-T -FUTl质粒；泳道3: pMD-18-T -FUTl质粒
图2-2自左向右依次为泳道I: Marker 2000 ;泳道2: FUTl基因图3 FUTl去信号肽基因扩增图其中 自左向右依次为泳道I :2000bp Marker ;泳道2 =FUTl去信号肽基因图4-1、4-2为PGEX-6P-1-FUT1质粒的PCR鉴定及酶切鉴定图其中图4-1中自左向右依次为泳道I :2000bp Marker ;泳道2 =FUTl去信号肽图4-2 中自左向右依次为泳道 I: IOOOObp Marker ;泳道 2 :PGEX-6P-1_FUT1图5重组表达质粒在BL21菌中诱导表达鉴定图其中自左向右依次为泳道I :PGEX-6P-1载体诱导4h ;泳道2 :PGEX-6P-1_FUT1重组质粒未诱导；泳道3 PGEX-6P-1-FUT1重组质粒诱导后；泳道4 :蛋白Marker以下结合附图通过具体实施方式
对本发明技术方案做进一步说明。
具体实施例方式FUTl基因的克隆引物设计根据GenBank已发表的猪FUTl基因序列(登录号AF136896. I)设计一对引物。上游引物FUTl-EcoRI-Fl引入EcoRI酶切位点，下游引物FUTl-SalI-Rl引入SalI酶切位点。上游引物FUTl-EcoRI-Fl 5 ,-ggagaattcatgtgggtccccagcc-3',下游弓I物 FUTl-SalI-Rl: 5' -ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3'。目的片段大小为1098 bp。FUTl基因的克隆取梅山猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA。以此为模板，引物FUTl-EcoRI-Fl，FUTl-SalI-Rl为引物体外扩增出FUTl基因。50 μ I 反应体系包括10 X HiFi buffer5 μ I，MgSO4 (50mM) 2 μ I，dNTP (IOmM) I μ I，上下游引各 1μ l,cDNA模板 1μ l，HiFi Taq (5 U/μ L, Invitrogen)O. 2 μ l,dd H2O 37. 8 μ I.PCR 参数为 94°C 5min，然后 94°C 30s, 60 °C 30s, 68 °C lmin，共 30 个循环，最后 68°C 延伸lmin。扩增出目的序列，用1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中拍照，条带大小符合预期(如图I所示)，将胶回收备用。FUTl基因克隆载体的构建的构建所获得回收产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16°C连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUTl。将重组质粒转化至感受态E. coli DH5a菌中，转化产物与37°C，200r/min培养90min后，涂布于含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37°C下培养14h。挑取LB培养基上阳性菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基中，于200r/min培养过夜。提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切鉴定，条带大小符合预期(见图2)，并将鉴定正确的阳性质粒测序，通过序列比对，证实插入序列与设计完全相符，成功地构建了 pMD-18-T-FUTl克隆载体。FUTl蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计通过SignalP 3.0信号肽预测工具预测FUTl蛋白在1-11氨基酸存在信号肽。设计一对引物去除信号肽。上游引物FUTl-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUTl_SalI_R2引入Sail酶切位点。上游引物 FUTl-EcoRI_F2 :5' gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3';下游引物 FUTl_SalI_R25'caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3'。目的片段大小 1059bpoFUTl去信号肽基因的扩增以重组质粒pMD-18-T-FUTl为模板，引物FUTl-EcoRI-F2，FUTl-SalI-R2为引物体外扩增出FUTl基因。25 μ I反应体系包括模板I μ l,2XTag PCR master mix 12. 5 μ 1，FUTl-EcoRI_F2 I. 5 μ I, FUTl-Sal I-R2 I. 5μ I,dd H2O 8· 5 μ I . PCR 参数为 94°C 5min,然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin,共 30 个循环，最后72°C延伸lmin。利用引物FUTl-EcoRI_F2、FUTl-SalI-R2进行PCR扩增，凝胶分析得到1059bp的FUTl基因条带(见图3)。大小与预期一致。 FUTl基因原核表达载体的构建用限制性内切酶EcoRI及SalI双酶切回收的目的片段，同时将原核表达载体PGEX-6P-1进行双酶切，再将酶切过的目的片段和载体用T4DNA连接酶16°C连接过夜构建重组质粒PGEX-6P1-FUT1。将重组质粒转化至BL21菌株，培养后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切进行PCR鉴定(见图4)，并将鉴定正确的阳性质粒进行测序。测序结果与预期一致。FUTl基因的表达将转化有重组表达质粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接种到含IOOmg / L氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜。次日，以1%的接种量接种到5 mL含100 m g / L氨苄青霉素的L B液体培养基，扩大培养3h后，用终浓度为lmmol / L的IPTG进行诱导，于37°C在180r / min摇转培养4h。取菌液离心后用PBS重悬，加入2 X SDS上样缓冲溶液，煮沸5min，冰浴5min后离心取上清进行SDS-PAGE分析。对样品处理后进行SDS-PAGE电泳显示(见图5)，重组质粒经诱导后在60. 5KD附近出现一条明显条带。诱导表达成功。