专利名称：一种重金属抗性菌在强化蕈菌富集土壤重金属上的应用及制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物修复技术领域，具体涉及到重金属抗性菌株maiiussp.) CQ4在強化蕈菌富集土壌重金属上的应用，以及利用该菌株制备的制剂。
背景技术：
目前我国受重金属污染的农田土壤面积约2500X 104hm2，每年被重金属污染的粮食多达1200X IO4吨，造成的直接经济损失超过100亿元。重金属污染是土壤各种污染中修复治理难度最大的，土壌重金属可经食物链层层富集传递直到人，严重威胁人类健康。为实现我国社会的可持续发展，保障公民食品安全，有效地去除土壌中的重金属成为我国科技领域ー项十分迫切的任务；
传统的物理和化学工程法拔除土壌重金属污染耗费大且破坏土壤结构，因此近年来生物修复土壌重金属污染成为国际国内重点发展的新技术，主要侧重在植物修复技术、植物-微生物联合修复技术；
作为土壤生态环境中的重要组成因子，土壌微生物能代谢产生许多低分子有机酸、活性有机物，在土壌生态环境中可參与成土作用、促进矿物溶解、改变根际土壤理化性质、促进植物对养分的吸收，同时还能促进土壤中重金属的溶解，有助于植物对重金属的吸收和清除。近几年土壌中重金属抗性微生物在重金属污染生物修复中的强化辅助作用越来越得至帽内外同行的认同和兴趣，迅速形成了当前的研究重点和热点。
发明内容
本发明的目的是针对目前我国严峻的重金属污染的实际问题和需要，提供一株具有重金属抗性并能強化蕈菌富集土壌重金属的微生物新菌种及其制成的菌剂。利用该制剂能有效提高土壌重金属有效态含量并增产蕈菌生物量，同时促进蕈菌对重金属Pb，Cu和Cd的富集的提高，属于环境微生物修复技术领域。技术方案
本发明提供一株具有重金属抗性并能強化蕈菌富集土壌重金属的微生物新菌种及其制成的菌剂。其主要生物学特性为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7. 3 μ m，常以成对或链状排列，具圆端或方端，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。好氧或兼性厌氧，化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。菌落白色大型，中有一色浅圏，边缘向周围延展成波纹状，菌落中部较厚，不透明，边缘延展部分较薄，无色透明。接触酶为阳性，水解淀粉，硝酸盐还原，L-阿拉伯糖和D-木糖不产酸，不利用柠檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感；
芽孢杆菌重金属抗性菌株制成的菌剂，是通过以下方法制备
(1)挑取所述的重金属抗性菌iBacillussp.) CQ4的单菌落,接种于试管斜面；
(2)将重金属抗性菌(Bacillussp.) CQ4的斜面种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；
(3)将上述培养好的菌液按10-15%体积接种量转入种子罐，继续培养至对数生长期。种子罐所用的培养基是SMS培养基。SMS培养基的配方是sucrose, 1%; (NH4)2SO4, 0.1%;K2HPO4, O. 2%; MgSO4, O. 05%; NaCl，O. 01%; yeast extract, 0. 05%; CaCO3, 0. 05%; pH7. 2 ；
(4)将达到对数生长期的种子液按10-15%的接种量接种与生产罐中培养，生产罐所用的培养基配方与种子罐ー样；
(5)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1. 5，搅拌速度为200转/分钟，培养温度为30°C，全程培养时间为48-72小吋，结束后菌体10亿个/ml。发酵完 成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。有益效果
使用该方法分离的抗重金属Pb ,Cu和Cd并强化蕈菌富集土壌重金属Pb ,Cu和Cd的微生物菌株具有生产成本低，使用方便，促富集效果好的优点，适合在实际的生物修复土壌重金属污染中大規模的使用。该发明对实现我国社会的可持续发展，保护生态环境，保障公民食品安全，有效地去除土壌中的重金属具有重要的现实意义；
本发明提供ー种重金属抗性菌sp.) CQ4,田间实验结果表明，与空白对照相比，芽孢杆菌CQ4菌株对重金属Pb，Cu和Cd的活化能力分别提高了 23. 21%，51. 02 %和30.51 %，同时蕈菌的生物量提高了 49. 56%，总Pb，Cu和Cd的富集量分别达到原来的2. 02，2. 13 和 I. 83 倍。
