专利名称：检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法
技术领域：
本发明涉 及一种利用实时荧光定量PCR技术检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌的种群动态变化的方法，属于微生物检测领域。
背景技术：
普洱茶是云南特有的历史名茶，是以云南原产地的大叶种晒青毛茶作为原料经过漫长自然后发酵或快速人为发酵加工而成的产品。大叶种晒青毛茶即我们现在市场俗称的生茶；而发酵后得到的产品即为俗称的熟茶，成品后都还可以持续进行自然陈化过程，而且具有越陈越香的独特品质，渥堆发酵是现代普洱茶熟茶制作的关键。普洱茶的渥堆过程其实是一个高温发酵过程，整个过程涉及到错综复杂的生物转化作用，而微生物便是这些生物转化的执行者。因此，要想掌握普洱茶发酵机制、改进发酵工艺，必然需要对微生物进行深入的研究，进而有效为普洱茶渥堆高温发酵的基础理论研究奠定科学基础。分子生物学技术是一项对微生物免培养检测的新技术，实时定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，现已广泛应用于生命科学的各个研究领域。利用实时荧光定量PCR的方法来检测基因的拷贝数是近几年迅速发展起来的新方法，它以快速、安全、成本低等优点渐渐取代了价格昂贵、费时费力的Southern blot法。鉴于目前微生物在普洱茶的发酵过程中，对普洱茶品质形成起着非常重要的作用，而常温及中温微生物的培养检测分离方法又无法真实的反映普洱茶发酵过程中高温微生物的真实状况，难以真实诠释普洱茶渥堆的发酵机理，因此急需建立一套相关的科学检测体系和方法。
发明内容
本发明的目的是综合运用免培养法和荧光定量PCR技术，提供一种检测普洱茶渥堆发酵
过程中特定高温菌的方法，这是一种能精确、有效鉴定普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法。本发明的技术方案如下
(1)序列比对及引物设计
根据特定的高温菌，参照相关文献报道，在NCBI中查找相应的16S rDNA或18S rDNA序列，通过序列比对分析，最终确定出其特异性片段及位置，并以此来设计特异性引物；
(2)茶叶的预处理
取发酵过程中的茶叶2-3g，加入去腐缓冲液20-30ml，静置20_30min，超声处理10-15min,涡旋震荡60_90s后取上清液，将上清液置于60_65°C水浴5min，然后6000-8000g离心5-10min，弃上清液收集菌体沉淀，用去腐缓冲液反复洗涤菌体，直至离心后上清液澄清透明，菌体备用；
(3)高温菌总DNA提取
在预处理后的菌体中加入液氮(加入量可以使菌体冷冻结块即可)、研磨，然后在研磨后菌体中加入DNA提取液，混匀后60-65°C恒温水浴60_90min，冷却；然后加入等体积的氯仿-异戊醇(24 :1)混合液，混匀，10000 rpm离心lOmin，取上清液，再重复提取一次，在取出的上清液中加入等体积的异丙醇和1/10上清液体积的3M pH5. 2的醋酸钠，混匀，-20°C冰浴30min后15000rpm离心15min，弃上清液，DNA沉淀用质量百分比为75%的乙醇清洗2_3次后，干燥，DNA用TE缓冲液溶解，_20°C保存或用琼脂糖凝胶电泳检测；(4)DNA的纯化
在上述DNA溶液中加入Rnase酶，37°C水浴30_45min，然后加入等体积的Tris饱和酚，混勻后IOOOOrpm离心5_10min,取上清液,在上清液中加入等体积的氯仿-异戍醇混合液(24:1),混勻后IOOOOrpm离心5-10min分离,取上清液,加入1/10上清液体积的3M pH5. 2醋酸钠和等体积的异丙醇，混勻_20°C冰浴30-45min, 150000rpm离心15_20min,弃上清,用75%乙醇清洗沉淀，TE缓冲液溶解，_20°C保存；
(5)标准曲线的制作及待测样品的检测
根据合成的标准品计算浓度，并参照公知的标准品拷贝数计算公式计算拷贝数
将标准品10倍系列稀释后，取5个梯度浓度，每个梯度平行三次，进行实时荧光定量PCR反应，读取的荧光数据，并以不同拷贝数的标准品的对数为横坐标，以定量PCR反应过程中达到荧光阈值的初始循环数为纵坐标，制作标准曲线，其中PCR的反应体系为SYBRPremix Ex Taq 10. O μ L，引物各 0· 4 μ L，ROX 参比染料 O. 4 μ L，DNA 模板 2. 0 μ L, ddH206. 8μ L，总反应体积 20. Ομ L ;扩增条件为95 °C 120s, ;95°C 30s，57°C 30s，72°C 60s，40 个循环；在72°C 60s处读荧光数据；按照上述反应体系和条件，对纯化的DNA样品进行荧光定量PCR，读出CT值，根据标准曲线，计算相应的拷贝数。本发明中步骤(2)中用的去腐缓冲液是由下述物质以一定浓度组成的混合液
三羟甲基氨基甲烷盐酸 5(Tl00mM
乙二胺四乙酸二钠5(Tl00mM
聚乙烯吡咯烷酮O. 59Γ1. 0% (W/V)
