专利名称：一种块菌酒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及含有块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液的保健品及其制备方法。
背景技术：
块菌(Truffle)，也称松露，具有独特的香味、口感和营养价值，人类食用块菌已有上千年的历史。块菌富含17种氨基酸、8种维生素、适量的蛋白质、以及雄性酮、留醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余种生理活性成分。并且含有人体自身不能合成的8种氨基酸、锌、锰、铁、钙、磷、硒等必需营养素，具有增强免疫力、抗衰老、益胃、清神、止血、疗痔等药用价值，具有抗癌活性，对癌细胞有一定的抑制作用，可以激发脑细胞活力。块菌泡制的保健酒香味独特、口感好，绿色保健和药理作用明显，具有壮阳、补肾，降低血清低密度脂蛋白、胆固醇，升高高密度脂蛋白、防止动脉粥样硬化及抗肿瘤等显著功效。·文献报道连续通过10天给药接种有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，发现25mg/kg、50mg/kg的快菌多糖能明显的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生长。同时通过连续给药发现块菌多糖对小鼠脾脏的重量、外周血中的白细胞数及T淋巴细胞百分率具有明显的增加作用；能够促进T淋巴细胞转化，提高小鼠血清中IgG水平等。实验结果表明，块菌多糖作为一种新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制肿瘤作用明显。块菌多糖可以直接从块菌子实体中提取，亦可通过块菌液体深层发酵的方法获得，但前者不适于工业化大生产，原因在于I、块菌作为一种生长于地下的药食两用真菌，在自然界中要求生长于碱性土壤、气候温和的环境，同时与橡树等树种的根系共生，苛刻的生长条件直接导致了天然产量的供不应求；2、为弥补块菌天然产卵量的不足，曾有不少学者进行了半人工模拟培养的研究，但从接种到收获一般需要7-9年时间，周期较长，需要耗费大量的人力和物力；3、由于块菌生长于地下，人工发现的难度较大，采集过程中易受到损伤，同时块菌生长于自然界受环境变化的影响较大，品质较难保证；4、目前市场上销售的新鲜块菌价格昂贵，因此若直接以块菌子实体作为块菌多糖的生产原料则无法回避受原料价格及数量的限制。目前，中国专利200610166503、中国专利申请200810172343公开了生产块菌活性
菌丝体和块菌多糖的方法，均通过斜面培养，一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵的过程获得块菌活性菌丝体和块菌多糖。
发明内容
经过大量的试验，我们惊奇的发现在发酵过程中增加固态发酵能过有效的提高块菌多糖的含量。本发明发酵方法所得的产物用浓硫酸-苯酚法测定块菌多糖的含量，测定结果表明，本发明的方法相比于现有的分批培养，培养产物中黑孢块菌菌丝体比分批培养提高了 20%，尤其是块菌胞外多糖产量比分批培养法提高了 50%，块菌细胞培养中块菌胞内多糖比分批培养法增加了 24. 8 %。同时，我们还发现在培养基中添加适当重量比的榛叶汁，可明显提高块菌菌丝体的产量，培养产物中黑孢块菌菌丝体比分批培养提高了 69. 2%，尤其是块菌胞外多糖产量比分批培养法提高了 150%，块菌细胞培养中块菌胞内多糖比分批培养法增加了 57.3%。本发明的目的是提供一种块菌酒及其制备方法。本发明的目的是提供一种块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液的制备方法。本发明的目的是提供一种适于培养块菌的固态发酵法。本发明的目的是提供一种适于培养块菌的营养水的配方。 具体而言，本发明提供了 一种块菌酒，其原料包含5-95重量份的块菌菌丝体，95-5重量份的谷物。所述的块菌菌丝体的制备方法包括以下步骤I、液体菌种培养I)斜面菌种培养将野生未成熟的新鲜块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入20-35°C恒温培养箱培养2_30天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为将马铃薯200g去皮，切片，煮沸15-20分钟过滤得滤液；将100-300g榛叶放入IOOOml水中煮沸约10-15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖10-30g，琼脂10-30g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为6_9 ；2) 一级液体种子培养将步骤I)中培养的斜面菌种活化后切成2_4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为15-40°C，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为榛叶汁300-900，蔗糖1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸镁1-10，磷酸二氢钾1-10，pH值为6-9 ；3) 二级液体种子培养将步骤2)中培养的一级液体种子按照5-50%体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为15-40°C，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为榛叶汁300-900，蔗糖1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸镁1-10，磷酸二氢钾1-10，pH值为6-9 ；II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉I)配置营养水将蔗糖10_50g，酵母膏0_20g，蛋白胨0_20g，磷酸二氢钾0_10g，硫酸镁O-IOg溶于700-900ml水中，定容至1000ml，调节pH至6_9 ；2)配置固态发酵培养基按重量比为(0. 8-2) I将谷物加入到营养水中；3)固态发酵按照固体发酵培养基干重的1-50%体积/重量,将二级液体种子接种于步骤2)所得的固态发酵培养基上，于20-40°C发酵培养2-60天，料层厚度为1-lOcm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束；4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。所述的块菌菌丝体的制备方法还包括III、液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液；
