专利名称：微流控芯片装置及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微流控芯片，具体地说是涉及一种用于量子点细胞毒性检测的三维培养微流控芯片装置，以及其在量子点细胞毒性检测的应用。
背景技术：
量子点作为一种新兴的纳米材料在生物成像方面具有极大的应用价值，但是其所 具有的细胞毒性却限制了它的广泛使用。对于量子点的毒性机制，众多科学家给出了不同的解释，例如释放出重金属离子、产生活性氧物质和不同的表面性质所引起等。目前量子点细胞毒性的研究大都采用在培养皿中培养细胞或者进行动物实验。文献 Li Y. ; Zhou Y. ;ffang H. ; Perrett S. ; Zhao Y. ; Tang Z. ; Nie G. Angew Chem IntEdit, 2011, 50, 5860-5864通过在培养皿中培养的HepG2细胞证明用不同手性的谷胱甘肽包被的CdTe量子点引起不同程度的细胞毒性。文献Shuhendler A. J. ;Prasad P. ;ChanH. C. ; Gordijo C. R. ; Soroushian B. ; Kolios M. ; Yu K. ; 0 Brien P. J. ; Rauth A.M. ; WuX. Y. ACS Nano, 2011，5，1958-1966在一个患有乳腺癌的动物模型上检测了脂肪酸酯包被的PbSe量子点的细胞毒性。然而，细胞在体内处于一个复杂的细胞-基质和细胞-可溶性因子相互作用的微环境中，这与培养皿中的细胞有很大不同。而动物实验又耗时长、成本高。因此，急需一种高通量、低成本、省时并能更精确地模拟体内环境的平台用于量子点细胞毒性的研究。微全分析系统又称微流控芯片(microfluidic chip)或芯片实验室(lab on achip，L0C)，是指在一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上集成或基本集成化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。在20世纪90年代初，由Manz和Widmer首次提出的微全分析系统(U TAS)的概念，适应了生命科学对生物样品进行更高效、高灵敏、快速分离分析的需求。在过去的几十年中微流控芯片已经在细胞代谢、药物筛选和干细胞组织工程中得到广泛应用。微流控芯片的另一个潜在应用是进行细胞的三维培养和模拟人体器官。三维培养可以在体外条件下最大程度地保留细胞在活体中的特异性的组织功能，分化状态，并能重现活体器官中组织-组织相互作用界面、化学物质的空间浓度梯度和人体力学微环境。文献 Huh D. ;Matthews B. D. ;Mammoto A. ;Montoya-Zavala M. ; Hsin H. Y. ; IngberD. E. Science, 2010，328，1662-1668利用两个紧密并列的微通道在微流控芯片上模拟了肺泡和毛细管的接触面并再现了肺泡的呼吸功能。文献Zhang C. ;Zhao Z. ;AbdulRahim N. A. ; van Noort D. ;Yu H. Lab Chip, 2009，9，3185-3192 利用多通道的微流控芯片模拟了药物在人体中的代谢和储存过程。文献Derda R.;Tang S. K. ;LaromaineA. ;Mosadegh B. ;Hong E. ;Mwangi M. ;Mammoto A. ; Ingber D. E. ; Whitesides G. M. PLoSOne, 2011, 6，el8940通过比较细胞在三维培养基质中不同位置的生长和迁移情况，模拟了组织中不同部位的细胞。由此可见，三维培养微流控芯片是一个很好的药物筛选和毒性检测的体外实验平台，有望代替动物实验，但是，目前尚未将这一平台应用于量子点细胞毒性的研究。
发明内容