序列表<110>安徽农业大学<120>梅山猪FUTl基因的克隆和原核表达〈130〉I〈160〉6<170> PatentIn version 3. I〈210〉I〈211〉 1098〈212〉DNA〈213〉 Sus scrofa<400> Iatgtgggtcc ccagccgccg ccacctctgt ctgaccttcc tgctagtctg tgttttagca 60gcaattttct tcctgaacgt ctatcaagac ctcttttaca gtggcttaga cctgctggcc 120ctgtgtccag accataacgt ggtatcatct cccgtggcca tattctgcct ggcgggcacg 180ccggtacacc ccaacgcctc cgattcctgt cccaagcatc ctgcctccct ttccgggacc 240tggactattt acccggatgg ccggtttggg aaccagatgg gacagtatgc cacgctgctg 300gccctggcgc agctcaacgg ccgccaggcc ttcatccagc ctgccatgca cgccgtcctg 360gcccccgtgt tccgcatcac gctgcctgtc ctggcgcccg aggtagacag gcacgctcct 420tggcgggagc tggagcttca cgactggatg tccgaggatt atgcccactt aaaggagccc 480tggctgaagc tcaccggctt cccctgctcc tggaccttct tccaccacct ccgggagcag 540atccgcagcg agttcaccct gcacgaccac cttcggcaag aggcccaggg ggtactgagt 600cagttccgtc taccccgcac aggggaccgc cccagcacct tcgtgggggt ccacgtgcgc 660cgcggggact atctgcgtgt gatgcccaag cgctggaagg gggtggtggg tgatggcgct 720tacctccagc aggctatgga ctggttccgg gcccgatacg aagcccccgt ctttgtggtc 780
accagcaacg gcatggagtg gtgccggaag aacatcgaca cctcccgggg ggacgtgatc 840tttgctggcg atgggcggga ggccgcgccc gccagggact ttgcgctgct ggtgcagtgc 900aaccacacca tcatgaccat tggcaccttc ggcttctggg ccgcctacct ggctggtgga 960gataccatct acttggctaa cttcaccctg cccacttcca gcttcctgaa gatctttaaa 1020cccgaggctg ccttcctgcc cgagtgggtg ggcattaatg cagacttgtc tccactccag 1080atgttggctg ggccttga1098〈210〉 2〈211〉365 〈212〉PRT〈213〉Sus scrofa〈400〉2Met Trp Val Pro Ser Arg Arg His Leu Cys Leu Thr Phe Leu Leu ValI51015Cys Val Leu Ala Ala lie Phe Phe Leu Asn Val Tyr Gln Asp Leu Phe202530Tyr Ser Gly Leu Asp Leu Leu Ala Leu Cys Pro Asp His Asn Val Val354045Ser Ser Pro Val Ala lie Phe Cys Leu Ala Gly Thr Pro Val His Pro505560Asn Ala Ser Asp Ser Cys Pro Lys His Pro Ala Ser Leu Ser Gly Thr65707580Trp Thr lie Tyr Pro Asp Gly Arg Phe Gly Asn Gln Met Gly Gln Tyr859095Ala Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gln Leu Asn Gly Arg Gln Ala Phe lie100105110Gln Pro Ala Met His Ala Val Leu Ala Pro Val Phe Arg lie Thr Leu115120125Pro Val Leu Ala Pro Glu Val Asp Arg His Ala Pro Trp Arg Glu Leu130135140Glu Leu His Asp Trp Met Ser Glu Asp Tyr Ala His Leu Lys Glu Pro145150155160Trp Leu Lys Leu Thr Gly Phe Pro Cys Ser Trp Thr Phe Phe His His165170175Leu Arg Glu Gln lie Arg Ser Glu Phe Thr Leu His Asp His Leu Arg180185190Gln Glu Ala Gln Gly Val Leu Ser Gln Phe Arg Leu Pro Arg Thr Gly195200205Asp Arg Pro Ser Thr Phe Val Gly Val His Val Arg Arg Gly Asp Tyr210215220
Leu Arg Val Met Pro Lys Arg Trp Lys Gly Val Val Gly Asp Gly Ala225230235240Tyr Leu Gln Gln Ala Met Asp Trp Phe Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Pro245250255Val Phe Val Val Thr Ser Asn Gly Met Glu Trp Cys Arg Lys Asn He260265270Asp Thr Ser Arg Gly Asp Val He Phe Ala Gly Asp Gly Arg Glu Ala275280285 Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Leu Leu Val Gln Cys Asn His Thr He290295300Met Thr He Gly Thr Phe Gly Phe Trp Ala Ala Tyr Leu Ala Gly Gly305310315320Asp Thr He Tyr Leu Ala Asn Phe Thr Leu Pro Thr Ser Ser