I)配置液体培养基将100-300g鲜榛叶放入IOOOml水中煮20-40分钟后过滤，取滤液，加入50-200g的蔗糖，IO-IOOg的蛋白胨，5-50g的酵母膏，l_40g的硫酸镁，l_40g的磷酸二氢钾，用水定容至1000ml，调pH值为6-9，消毒灭菌即得；2)发酵条件为按照5-50%体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于I)所得的液体培养基上，装液量为容积的60-80%，在20-40°C，通气速率为30-60升/分钟，搅拌转速为200-800转/分钟的条件下培养2-30天，得块菌菌丝体液；3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。一种块菌酒的制备方法将重量比为I : (0. 1-2)的谷物和块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液作为原料，接入2-8%重量比的甜酒曲和1-5%重量比的活化酵母液后，在20-40°C下发酵2-10天，然后在15-30°C静置发酵20-50天，按照黄酒的酿造工艺，制成块菌 黄酒。一种块菌酒的制备方法将权利要求2所得的块菌菌丝体发酵粉用超声波破碎，120°C蒸煮1-3小时，放至室温；每IOOg块菌菌丝体发酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸预混液；20-4(TC恒温发酵10-30天，然后用纱布过滤，滤液4-8°C发酵20-80天，取上清，微孔滤膜除菌，密封，低温贮存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸预混液包含体积分数为3-8%冰醋酸，酵母5-15g/100mL，糖化酶10_20g/100mL。所述的块菌属菌株选自中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌或夏块菌中的一种或几种。所述的谷物为大米、小米、玉米、紫米，红米，黑米，小麦、大麦、青稞、荞麦或高粱的一种或几种。菌种活化是指将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养,逐级扩大培养,获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境。所述的黄酒是指以粮食为原料的酿造酒，不包括蒸馏的烧酒。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果I、可明显提高块菌菌丝体的产量，比分批培养法提高了 69%。2、可明显提高块菌胞外多糖产量，比分批培养法提高了 150% ；3、可明显提高块菌胞内多糖，比分批培养法提高了 57% ；4、本发明所述的制备方法简单易行，适合工业生产。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌、夏块菌均购自昆明汇珍园块菌有限公司。试验例I对比例(分批培养法)I、液体菌种培养
I)斜面菌种培养将野生未成熟的新鲜黑孢块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入25°C恒温培养箱培养10天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为将马铃薯200g去皮，切片，煮沸17分钟过滤得滤液；再加入蔗糖15g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7 ;2) 一级液体种子培养将步骤I)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为20°C，转速为100转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基(g/L)的配方为蔗糖50，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸镁3，磷酸二氢钾7，PH值为7 ;3) 二级液体种子培养将步骤2)中培养的一级液体种子按照10%体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为20°C，转速为150转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养5天，得含有菌种的二级液体种子； 所述的二级液体种子培养基(g/L)的配方为蔗糖100，蛋白胨30，酵母膏10，硫酸镁5，磷酸二氢钾4, pH值为7 ；II、液态深层发酵法生产块菌菌丝体液；I)配置液体培养基取IOOg的鹿糖，30g的蛋白胨，15g的酵母膏，IOg的硫酸镁，5g的磷酸二氢钾，用蒸馏水定容至1000ml，调pH值为7，分装试管后消毒灭菌即得；2)接种、培养按照10%重量比将II中所得的块菌菌丝体发酵粉接种于I)所得的液体培养基上，在25 °C，通气速率为35升/分钟，转速为250转/分钟的往复式摇瓶机上振荡培养13天,得块菌菌丝体液。2)发酵条件为按照10%体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于I)所得的液体培养基上，装液量为容积的70%，在30°C，通气速率为50升/分钟，搅拌转速为600转/分钟的条件下培养15天，得块菌菌丝体液。块菌多糖含量的检测方法细胞在60°C烘干后称重，烘干的细胞按照文献(Tang, Y. J.，Zhu，L. L.，Li. D. S.