焦磷酸钠l(T20mM
氯化钠O. 5 I. OM
曲拉通 X-100O. 04%"0. 06%ο本发明中步骤(3)中用的DNA提取液是以下述物质组成的混合溶液
三羟甲基氨基甲烷盐酸 10(Tl50mM
乙二胺四乙酸二钠10(Tl50mM
十六烷基三甲基溴化铵 19T2%W/V氯化钠I. (Tl. 5 M
β-巯基こ醇19T2%W/V。本发明中氯仿-异戊醇混合液是氯仿和异戊醇按体积比24 1混合的溶液。本发明中步骤(4)中所用的标准品是根据筛选比对得出的特异性片段，由上海捷瑞生物公司合成的基因片段。本发明的有益效果本发明提供了ー种客观有效的检测微生物菌群动态变化的方法，其是基于分子生物学中免培养法和实时荧光定量PCR技术联用的实验策略，经检验，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好、检测快速。本发明直接从普洱熟茶中提取菌体总DNA，避免了微生物传统培养分离鉴定的缺陷，且经提取纯化的DNA质量高，为荧光定量PCR扩增检测样品总DNA中特异性片段減少干扰。相对于传统的培养、检测方法而言，该发明能在较短的时间内得出实验结果，大大減少工作量和工作时间，实验结果也真实可信。该发明为有 效的掲示发酵过程中微生物的作用机制，从而为普洱茶渥堆高温发酵的基础理论研究改进生产エ艺奠定科学基础。
图I为本发明中纯化后的样品总DNA电泳示意图；图中1道嗜温高温放线菌纯化后的DNA ；2道嗜热棉毛菌纯化后的DNA ；M道Marker ；
图2为本发明中嗜温高温放线菌与嗜热棉毛菌的荧光定量PCR标准曲线示意图，其中(A)嗜温高温放线菌；(B)嗜热棉毛菌；
图3为本发明中嗜温高温放线菌的扩增曲线示意 图4为本发明中嗜热棉毛菌的扩增曲线示意 图5为本发明中嗜温高温放线菌的解离曲线示意 图6为本发明中嗜热棉毛菌的解离曲线示意 图7为本发明中嗜温高温放线菌在发酵不同阶段菌体动态变化示意 图8为本发明中嗜热棉毛菌在发酵不同阶段菌体动态变化示意图。
具体实施例方式下面通过附图和实施例对本发明作进ー步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例I :检测普洱茶渥堆发酵过程中嗜温高温放线菌动态变化
以实验室从普海熟茶中分离保存的嗜温高温放线菌(Thermoac tinomycesthalpophilus )作为实验菌株验证本发明方法的可行性。(I)參照文献报道，在NCBI中搜索嗜温高温放线菌相应的16S rDNA序列，通过clustalx软件和Boxshade进行序列比对分析,最终确定出其特异性片段及位置，并进行特异性引物设计。嗜温高温放线菌的引物为5’ GCTGGGTTGTAAAACTCTGT 3’和5’CTTTCTCCTGAAGTACCGTC 3’ ；
(2)将嗜温高温放线菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，50°C振荡培养24h，将培养后的菌液离心得到菌体沉淀；将菌体加到加无菌水中，搅拌均匀，再与生茶混合均匀(菌种用量为8mL/200g生茶)，置于50°C温度下进行发酵。发酵周期为ー个月，每六天翻堆一次，共翻堆五次，毎次翻堆抽取茶样品；
(3)取28茶样品加入到50ml离心管中，加20ml去腐洗脱液，静置30min，超声波IOmin后，涡旋震荡90s，取上清，去除管底杂质；将上清液置于65°C水浴5min，然后8000g离心5min，弃上清收集菌体沉淀，用去腐缓冲液反复洗涤菌体，直到离心后上清液澄清透明；
将脱腐后的菌体用液氮研磨，然后将粉状样品添加至O. 5ml DNA提取液中，涡旋震荡混勻，再65°C水浴90min,姆IOmin轻晃摇勻ー下,使菌体充分裂解,冷却2 min后,加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(24:1)，轻轻摇晃，使两者混合均匀；放入离心机中10000 rpm室温离心10 min，取上清液，转移到另ー个干净的管中，再重复上述操作一次；将取出上清液置于新管中，加入1/10上清液体积的3M pH5. 2醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀_20°C冰浴30min后，15000rpm离心15min,倒掉上清液，留下管底白色DNA沉淀；沉淀用Iml质量百分比浓度为75%こ醇清洗后，离心弃こ醇；重复用こ醇洗两次后，干燥，用TE缓冲液融解；
(4)将上述抽提出的核酸加入Rnase酶至终浓度O.25mg/ml，37°C水浴30min，然后加入等体积的Tris饱和酹,混勻后IOOOOrpm离心5min,取上清液,并向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(24:1)，IOOOOrpm离心5min分离，取上清液，加入1/10上清液体积的3MpH5. 2醋酸钠和等体积的异丙醇,混勻-20°C冰浴30min, 15000rpm离心15min,弃上清,用用75%こ醇清洗沉淀，TE缓冲液溶解，-20°C保存；纯化后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，所用的琼脂糖浓度为1% (W/V)，电泳缓冲液为1XTAE，Marker最大条带为15kb，所使用的核酸染料为bioteke核酸染料GL0DVIEW，(见图I中I泳道)；