针对上述现状，本发明提供了一种用于量子点细胞毒性检测的三维培养微流控芯片装置。该装置结构简单、微型化、成本低、易于制备和操作。该装置能够实现细胞的三维培养和量子点作用于细胞后的毒性检测，并且能够揭示一定的量子点细胞毒性机制。本发明提供了一种微流控芯片装置，其中该装置包括相互连通的主通道和细胞培养腔室，所述细胞培养室包括设置在主通道两侧的近腔室和远腔室。其中，主通道可以模拟血管用于传输细胞培养基和量子点溶液，细胞培养腔室则可以模拟量子点作用的血管周围的邻近组织。所述微流控芯片装置可由聚二甲基硅氧烷芯片与玻璃基底键合而成。
所述近腔室距离主通道0. 6-1. 2mm,所述远腔室距离主通道I. 5-2. 2mm。所述微流控芯片装置的主通道与细胞培养腔室之间有高度差，主通道的高度比细胞培养腔室的高度高30-60 ym。这样可以利用表面张力作用使得细胞和三维培养基质的混合物注入细胞培养腔室时不会泄漏到主通道中。药物从给药血管运输到所要作用的组织中需要两步第一步，药物通过全身分布的血管流到邻近靶向位置的血管中；第二步，药物通过扩散作用穿过血管进入目标组织。因此，药物在组织中的扩散是影响药效的一个重要因素。因此，本发明还提供了一种利用上述微流控芯片装置模拟组织中扩散作用的方法，在所述装置的主通道中注入荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白 (FITC-BSA)，分别在近腔室和远腔室中的相同位置检测荧光强度，模拟血管和组织间的扩散传输过程。以荧光素钠和FITC-BSA为模型药物，其中荧光素钠代表小分子物质，FITC-BSA代表生物大分子。由于这两种物质都具有荧光，将其注入主通道后，定时分别在近腔室和远腔室中的相同位置检测荧光强度。通过荧光强度的比较可以证明距离对扩散过程的影响，在同一时刻近腔室中的荧光强度总是高于远腔室，且荧光素钠代表的小分子物质的扩散速度要快于FITC-BSA代表的生物大分子。这一方法模拟了物质在距离血管不同距离的组织中的扩散过程。本发明提供了一种利用上述微流控芯片装置实现细胞的三维培养的方法，所述三维培养采用的基质为琼脂糖，使用时与磷酸盐缓冲溶液(PBS)以及胎牛血清(FBS)混合，琼脂糖与最终混合物的质量体积比为0. 5%-3%。琼脂糖是一种热可逆和生物兼容性的材料，由(1-3)连结的P -D-半乳呋喃糖和(1-4)连结的(3-6)-脱水- a -L-半乳呋喃糖共聚而成，可用于生物传感器。琼脂糖的熔点和胶凝温度可以通过改变分子量和修饰官能团来调控。低熔点琼脂糖在25°C凝固，低于37°C的胶凝温度适合进行细胞捕获，本发明中使用的为低熔点琼脂糖。琼脂糖凝胶中存在一定大小的孔径，适合细胞培养所需的营养物质等的通过。在细胞培养腔室中，细胞被琼脂糖包裹，很好地模拟了细胞在体内被细胞外基质包裹的三维环境。因此本发明提供的三维培养微流控芯片能很好地模拟体内微环境，适合用作量子点细胞毒性研究的体外实验平台。本发明还提供了一种利用所述微流控芯片装置检测量子点细胞毒性的方法，用荧光探针检测细胞凋亡、细胞内活性氧物质(ROS)和细胞内谷胱甘肽(GSH)的变化。所述的荧光探针是可分别特异性地识别细胞凋亡、细胞内活性氧物质或细胞内谷胱甘肽的特异性荧光探针。细胞凋亡、细胞内活性氧物质的增加和谷胱甘肽的减少是检测量子点细胞毒性常用的几个指标，细胞内活性氧物质的增加和谷胱甘肽的减少都表明量子点毒性增强。芯片中三维培养下的细胞用不同浓度的量子点溶液作用后，将主通道中的量子点溶液替换为相应的检测细胞毒性的特异性荧光探针，由于三维培养基质的扩散功能，孵育一段时间后，在荧光显微镜下成像、拍照，即可分析其毒性。本发明还提供了一种利用本发明的微流控芯片装置证明量子点细胞毒性机制的方法，以3-甲基腺嘌呤作为一种细胞自吞噬抑制剂，在量子点溶液作用细胞前，先注入主通道中，作用于细胞后，再进行量子点细胞毒性实验，用透射电子显微镜对比经3-甲基腺 嘌呤作用的细胞与没有经3-甲基腺嘌呤作用的细胞内形成吞噬小泡的情况，结合细胞凋亡率解释自吞噬作用对量子点细胞毒性的影响。细胞内形成的吞噬小泡越多说明量子点的细胞毒性越大，反之则小。细胞的自吞噬作用是细胞降解大块细胞质、长寿命蛋白和整个细胞器的一种途径，是细胞程序性死亡中的一种重要的保护机制。有研究表明细胞的自吞噬作用在量子点细胞毒性机制中同样举足轻重。本发明的微流控芯片装置还可以在药物筛选或环境毒物检测中应用。综上可见，本发明的有益效果为本发明的用于量子点细胞毒性检测的三维培养微流控芯片装置展示了一些显著的优点，包括制作简单，易于操作，所用材料生物兼容性好，细胞培养条件更接近于体内微环境，能模拟血管和周围组织间的扩散作用，并能用于量子点毒性机制的证明。
