专利名称：一种大目、长鳍、蓝鳍金枪鱼生鱼片的鉴定方法
技术领域：
本发明属于食品检测技术领域，具体地涉及一种大目、长鳍、蓝鳍金枪鱼生鱼片的鉴定方法。
背景技术：
从生物学分类上讲，金枪鱼指S卢形目(Perciformes)鲭科(Scombridae)金枪鱼属(Thunnus)的共计8种鱼类。经济价值较大的种类包括蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)、 大目金枪鱼(Thunnus obesus)、黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)、长鳍金枪鱼(Thunnusalalunga)等，其中大目金枪鱼、长鳍金枪鱼、蓝鳍金枪鱼是国内生鱼片主要的原料鱼。金枪鱼是国际营养学会推荐的三大营养鱼之一，具有肉质柔嫩，高蛋白低脂肪，富含多种维生素和微量元素，尤其是DHA和EPA等不饱和脂肪酸含量非常丰富，DHA被人们称为“脑黄金”，是人类大脑和中枢神经系统发育必需的营养物质，经常食用金枪鱼，有利于脑细胞的再生、促进大脑发育、改善记忆力、提高学习能力、预防老年痴呆症。EPA又称0MEGA-3，是金枪鱼所特有的营养物质，可抑制胆固醇增加和防止动脉硬化，对预防和治疗心脑血管疾病有着特殊的作用。金枪鱼肉中蛋白质含量高，生物价高达90，是一种氨基酸配合优越的蛋白质，而且含有丰富的蛋氨酸及胱氨酸，有保护肝脏的功能。DHA、EPA均能减少血液中的中性脂肪，有利于肝细胞再生，而牛磺酸具有促进肝脏排泄的作用，经常食用金枪鱼食品，能够保护肝脏，提高肝脏的排泄功能，降低肝脏发病率。金枪鱼中的EPA、蛋白质、牛磺酸均有降低胆固醇的功效，经常食用，能有效地减少血液中的恶性胆固醇，增加良性胆固醇，从而能预防因胆固醇含量过高所引起的心血管疾病。鉴于金枪鱼的上述种种优点，目前金枪鱼的消费量逐年增大，其中生鱼片是金枪鱼的最重要的消费方式。蓝鳍金枪鱼由于捕捞量稀少，因而其经济价值较高，蓝鳍金枪鱼是长鳍金枪鱼和大目金枪鱼价格的两倍之多，然而生鱼片缺乏外部形态学特征，不易鉴定其真伪，不法商家以次充好，甚至通过染色的方式，以低价值金枪鱼生鱼片冒充高价值金枪鱼生鱼片，获取暴利，扰乱了市场秩序，破坏了商业诚信，损害了消费者利益，因此急需针对上述三种金枪鱼生鱼片建立快速、准确的鉴定方法。分子生物学技术为金枪鱼的真伪鉴定提供了可靠的理论和技术，其中线粒体DNA(mitochondrial, mtDNA)常常作为真伪鉴定研究的主要对象。mtDNA具有分子结构简单、母系遗传进化速率适中、无重组等优点，比核DNA更容易检测，采用mtDNA作为分子标记的研究已经广泛展开，进化关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。而线粒体DNA中的细胞色素b (cytochrome b,cyt b)基因进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA标记，通过PCR扩增cytb基因片段，再通过测序进行序列进化分析，已经广泛用于生物的分类与鉴定研究。限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)分析技术是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测DNA序列多态性。而PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行PCR扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段的酶切图谱进行分型、分类的一种方法，具有简便快捷、分辨率高、无需测序的优点，在水产品真伪鉴定中具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于大目、长鳍、蓝鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的鉴定方法，针对目前市场上以长鳍金枪鱼和大目金枪鱼生鱼片假冒蓝鳍金枪鱼生鱼片的行为，解决金枪鱼生鱼片来源鱼的品种真伪难以鉴别的问题。本发明在cyt b基因PCR扩增的基础上，通过大量DNA序列数据模拟与实际样本分析，确定了上述三种金枪鱼cytb基因中的物种特异性酶切位点，从而为大目、长鳍、蓝鳍三种金枪鱼生鱼片的鉴别提供了快速准确的方法。本发明是通过如下技术方案实现的 一种用于大目、长鳍、蓝鳍金枪鱼生鱼片来源鱼品种的鉴定方法，包括以下步骤
I)提取金枪鱼生鱼片DNA ；2)以提取的DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增cytb基因片段，其中F I 5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ；3)纯化PCR产物，通过限制性内切酶Fok I与Stu I将纯化后的PCR产物分别进行酶切处理；4)琼脂糖凝胶电泳分析PCR的酶切产物；进一步，所述的PCR反应条件为
权利要求
1.一种大目、长鳍和蓝鳍金枪鱼生鱼片的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 1)提取金枪鱼生鱼片DNA； 2)以提取的DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增cytb基因片段，其中Fl:5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3 ；F2 5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 ； 3)纯化PCR产物，通过限制性内切酶FokI与StuI将纯化后的PCR产物分别进行酶切处理； 4)琼脂糖凝胶电泳分析PCR的酶切产物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的PCR反应条件为
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶电泳检测所用的凝胶浓度为1.5%。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的FokI酶切反应体系为 PCR 纯化产物5. 0-10. OuL FokI LOuL IOX限制性内切酶缓冲液2. 0 ii L 、0. I % BSA 2. Oii L ddH20 补足至 20. O ii L 所述的FokI酶切反应体系为 PCR 纯化产物5. 0-10. OuL StuI LOuL IOX限制性内切酶缓冲液2. O i! L ddH20 补足至 20. O ii L 混匀后于37°C孵育I. O 2. O小时。
全文摘要
一种大目、蓝鳍、和长鳍金枪鱼生鱼片的鉴定方法，属于食品检测技术领域，包括以下步骤金枪鱼生鱼片DNA的提取，以提取DNA为模板，以F1/F2为引物，PCR扩增cytb基因片段，电泳检测扩增片段，纯化后将PCR产物用限制性内切酶FokI和Stu I进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱对上述3种金枪鱼鱼片进行原料鱼真伪鉴别。本发明从分子水平上对金枪鱼生鱼片的来源鱼品种进行鉴定，能够准确区分金枪鱼生鱼片的来源，对规范金枪鱼生鱼片市场具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102732630SQ20121022841
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者姚琳, 宋春丽, 朱文嘉, 李晓庆, 李青娇, 江艳华, 王联珠, 翟毓秀 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所