专利名称：蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列和应用。
背景技术：
害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也一直是制约农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计全国病虫害发生面积年已由2000年的50亿亩/次增加至2009年的70亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮食损失约占总产的15%-20%，即便如此，每年粮食损
失仍可达300亿 500亿斤。自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等严重问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有效控制出现了转机。据统计，全球转基因作物种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2008年的125百万公顷(其中抗虫的有46百万公顷)，增长了 70多倍，其中也产生了明显的经济与生态效应。但是，随着仅有单一 Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问题也随之日趋备受关注，且在Bt棉田的美洲棉铃虫上已出现抗性迹象。为此，不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物(主要是蝎子、蜘蛛)中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫生物防治作用物，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染等方面有着重要作用。寄生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(如毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirus, PDV)>类病毒颗粒(virus like particle, VLP)、类病毒纤丝(virus like filament, VLF)、卵巢蛋白(ovarian protein, OP)、畸形细胞(teratocyte)等)，以破坏寄主免疫反应,调节寄主生长发育，调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因已成功转入烟草中，使害虫烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制血淋巴黑化)的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白基因PpKazal及其编码的蛋白质。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。备注说明SEQ ID NO 2包含了信号肽。作为本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的改进该多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其具有SEQ ID NO: I中第145-297位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO: I中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ ID NO 1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。作为本发明的基因的改进序列中包含8 66个连续核苷酸(即SEQ ID NO :1中 第145-297位的核苷酸序列中8 66个连续核苷酸)。本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的用途用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。本发明还同时提供了一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防力的方法，包括用具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花科蔬菜细胞培育成植株。本发明所提供的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。本发明利用蝶蛹金小蜂毒腺转录组测序获得了毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列，设计引物利用5’ -RACE和3’ -RACE技术获得目的基因的非编码区，拼接后获得了基因的全长。获得蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的氨基酸序列后，对其进行了多肽的化学固相合成以及原核表达后非变性条件下纯化，化学合成的PpKazal多肽及融合表达含GST标签的PpKazal都能够抑制农业害虫菜粉蝶(Pierisrapae)蛹及柑橘凤蝶(Papilio xuthus)蛹酹氧化酶前体(prophenoloxidase, PP0)的激活，阻止其形成有活性的酹氧化酶(phenoloxidase, PO),具有抑制寄主体液免疫的功能。本发明具体是通过以下技术方案实现的在本发明所分离出的DNA分子包括编码具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO 1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ ID N01中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO :1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列。本发明分离出的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal包括具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO :2序列的多肽。本发明DNA分子包含所述的DNA分子中8_66个连续核苷酸。本发明DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列指编码具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N01中第145-297位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO :1序列编码框第145-297位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ ID NO :1中第145-297位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO :1所述的序列。还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO 1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID N01中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal相同功能的蛋白的SEQ ID NO. I中开放阅读框序列的变异形式。这些 变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal或多肽指具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal活性的SEQ ID NO 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal相同功能的SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又别如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal的活性片段和活性衍生物。在本发明中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽PpKazal保守性变异多肽指:与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。发明还包括蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal或多肽的类似物。这些类似物与天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的差别可以是氨基酸序列上的诧异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L 一氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如^、Y 一氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal多肽时，可以将蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp Kazal表达载体。如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中宿主细胞为原核细胞。常用的原核宿主细胞指得是大肠杆菌细胞。还可用Northern印迹法技术或突光定量PCR分析蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal基因产物的表达，即分析蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal同源基因或同源蛋白。