具体实施例方式实施例I
采集菌际重金属污染土壌及其他植物根际与非根际污染土壌。准确称取I g土壤样品，在生理盐水中连续稀释，震荡，静置。取静置后上层的澄清液，再根据污染土壌的所含的重金属种类分别涂布于分别含有Pb，Cu和Cd的SLP培养基。重金属Pb，Cu和Cd分别用200mg 1-1 Pb (Pb (NO3) 2)，50 mg 1-1 Cu (Cu (NO3) 2)和 50mg 1-1 Cd (Cd (NO3) 2)。SLP 培养基的配方是sucrose, 1%; (NH4)2SO4, O. 1%; K2HPO4, O. 05%; MgSO4, O. 05%; NaCl, O. 01%;yeast extract, 0. 05%; pH 7.2。平板在30°C下培养72 h。培养结束后，挑选不同形态的菌落于如前所述的含重金属培养基上反复划线纯化，将生长快，菌落规则，传代稳定的单菌落重点纯化。利用平板稀释法检测这些菌株对所有这三种重金属抗性及最高耐受值，经过反复筛选，得到同时抗 800 mg/ 1-1 Pb，200mg /1-1 Cu 和 200mg/ 1-1 Cd 的菌株--CQ4。其中所有的分离步骤都使用SLP培养基，因为这种低磷培养基可以有效避免重金属盐类的沉淀。其主要生物学特性为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7. 3 μ m，常以成对或链状排列，具圆端或方端，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。好氧或兼性厌氧，化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。菌落白色大型，中有一色浅圈，边缘向周围延展成波纹状，菌落中部较厚，不透明，边缘延展部分较薄，无色透明。接触酶为阳性，水解淀粉，硝酸盐还原，L-阿拉伯糖和D-木糖不产酸，不利用柠檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感；
实施例2取实施例I中所述的重金属抗性菌(Bacillus sp.) CQ4的单菌落,接种于试管斜面。将抗重金属Pb，Cu和Cd并强化蕈菌富集土壤重金属Pb，Cu和Cd的(Bacillus sp.) CQ4的斜面种接种于LB培养基摇瓶中。LB培养基(g/Ι)配方如下蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7. 0-7. 2。恒温振荡培养至对数生长期。将上述培养好的菌液按10-15%体积接种量转入已经121°C高压湿热灭菌并冷却至35°C左右的种子罐，种子罐所用的培养基是 SMS 培养基。培养基的配方是(sucrose, 1%; (NH4)2SO4, O. 1%; K2HPO4, O. 2%; MgSO4,
O.05%; NaCl, O. 01%; yeast extract, O. 05%; CaCO3, O. 05%; pH 7.2)。继续培养至对数生长期。培养过程中无菌空气的通气量为1:1. 5，搅拌速度为200转/分钟，培养温度为30°C。将达到对数生长期的种子液按10-15%的接种量，接种于生产罐中培养。生产罐所用的培养基配方与种子罐一祥。生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0. 8-1. 5，搅拌速度为200转/分钟，培养温度为30°C，全程培养时间为48-72小吋，结束后菌体10亿个/ml。发酵完成后培养液出罐直接作为强化蕈菌富集的液体剂； 应用例I
检测菌株对重金属Pb，Cu和Cd的活化能力。实验研究用土收集于四川大学本实验室Pb-Cu-Cd人工污染实验土壤，在本实验之前，该土壤已作为实验用土，供蕈菌修复研究使用过一次，而后一直放置于大棚中达十个月之久，以固定平衡重金属，实现对天然污染土壌的更好模拟。土壤过100目筛，经连续三天121°C高温灭菌I h以消除土壌原有微生物影响。取在SLP液体培养基中培养，长至对数晩期的菌液，经6000 rpm离心10 min,无菌双蒸水洗涤两次，离心重悬，制成约IO9 cfu πιΓ1的菌悬液。以I ml菌悬液接种10 g前面灭菌好的污染土壌，室温下培养10 d，然后直接加入100 ml去离子水以提取土壌中活化态的Pb，Cu和Cd。土壤悬液先经10000 rpm离心10 min，上清经微孔滤膜过滤后，加入两滴浓HNO3(GR)以防止金属沉淀和抑制微生物生长。滤液中的Pb，Cu和Cd浓度通过火焰原子分光光度计(VARIAN，SpectrAA-220Fs)进行測定。对照为不加抗性菌。室温下培养10 d后，与对照相比，重金属Pb，Cu和Cd的活化能力达到到原来的6. 48，6. 29和5. 72倍，主要是因为土壤中重金属抗性菌可分泌生物表面活性剤，有机酸和产生铁载体等，进而活化重金属，増加土壌中金属的生物可利用性；