图I是根据本发明的三维培养微流控芯片装置的结构示意图。图2是利用根据本发明的微流控芯片装置以荧光素钠为模型药物对组织中扩散作用进行模拟的荧光强度照片。图3利用根据本发明的微流控芯片装置以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为模型药物对组织中扩散作用进行模拟的荧光强度照片。图4是利用根据本发明的微流控芯片装置以荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为模型药物对组织中扩散作用进行模拟的荧光强度变化数据分析，以最高荧光强度为100% ;图中显示的是三组平行实验的结果。图5是利用根据本发明的微流控芯片装置对H印G2细胞进行三维培养的三天内细胞活性突光表征。图6是利用根据本发明的微流控芯片装置对H印G2细胞进行三维培养的三天内细胞存活率分析图；图中显示的是三组平行实验的结果。图7是利用根据本发明的微流控芯片装置对羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)作用于H印G2细胞后的细胞凋亡荧光照片；发出亮蓝色荧光的为凋亡细胞。图8是利用根据本发明的微流控芯片装置对羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)作用于H印G2细胞后的细胞凋亡率数据分析；图中显示的是三组平行试验的结果。图9是利用根据本发明的微流控芯片装置对羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)作用于H印G2细胞后的细胞内活性氧物质(ROS)和谷胱甘肽(GSH)变化荧光照片；R0S的红色荧光越强表明量子点产生的细胞毒性越强，GSH的绿色荧光越弱表明量子点产生的细胞毒性越强。图10是利用根据本发明的微流控芯片装置对羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)作用于H印G2细胞后的细胞内活性氧物质(ROS)和谷胱甘肽(GSH)变化数据分析；图中显示的是三组平行试验的结果。图11是利用根据本发明的微流控芯片装置对自吞噬作用是量子点细胞毒性机制之一的验证透射电子显微镜表征细胞内吞噬小泡(以黑色箭头标出)的形成和线粒体的形 变(以白色箭头标出)。图12是利用根据本发明的微流控芯片装置对自吞噬作用是量子点细胞毒性机制之一的验证3-甲基腺嘌呤作用与否的细胞凋亡对比荧光照片。图13是利用根据本发明的微流控芯片装置对自吞噬作用是量子点细胞毒性机制之一的验证近腔室和远腔室中3-甲基腺嘌呤作用与否的细胞凋亡数据分析，图中显示的是三组平行试验的结果，图中*表示有显著差别，**表示有非常显著差别。
具体实施例方式下面通过实施例结合附图对本发明做进一步的说明。若无特殊说明，所用实验方法为常规实验方法；所使用的试剂和材料等均可通过商业途径获得。本发明中的微流控芯片采用“二次曝光”技术用软光刻方法制作而成。其制备方法如下模具的制作硅片用水虎酸溶液处理、洗净、烘干后，用匀胶机以2000rpm的转速在表面甩一层SU-82050负光胶，在65°C烘烤lOmin，95°C烘烤4min后，经紫外曝光、显影、氮气吹干后，即得到第一层细胞培养腔室的图案。然后以IIOOrpm转速甩第二次负光胶，经上述同样的操作后，即可得到第二层主通道的图案，模具即制作成功。芯片的制作硅烷化使得模具表面疏水，聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物与引发剂以质量比10% I混合倒入模具中，除气泡后在75°C放置2h。