本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变弓I入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用化学固相合成技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City, CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal，通过各种常规筛选方法，可筛选出蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal发生相互作用的物质,或者受体等。本发明在十字花科蔬菜重要害虫菜粉蝶及柑橘害虫柑橘凤蝶血淋巴酚氧化酶激活试验中具有明显的抑制作用，对菜粉蝶及柑橘凤蝶的体液免疫有明显抑制效果。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal正是对农业害虫有免疫抑制作用的新蛋白，因此，具有很大的应用价值。本发明的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列，可按照以下方法获得(I)蝶蛹金小蜂毒腺的解剖及RNA提取取羽化3天左右的蝶蛹金小蜂雌蜂于冰上进行麻痹，Olympus解剖镜下用DEPC处理的水(含有RNAase抑制剂)进行解剖，收集毒腺 及毒囊于盛有Trizol试剂(Invitogen)的离心管(经DEPC处理)中，按照试剂说明书抽提其总RNA。(2) cDNA第一链的合成米用ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA。(3) PCR利用SEQ ID NO : I中蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码的核酸序列设计引物，以蝶蛹金小蜂毒腺第一链cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测后DNA测序即可得到PpKazal编码的核酸序列。本发明涉及的序列及记号分别如下(I)序列特征(A)长度398 bp(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型核苷酸(3)序列描述浙江大学蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal编码序列398DNA蝶蛹金小蜂(Pteromaluspuparum)I GAAAGCAAGTCGTCTGAATAATATTATTCCATAGTGCTTCTGCTCGTGTACCAACGCAAT6I ACAATTTTATTCAAAATTCACGGCAAAATGAACAAGCGCTTGATATCTGTGTTCTTTATTIMNKRLISVFFII2I GTCATGATTGCCATGGCATTTGGATGTGAAGAAGAACAATGTCAAAAAGTTTACAATCCA
12VMIAMAFGCEEEQCQKVYNP181GTGTGTGATAATCTAGGAAATACACACATTAATCCGTGTTTATTCAGATGTGCAGCTGAA32VCDNLGNTHINPCLFRCAAE24IGATTATAAGGCCGAGAATGGAACAGAACTCACTATTGTCAAGTACGAGGAATGTTAGATC52DYKAENGTELTIVKYEEC*30IATACCTTCCGCAACATCAAAATGTAACTACAATCCGTATTATCCATGTGTAAGTTTCAAT361GTTCTTGAAATAAATTGATATTTAATCAAAAAAAAAAA
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I为本发明的PpKazal原核表达的分离纯化图；注M为标准蛋白，I道为未诱导菌株大肠杆菌BL21，2道为含pGEX-PpKazal质粒大肠杆菌BL21诱导后上清，3道为含pGEX-PpKazal质粒大肠杆菌BL21诱导后沉淀，4道为含？6￡乂- 1^^1质粒大肠杆菌此21诱导后上清过纯化柱后的流出液，5，6道为洗脱纯化柱的流出液，7道为纯化后的融合蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal。图2为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal/肽基因表达物对菜粉蝶蛹血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；注阴性对照为TBS缓冲液；阳性对照I为0. 5 Ug微黄滕球菌(M. Iuteus);阳性对照2为0. 5 Ug微黄滕球菌(M. Iuteus)和0. 5 Ug牛血清蛋白；合成PpKazal为含0. 5 u g微黄滕球菌和0. 5 u g化学合成的PpKazal ;表达PpKazal为含0. 5 U g微黄滕球菌和0.5 U g表达含GST标签的融合PpKazal ;GST对照为0. 5 U g表达的GST蛋白和0. 5Ug微黄滕球菌(M. Iuteus);分别加入2 菜粉蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，力口A 200 ill L-dopa (2 mM/L)在470 nm波长下测定30分钟,酹氧化酶活性单位U指每分钟变化的0. 0010D的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析，不同字母表示有显著性差异(唐启义和冯明光，2007 )。图3为本发明的化学合成的和原核表达的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal/肽基因表达物对柑橘凤蝶蛹的血淋巴酚氧化酶激活的抑制效果图；注缓冲液对照为Tris-Ca2+缓冲液；蛋白对照为0. 5 y g牛血清蛋白BSA ;合成PpKazal为0. 5 U g化学合成的PpKazal ;表达PpKazal为0. 5 U g表达含GST标签的融合PpKazal ;标签蛋白对照为0. 5 ii g表达的GST蛋白；分别加入2 U I柑橘凤蝶蛹血淋巴后在室温下放置30分钟，加入200 u I L-dopa (2 mM/L)在470nm波长下测定30分钟，酚氧化酶活性单位U指每分钟变化的0. 0010D的量。数据采用DPS数据分析软件进行方差分析不同字母表示有显著性差异(唐启义和冯明光，2007)。
具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例I :I、蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂PpKazal基因克隆根据蝶蛹金小蜂毒腺转录组数据得到的Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列设计一对引物(正向引物Kaz-SP: 5’ -CATGGCAITTGGATGTGAAG-3’，反向引物Kaz-AP:5’ -TCTGTTCCATTCTCGGCCTT-3’ )以蝶蛹金小蜂毒腺cDNA为模板PCR扩增验证转录组结果，PCR获得一个约200 bp的PCR片段。PCR扩增体系和扩增条件具体如下PCR扩增体系为I OxPCR buffer5
25 mmol/L MgCl25 pi
dNTPs (2.5 mM each )I nl
正肉引物 Kaz-SP (IO mmol/L) I 反肉弓I物 Kaz-AP (10 niind/L) I pi Taqfil (TaKaRa)0.5 pi
蝶麵金小蜂毒腺毒腺cDNAI ill
dH2035.5 pi
总体枳50pL扩增条件为
权利要求
1.蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其特征是具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其特征是所述多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。
3.编码如权利要求I或2所述的蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其特征是其具有SEQ ID NO 1中第145-297位的核苷酸序列；或者与SEQ IDNO 1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ ID NOl中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征是所述序列中包含8 66个连续核苷酸。
5.如权利要求I所述的蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的用途，其 特征是用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。
6.一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防カ的方法，其特征在于包括用具有SEQID No 1所不的核音酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花科蔬菜细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蝶蛹金小蜂毒液PpKazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽的基因，其具有SEQ ID NO1中第145-297位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO1中从核苷酸第145-297位的核苷酸序列杂交。本发明的多肽用于制备蝶蛹金小蜂毒液Kazal类丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。
文档编号C12N15/15GK102731646SQ20121020808
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者叶恭银, 方琦, 王磊, 王飞 申请人:浙江大学