表I. CQ4对土壤中重金属的活化能力(mg/kg)
IPb ]Cu [Cd 对照 11.46 31. 46 2. 72 CQ4 174. 12]l97. 51 [l5. 55
应用例2
用盆栽实验检验其对蕈菌生物量的增强效应。每ー盆含有7. O kg如上所述非灭菌污染土壤和I. O kg蕈菌菌袋。用于土壤接种的细菌采用SMS培养基进行培养。制备IO9 cfuπιΓ1的菌悬液，在种植蕈菌的时候，每盆喷洒IOml菌悬液进行接种。对照组用10 ml无菌去离子水接种。用大棚控制蕈菌的生长条件，为尽量消除不同位置对盆栽实验的影响，不同处理的盆栽完全按照随机排列。同时，为保证结果的可靠性，每ー处理设置三个重复。在将要开伞的时候，从土中小心拔出子实体，先用O. 01 M EDTA多次清洗，再用去离子水清洗，以去除表面非特异结合的金属元素。洗浄后的子实体在80°C下烘干，測定其干重。与对照相比，喷施抗性菌的蕈菌，其生物量提高了 98. 18% ；
表2. CQ4菌株对蕈菌生物量(干重)的影响
权利要求
1.ー种重金属抗性菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阳性的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的CQ4菌株，其主要生物学特性为细胞呈直杆状，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7.3μπι，常以成对或链状排列，具圆端或方端，以周生鞭毛运动；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境；好氧或兼性厌氧，化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型；菌落白色大型，中有一色浅圈，边缘向周围延展成波纹状，菌落中部较厚，不透明，边缘延展部分较薄，无色透明；接触酶为阳性，水解淀粉，硝酸盐还原，L-阿拉伯糖和D-木糖不产酸，不利用柠檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感。
2.根据权利要求I所述的芽孢杆菌重金属抗性菌株制成的菌剂，其特征在于，具体制备エ艺如下 (1)挑取所述的重金属抗性菌{Bacillussp.) CQ4的单菌落,接种于试管斜面； (2)将重金属抗性菌(Pacillussp.) CQ4的斜面种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期； (3)将上述培养好的菌液按10-15%体积接种量转入种子罐，继续培养至对数生长期；种子罐所用的培养基是SMS培养基；SMS培养基的配方是sucrose，1%; (NH4)2SO4, 0.1%;K2HPO4j O. 2%; MgSO4, 0.05%; NaClj 0.01%; yeast extract, 0.05%; CaCO3, 0.05%; pH7. 2 ； (4)将达到对数生长期的种子液按10-15%的接种量接种与生产罐中培养，生产罐所用的培养基配方与种子罐ー样； (5)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1. 5，搅拌速度为200转/分钟，培养温度为30°C，全程培养时间为48-72小时，结束后菌体10亿个/ml ;发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
3.如权利要求I所述的重金属抗性菌{Bacillussp.) CQ4在强化蕈菌富集土壤重金属上的应用。
全文摘要
本发明提供一株具有重金属抗性并能强化蕈菌富集土壤重金属的微生物新菌种---芽孢杆菌(Bacillussp.)CQ4及其菌剂，属于环境微生物修复技术领域。本发明所筛选到的菌株制剂能够活化土壤中重金属Pb,Cu和Cd，并有效的能促进蕈菌本身的生长,以及增加蕈菌体内富集重金属Pb,Cu和Cd的浓度。本发明针对目前工业生产实践中的实际问题和需求，具有广阔的市场前景。
文档编号C12N1/20GK102676440SQ201210211058
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者徐恒, 曹艳茹, 陈正锁 申请人:四川大学