专利名称：一种鉴别大菱鲆卵子质量的方法
技术领域：
本发明属于水产动物卵子质量检测技术领域，具体涉及一种鉴别大菱鲆卵子质量的方法。
背景技术：
大菱鲆(Scophthalmus maximus )是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，自1992年大菱鲆被引进中国以来，在水产科研工作者和养殖企业的共同努力下，大菱鲆在工业化养殖领域取得了重大成效，最高年产量达5万吨以上，年产值逾40亿元，从而成为我国水产养殖业一个新的经济增长点。在大菱鲆等硬骨鱼类人工繁养殖过程中，卵子的质量是影响繁殖性能的一个关键因素，它直接关系到胚胎的发育以及仔、稚、幼鱼的成活和生长速率，因此，卵子质量的好坏与养殖效率密切相关。此外，卵子质量还可以反馈亲鱼培育、对指导苗种生产也具有重要意义；同时高质量卵子也为深入研究海水硬骨鱼类胚胎发育调控机制提供了有效的平台和保障。目前对大菱鲆卵子质量的评价通常是对其外观形态及生产性状检测，如色泽、沉浮性、受精率、孵化率和仔鱼畸形率等，对卵子和卵巢液的基础生化组成等方面的研究相对较少。从外观上对卵子进行检测虽然速度快，但准确率低；而通过受精率、孵化率和仔鱼畸形率等生产性状来评价卵子质量，涉及到后期养殖，试验周期长，易受外界环境因子(因素)的干扰，往往影响最后的统计结果，同时又不能在繁殖早期判断卵子质量，避免不必要损失。目前，国内外还没有使用多种方法对大菱鲆卵子进行筛选，对其卵子质量的评价方法单一，不能全面反映其卵子的特性，因此需要提供一种有效的大菱鲆卵子质量评价方法。
发明内容
本发明目的是提供一种评价大菱鲆卵子质量的方法，采用此方法可以弥补现有技术的不足，解决现有的鱼类卵子质量检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差问题，进一步完善鱼类卵子质量评价体系。本发明技术方案是在大菱鲆繁殖周期内，分别收集同一样品同一时期的未受精卵和卵巢液，再分别测定未受精卵和卵巢液的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)的活性，同时结合相应的卵子受精率、孵化率和仔鱼畸形率的测定，建立一种综合评价大菱鲆卵子质量的新方法，为大菱鲆卵子质量评价提供可靠的技术手段。本发明提供一种检测大菱鲆卵子质量的标准，当大菱鲆未受精卵的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分别为2. 18±0. 48U/gprot,70. 87±9. 74U/gprot时，且卵巢液碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性在50. 78±15. 58U/gprot，24. 53±7. 47U/gprot时，受精率和孵化率最高，仔鱼畸形率最低，此时卵子质量符合生产的要求。当检测的未受精卵和卵巢液的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性不在上述范围内时，所检测的卵子并没有处于最佳的质量范围。在大菱鲆规模化种苗生产过程中，当卵子受精率低于50%时，养殖企业生产成本最高，养殖经济效益降低，获利最低，卵子质量不能满足实际生产需要。本发明针对不同产卵时期卵子和卵巢液中两种重要的参与能量代谢的酶的检测，结合受精率、孵化率和仔鱼畸形率的验证，减少了外界环境因子(因素)的影响，客观准确的反应了卵子的质量，所用设备简单，价格低廉，可节省时间和成本。
具体实施例方式本发明的方法，包括有如下的步骤I)在大菱鲆繁殖季节，选取发育一致的雌性亲鱼若干尾，分别收集卵子和卵巢液，卵子用生理盐水研磨制备成10%组织匀浆，离心取上清，用试剂盒(南京建成生物工程研究所，酶标法JC-A0059)在酶标仪下测定碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性；卵巢液稀释5倍后，同上述方法检测碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性。每个样品重复三次，结果取平均值， 所得实验数据采用SAS (9. 0版本)软件中GLM过程进行方差分析和Duncan氏多重比较。2)通过受精率和孵化率检测该方法的准确度受精率统计卵子受精2 4小时后，在倒置显微镜下观察受精卵发育情况(正常受精卵此时发育至四细胞期，未受精卵发育停止)，计算得出卵子受精率；受精率=正常发育卵子数/总卵数孵化率统计卵子受精后，每间隔12小时，吸取沉于孵化网箱底部的死卵(发育正常的卵子浮于水层表面)，计数发育失败的卵子数；待仔鱼孵化后，统计孵化仔鱼总数，计算得出孵化率；孵化率=孵化仔鱼数/ (沉卵总数+孵化仔鱼数)仔鱼畸形率统计仔鱼孵化后在倒置显微镜下观察仔鱼形态，计数畸形仔鱼数，统计孵化仔鱼总数，计算得出仔鱼畸形率。畸形率=畸形仔鱼数/孵化仔鱼数)。下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述2011年在天源水产有限公司亲鱼车间内进行试验，取产卵期的雌性亲鱼12尾，分别挤卵后用吸管分别吸取两次各IOml的卵子和卵巢液，其中IOml的卵子用于进行受精率和孵化率的检测，IOml用于碱性磷酸酶和酸性磷酸酶检测。将20组的数据进行分析后，得到如下表数据，单位U/gpix)t (国际单位/每克蛋白)。表I :大菱鲆繁殖周期内卵子和卵巢液AKP、ACP活性变化及相对应受精率、孵化率和仔鱼畸形率
权利要求
1.一种鉴别大菱鲆卵子质量的方法，其特征在于，是用大菱鲆未受精卵和卵巢液的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性作为评价的标准。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述的标准如下大菱鲆未受精卵的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分别为2. 18±0. 48U/gprot、70. 87±9. 74U/gprot ;卵巢液的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分别为50. 78±15. 58U/gprot、24. 53±7. 47U/gprot。
3.如权利要求I所述的方法，其具体步骤如下 分别收集大菱鲆的未受精卵和卵巢液，然后将未受精卵用生理盐水研磨制备成10%组织匀浆，离心取上清，在酶标仪下测定碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性；卵巢液稀释5倍后检测碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活性，并将检测结果与权利要求2所述的标准进行比较，最终确定未受精卵的质量；当处于权利要求2所述的标准内，为符合生产要求的卵。
全文摘要
本发明涉及一种鉴别大菱鲆卵子质量的方法，是用大菱鲆未受精卵和卵巢液的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性作为评价的标准。当大菱鲆未受精卵的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分别为2.18±0.48U/gprot、70.87±9.74U/gprot；卵巢液的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性分别为50.78±15.58U/gprot、24.53±7.47U/gprot时，卵子的质量符合生产要求。本发明针对不同产卵时期卵子和卵巢液中两种重要的参与能量代谢的酶的检测，结合受精率、孵化率和仔鱼畸形率的验证，减少了外界环境因子(因素)的影响，客观准确的反应了卵子的质量，所用设备简单，价格低廉，可节省时间和成本。
文档编号C12Q1/42GK102719516SQ20121023219
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者刘新富, 孟振, 贾玉东, 雷霁霖, 高淳仁 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所