，Mi，Z. Y，Li，H. M. Significance ofinoculation density and carbon source on the mycelia growth andTuberpolysaccharides production by submerged fermentation of Chinese truffleTubersinense. Process Biochemistry 2008,43 :576-586.)的方法破碎处理后，用浓硫酸-苯酚法测定块菌多糖的含量。对对比例、实施例I、实施例3进行如下分析测定A、胞外多糖产量的测定在30 y m孔径滤膜过滤下得细胞干重；发酵液中加入四倍体积的无水乙醇，混合过夜，在13000rpm离心沉淀得到胞外块菌多糖。经lmol/L氢氧化钠溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定胞外多糖产量。B、胞内多糖产量的测定菌丝体IOOmg,加入lmol/L氢氧化钠溶解，采用浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖产量，计算胞内多糖产量(胞内多糖含量乘以细胞干重)。表I不同培养方法对块菌菌丝体及多糖产量的影响
权利要求
1.一种块菌酒，其特征在于其原料包含5-95重量份的块菌菌丝体，95-5重量份的谷物。
2.根据权利要求I所述的块菌酒，其中所述的块菌菌丝体的制备方法包括以下步骤 I、液体菌种培养 1)斜面菌种培养将野生未成熟的新鲜块菌子实体，去掉表面泥沙，用解剖刀取中间部位2-3mm的菌肉组织块接种到斜面培养基中，放入20-35°C恒温培养箱培养2_30天，得斜面菌种；所述的斜面培养基配方为将马铃薯去皮，切片，煮沸15-20分钟过滤得滤液；将榛叶放入水中煮沸约10-15分钟过滤得滤液，合并上述二种滤液，再加入蔗糖，琼脂，用蒸馏水定容，调pH值为6-9 ； 2)一级液体种子培养将步骤I)中培养的斜面菌种活化后切成2-4mm的碎菌块转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，在培养温度为15-40°C,转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的一级液体种子；所述的一级液体种子培养基的配方为榛叶汁300-900g/L，蔗糖l_300g/L，蛋白胨l-100g/L，酵母膏 l_20g/L，硫酸镁 l-10g/L，磷酸二氢钾 l-10g/L，pH 值为 6-9 ； 3)二级液体种子培养将步骤2)中培养的一级液体种子按照5-50%体积比的接种量转接入装有二级液体种子培养基的摇瓶中进行二级液体种子培养，培养温度为15-40°C，转速为50-300转/分钟的旋转式或往复式摇瓶机上振荡培养2-15天，得含有菌种的二级液体种子；所述的二级液体种子培养基的配方为榛叶汁300-900g/L，蔗糖l_300g/L，蛋白胨l-100g/L，酵母膏 l_20g/L，硫酸镁 l-10g/L，磷酸二氢钾 l-10g/L，pH 值为 6-9 ； II、固态发酵法生产块菌菌丝体发酵粉 1)配置营养水将蔗糖10-50g，酵母膏0-20g，蛋白胨0-20g，磷酸二氢钾0-10g，硫酸镁O-IOg溶于700-900ml水中，定容至IOOOml，调节pH至6-9 ； 2)配置固态发酵培养基按重量比为0.8-2 I将谷物加入到营养水中； 3)固态发酵按照固体发酵培养基干重的1-50%体积/重量，将二级液体种子接种于步骤2)所得的固态发酵培养基上，于20-40°C发酵培养2-60天，料层厚度为1-lOcm，培养物表面的菌丝体由白转为黄褐色时，发酵培养结束； 4)干燥，粉碎，过筛，灭菌即得块菌菌丝体发酵粉。
3.根据权利要求2所述的块菌菌丝体的制备方法，其中所述的制备步骤还包括 液态深层发酵法生产块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液； 1)配置液体培养基将鲜榛叶放入水中煮20-40分钟后过滤，取滤液，加入蔗糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾，用水定容，调PH值为6-9，消毒灭菌即得； 2)发酵条件为按照5-50%体积比的接种量将I中所得的二级液体种子接种于I)所得的液体培养基上，装液量为容积的60-80%，在20-40°C，通气速率为30-60升/分钟，搅拌转速为200-800转/分钟的条件下培养2-30天，得块菌菌丝体液； 3)将步骤2)所得块菌菌丝体液离心，过滤，干燥，粉碎，过筛，灭菌，即得块菌菌丝体粉。
4.根据权利要求I所述的一种块菌酒，采用以下制备方法 制备方法一将重量比为I : 0. 1-2的谷物和块菌菌丝体粉或块菌菌丝体液作为原料，接入2-8%重量比的甜酒曲和1-5%重量比的活化酵母液后，在20-40°C下发酵2-10天，然后在15-30°C静置发酵20-50天，按照黄酒的酿造工艺，制成块菌黄酒；或 制备方法二 将权利要求2所得的块菌菌丝体发酵粉用超声波破碎，120°C蒸煮1-3小时，放至室温；每IOOg块菌菌丝体发酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸预混液；20-40°C恒温发酵10-30天，然后用纱布过滤，滤液4-8°C发酵20-80天，取上清，微孔滤膜除菌，密封，低温贮存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸预混液包含体积分数为3-8%冰醋酸，酵母 5-15g/100mL，糖化酶 10-20g/100mL。
5.根据权利要求I所述的一种块菌酒，其特征在于所述的块菌属菌株选自中国块菌、印度块菌、黑孢块菌、白块菌或夏块菌中的一种或几种。
6.根据权利要求I所述的一种块菌酒，其中所述的谷物为大米、小米、玉米、紫米，红米，黑米，小麦、大麦、青稞、荞麦或高粱的一种或几种。
全文摘要
本发明属于食品或医药技术技术领域，本发明提供了一种块菌酒及其制备方法。本发明所述制备方法可使块菌菌丝体提高69％；块菌胞外多糖产量提高150％；菌胞内多糖提高57％；本发明所述的制备方法简单易行，适合工业生产。
文档编号C12N1/14GK102676342SQ20121017650
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者郭景龙 申请人:郭景龙