将聚合后的PDMS片小心揭下，切割成型，用平头注射器针打孔，然后经氧等离子体处理，与载玻片不可逆键合，芯片即制作成功。实施例I :芯片的结构如图I所示，本发明的微流控芯片装置由主通道和细胞培养腔室构成。其中，主通道可以模拟血管用于传输细胞培养基和量子点溶液，细胞培养腔室则可以模拟量子点作用的血管周围的邻近组织。该装置包括两部分主通道和细胞培养腔室，主通道和细胞培养室连通。所述微流控芯片装置的主通道和细胞培养腔室的高度不同，分别为71 y m和38 y m。这样可以利用表面张力作用使得细胞和三维培养基质的混合物注入细胞培养腔室时不会泄漏到主通道中。所述微流控芯片装置的细胞培养室分为两种，分别为距离主通道0. 8mm的近腔室和距离主通道为2mm的远腔室。实施例2 模拟组织中的扩散作用组织中的扩散作用以荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)为模型药物。在两侧的细胞培养腔室中注入质量体积比为0. 5%的琼脂糖溶液，待其凝结后，分别从主通道中注入100 u M的荧光素钠溶液和2. 75mg/mL的FITC-BSA溶液。在腔室顶部的同一位置用荧光显微镜(Leica DMI 4000B)每隔5min对荧光素钠的荧光强度拍照，每隔IOmin对FITC-BSA的荧光强度拍照。荧光素钠的实验持续120min，FITC-BSA的实验持续300min，结果如图2与图3所示。从图2_4中可以看出随着时间的增长，荧光强度明显变强，表明这两种物质确实扩散进入了琼脂糖中，并且同一时间近腔室中的荧光强度要高于远腔室。三次平行实验结果类似，表明距离的不同引起了扩散程度的不同。 实施例3 HepG2细胞在芯片中的三维培养两盘60cm2培养皿中长满的细胞消解，细胞悬液离心，去除上层清液后，剩余细胞重新分散至细胞密度为106/mL。三维培养基质由IOOiiL 3%(w/v)低熔点琼脂糖溶液、100 u L胎牛血清和100 u L磷酸盐缓冲溶液混合而成。等体积细胞悬液和三维培养基质混合注入本发明的微流控芯片的细胞培养腔室中，芯片在4°C放置IOmin以加速琼脂糖的凝固，将细胞包裹其中。最后，将培养基注入主通道并在芯片表面涂一层，以防止通道中培养基的挥发。芯片置于细胞培养箱中，培养基每天更换，用死活试剂盒(Calcein-AM/EthD-1)每日检测细胞存活率。结果如图5和图6所示，细胞在培养的前三天活性和形态都保持正常，在第三天细胞存活率仍达到85%以上。实施例4 :对羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)细胞毒性分析细胞凋亡、细胞内活性氧物质(ROS)的增加和谷胱甘肽(GSH)的减少是量子点细胞毒性的三个指标，可以用三种特异性荧光探针=Hoechst 33342，二氢乙锭(DHE)和2，3-萘二甲醛(NDA)分别进行检测。以羧基包被的CdTe量子点(CdTe-COOH)用于本次实验。CdTe-COOH量子点的储备液(5mg/mL)逐级稀释至0，10，20，30，40，50 u g/mL。同实施例3将HepG2细胞三维培养24h后，不同浓度的量子点溶液分别注入主通道中，静态下作用24h后，IOOii M的上述荧光探针溶液注入主通道，在37°C培养箱中孵育lh。荧光显微镜(LeicaDMI 4000B)拍照，细胞凋亡用软件Image-Pro Plus 6. 0分析处理，结果如图7和图8所示，其中图7中亮蓝色表示的是凋亡细胞。细胞内ROS的增加和GSH减少用软件QCapture Pro(版本5. I. I. 14)进行处理，结果如图9和图10所示，其中图9中显示细胞中的ROS的红色荧光随着量子点浓度的增加而增加，而细胞中的GSH的绿色荧光随着量子点浓度的增加而减少。从图7-10中都可以看出，CdTe-COOH量子点的细胞毒性具有明显的浓度依赖性，随浓度增大，细胞毒性增强。在同一浓度的量子点溶液作用下，近腔室中的细胞凋亡率明显高于远腔室，ROS的荧光强度也是近腔室中偏高，近腔室中细胞内的GSH减少得更多，且三次平行实验的结果类似，这些结果表明不同的扩散距离确实引起了不同程度的量子点细胞毒性。