(5)根据合好的嗜温高温放线菌特异性片段标准品计算浓度拷贝数，计算公式为
权利要求
1.一种检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法，其特征在于按如下具体步骤进行 (1)序列比对及引物设计 根据特定的高温菌，参照相关文献报道，在NCBI中查找相应的16S rDNA或18S rDNA序列，通过序列比对分析，最终确定出其特异性片段及位置，并以此来设计特异性引物； (2)茶叶的预处理 取发酵过程中的茶叶2-3g，加入去腐缓冲液20-30ml，静置20_30min，超声处理10-15min,涡旋震荡60-90s后取上清液，将上清液置于60_65°C水浴5min，然后6000-8000g离心5-10min，弃上清液收集菌体沉淀，用去腐缓冲液反复洗涤菌体，直至离心后上清液澄清透明，菌体备用； (3)高温菌总DNA提取 在预处理后的菌体中加入液氮、研磨，然后在研磨后菌体中加入DNA提取液，混匀后60-65°C恒温水浴60-90min，冷却；然后加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，10000rpm离心lOmin，取上清液，再重复提取一次，在取出的上清液中加入等体积的异丙醇和1/10上清液体积的3M pH5. 2的醋酸钠，混匀，_20°C冰浴30_40min后15000rpm离心15min，弃上清液，DNA沉淀用质量百分比浓度为75%的乙醇清洗2-3次后，干燥，DNA用TE缓冲液溶解； (4)DNA的纯化 在上述DNA溶液中加入Rnase酶至终浓度0. 25 0. 5mg/ ml，37°C水浴30_45min，然后加入等体积的Tris饱和酹,混勻后IOOOOrpm离心5_10min,取上清液,在上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(24:1)，混匀后IOOOOrpm离心5-10min分离，取上清液，加入1/10上清液体积的3M pH5. 2醋酸钠和等体积的异丙醇，混匀-20°C冰浴30_45min，150000rpm离心15-20min，弃上清，用75%乙醇清洗沉淀，TE缓冲液溶解，_20°C保存； (5)标准曲线的制作及待测样品的检测 根据已合成的标准品计算浓度，并参照标准品拷贝数公式计算拷贝数
2.根据权利要求I所述的检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法，其特征在于所述的步骤(2)中用的去腐缓冲液是为了去除发酵茶叶中的腐殖质及茶色素等杂质，其主要由下述物质以一定浓度组成的混合液 三羟甲基氨基甲烷盐酸 5(Tl00mM 乙二胺四乙酸二钠5(Tl00mM 聚乙烯吡咯烷酮0. 5^1. 0%ff/V 焦磷酸钠l(T20mM 氯化钠0. 5 I. OM 曲拉通 X-1000. 04 0. 06%o
3.根据权利要求I所述的检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法，其特征在于所述的步骤(3)中用的DNA提取液是以下述物质组成的混合溶液 三羟甲基氨基甲烷盐酸 10(Tl50mM 乙二胺四乙酸二钠10(Tl50mM 十六烷基三甲基溴化铵 f 2%W/V 氯化钠I. (Tl. 5 M 3 -巯基乙醇I 2%W/V。
4.根据权利要求I所述的检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌群动态变化的方法，其特征在于氯仿-异戊醇混合液是氯仿和异戊醇按体积比24 1混合的溶液。
全文摘要
本发明公开了一种利用实时荧光定量PCR技术检测普洱茶渥堆发酵过程中特定高温菌的种群动态变化的方法，其是分子生物学中免培养法和实时荧光定量PCR技术的联用，采用直接从发酵普洱熟茶中提取菌体总DNA，然后通过荧光定量PCR技术检测样品总DNA中特异性片段的拷贝数，进而推算出普洱茶渥堆发酵过程中不同阶段特定高温菌群的动态变化。本发明方法检测特异性强、灵敏性高，能在较短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果也真实可信，有效的揭示发酵过程中微生物的作用机制，从而为解决普洱茶渥堆高温发酵的基础理论问题和改进发酵工艺奠定科学基础。
文档编号C12Q1/68GK102703593SQ201210191758
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者刘迪秋, 吕昌勇, 孔祥君, 熊向峰, 葛锋, 陈朝银, 韩本勇 申请人:昆明理工大学