Phe Leu325330335Lys He Phe Lys Pro Glu Ala Ala Phe Leu Pro Glu Trp Val Gly He340345350Asn Ala Asp Leu Ser Pro Leu Gln Met Leu Ala Gly Pro355360365〈210〉 3〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<223>FUT1基因PCR扩增上游引物<400> 3ggagaattca tgtgggtccc cagcc25〈210〉 4〈211〉 27〈212〉 DNA〈213〉人工序列<223>FUT1基因PCR扩增下游引物〈400〉 4ccgtcgactc aaggcccagc caacatc27〈210〉 5〈211〉 26〈212〉 DNA〈213〉人工序列<223>FUT1去信号肽基因的扩增上游弓I物〈400〉 5gcacggaatt catgctagtc tgtgtt26
〈210〉 6〈211〉 28〈212〉 DNA〈213〉人工序列<223>FUT1去信号肽基因的扩增下游引物〈400> 6caatgtcgac tcaaggccca gccaacat28·
权利要求
1.一种梅山猪FUTl蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.编码权利要求I所述的梅山猪FUTl蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.含有权利要2所述梅山猪FUTl蛋白基因的原核表达载体。
4.权利要求3所述的的原核表达载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤 (1)FUTl基因的克隆 取猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA ;以cDNA为模板，以FUTl-EcoRI-Fl和FUTl-SalI-Rl为引物，进行PCR扩增，得扩增产物， 所述 FUTl-EcoRI-Fl 和 FUTl-SalI-Rl 引物如下FUTl-EcoRI-Fl :5' -ggagaattcatgtgggtccccagcc-3'FUTl-SalI-Rl:5' -ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3'； (2)FUTl基因克隆载体的构建 将步骤(I)所获得回收扩增产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16°C连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUTl，将重组质粒转化至感受态E. coli DH5a菌中，筛选阳性克隆，进行序列分析，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的pMD-18-T-FUTl 重组质粒； (3)FUTl蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计 通过信号肽预测工具预测FUTl蛋白在1-11氨基酸存在信号肽；设计一对引物去除信号肽；上游引物FUTl-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUTl-SalI-R2引入SalI酶切位点；上游引物 FUTl-EcoRI_F2 :5' gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3';下游引物 FUTl-Sall-R25' caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3';目的片段大小 1059b ; (4)FUTl去信号肽基因的扩增 以步骤(2)中所得的重组质粒pMD-18-T-FUTl为模板，以步骤(3)所述FUTI-EcoRI-F2和FUTl-SalI-R2为引物体外扩增出FUTl基因；25μ I反应体系包括:模板1μ l，2XTagPCRmaster mix 12. 5 μ I, FUTl-EcoRI_F2 I. 5 μ I, FUTl-SalI-R2 I. 5 μ I, dd H2O 8.5 μ I.PCR 参数为 94 °C 5min，然后 94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin，共 30 个循环，最后 72 °C 延伸Imin。扩增出目的序列，胶回收目的序列； (5)FUTl基因原核表达载体的构建 用限制性内切酶EcoRI及SalI双酶切回收的目的片段，同时将原核表达载体PGEX-6P-1进行双酶切，再将酶切过的目的片段和载体用T4DNA连接酶16°C连接过夜构建重组质粒PGEX-6P1-FUT1 ;将重组质粒转化至BL21菌株，培养后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切鉴定，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUTl基因的PGEX-6P-1-FUT1 的 BL21 菌株。
5.一种FUTl基因的表达的方法，其特征在于将转化有重组表达质粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜；次日以1%的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的L B液体培养基，扩大培养3h后，用终浓度为lmmol/L的IPTG进行诱导，于37°C在180r/min摇转培养4h ;取菌液离心后用PBS重悬，力口入2 X SDS上样缓冲溶液，煮沸5min，冰浴5min后离心取上清进行SDS-PAGE分析。
全文摘要
本发明公开了一种梅山猪FUT1基因及其克隆和原核表达，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示；本发明通过RT-PCR方法克隆得到梅山猪FUT1基因ORF序列，构建了含FUT1基因重组表达质粒，并将重组原核表达质粒转化至BL21菌株体内进行诱导表达。梅山猪FUT1基因的表达成功，为研究FUT1作为ETEC F18受体蛋白对菌毛的粘附作用以及FUT1特异性抗体的制备奠定了基础。
文档编号C12N15/54GK102911922SQ20121017160
公开日2013年2月6日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者王桂军, 张海运, 陈建文, 朱英奇, 孙裴, 徐前明, 王蓓, 包文斌, 叶兰 申请人:安徽农业大学