实施例5 =CdTe-COOH量子点的毒性机制之一——自吞噬作用的表征同实施例3将H印G2细胞三维培养24h后，3mM 3_甲基腺嘌呤的磷酸盐缓冲溶液注入主通道，作用于细胞5h。在不同浓度的CdTe-COOH量子点溶液作用细胞24h后，用同实施例4的方法检测细胞凋亡率。透射电子显微镜用于观察细胞内吞噬小泡的形成(如图10所示),20ii g/mL的量子点溶液作用后的细胞用于该实验,细胞事先分别用和不用3-甲基腺嘌呤处理，不经任何处理的细胞用作对照组。从图11中的电镜图中可以看出，经3-甲基腺嘌呤处理的细胞中的吞噬小泡的数量要明显低于未经3-甲基腺嘌呤处理的细胞(用黑色箭头标出)，并且损伤的线粒体数目也偏少(用白色箭头标出)。而作为对照组的细胞内则没有吞噬小泡的形成，也无线粒体损伤。图12中亮蓝色的为凋亡细胞，从图12和图13中可以看出，在低浓度量子点溶液(〈30U g/mL)作用细胞时，3-甲基腺嘌呤可以明显降低细胞凋亡率。权利要求
1.一种微流控芯片装置，其中该装置包括相互连通的主通道和细胞培养腔室，所述细胞培养室包括设置在主通道两侧的近腔室和远腔室。
2.根据权利要求I所述的装置，其特征在于，所述近腔室距离主通道0.6-1. 2_，所述远腔室距离主通道I. 5-2. 2mm。
3.根据权利要求I或2所述的装置，其特征在于，所述主通道的高度比细胞培养腔室的高度高30-60 u m。
4.一种利用根据权利要求I或2所述装置模拟组织中扩散作用的方法，其特征在于，在所述装置的主通道中注入荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白，分别在近腔室和远腔室中的相同位置检测荧光强度，模拟血管和组织间的扩散传输过程。
5.一种利用根据权利要求I或2所述的装置实现细胞的三维培养的方法，其特征在于，所述三维培养采用的基质为琼脂糖，使用时与磷酸盐缓冲溶液以及胎牛血清混合，所述琼脂糖与最终混合物的质量体积比为0. 5%-3%。
6.一种利用根据权利要求I或2所述的装置实现量子点细胞毒性检测的方法，其特征在于，用荧光探针检测细胞凋亡、细胞内活性氧物质和细胞内谷胱甘肽的变化来判断量子点的细胞毒性。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的荧光探针是可分别特异性地识别细胞凋亡、细胞内活性氧物质或细胞内谷胱甘肽的特异性荧光探针。
8.一种利用根据权利要求I或2所述的装置证明量子点细胞毒性机制的方法，其特征在于，以3-甲基腺嘌呤作为一种细胞自吞噬抑制剂，在量子点溶液作用细胞前，先注入主通道中，作用于细胞后，再进行量子点细胞毒性实验，用透射电子显微镜对比经3-甲基腺嘌呤作用的细胞与没有经3-甲基腺嘌呤作用的细胞内形成吞噬小泡的情况，并结合细胞凋亡率判断量子点的细胞毒性。
9.一种权利要求I或2所述的装置在药物筛选或环境毒物检测中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于量子点细胞毒性检测的三维培养微流控芯片装置，由聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃基底键合而成。该芯片分为两部分主通道和细胞培养腔室。主通道用于模拟血管，细胞培养腔室与主通道有连通但距离不同，用于模拟血管周围不同距离的邻近组织。主通道与细胞培养腔室的高度不同，以使得细胞和三维培养基质的混合物注入细胞培养腔室时不会泄漏到主通道中。该装置还可以证明量子点细胞毒性机制之一是由于细胞的自吞噬作用。根据本发明的微流控芯片装置制作简单，易于操作，能够模拟血管与周围组织间的扩散过程，实现细胞的三维培养和量子点毒性检测，适用于药物筛选和环境毒物分析。
文档编号C12Q1/02GK102728422SQ20121019126
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者吴静, 李海芳, 林金明 申请人:清华大学