专利名称：Hla-a0201限制性抗mage抗原特异性ctl的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特 异性CTL的制备方法。
背景技术：
一、肿瘤治疗的困境与机会恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方 法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、 化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要 原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授 为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK 细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输 注(3X101(|-n)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2 (IL-2) (10万IU/kg,q8h),因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸 润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细 胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991 年Stanford大学的Schmidt_Wolf等采用干扰素Y (IFN- y )、IL-2和鼠抗人CD3单克隆 抗体(Mouse anti-Human CD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细 胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞 (APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHC I类和MHC II类分子)，免疫共 刺激分子(⑶80、⑶83、⑶86、⑶40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的 抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿 瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8 (IL-8)、干扰素a (IFN-a)、白 细胞介素-12 (IL-12)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )等，增强机体非特异性免疫应答(天然免 疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔 医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使 之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的 探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公 司(Dendreon, CA),该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但 是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量 抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接 杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。
三、MAGE基因在肿瘤免疫治疗中的作用黑色素瘤相关抗原基因(Melanomaantigen-encoding Genes, MAGEs)包括 MAGE-A,-B和-C家族，它们表达于各种类型的肿瘤组织中，包括黑色素瘤、食管癌、肝癌、多 发性骨髓瘤、子宫癌、口腔鳞癌等等，而不表达于正常组织，除了睾丸生殖细胞，编码一系列 能够被CTLs识别的抗原。目前人类已发现有MAGE基因编码的、能够被CTL特异性识别的 抗原肽包括有MAGE-A1编码，HLA-A1递呈的9肽EADPTGHSY，MAGE-A2编码，HLA-A0201递 呈的 9 肽 KMVELVHFL，MAGE-A3 编码，HLA-A24 递呈的 9 肽 MPKAGLLI，MAGE_A4 编码，HLA-A2 递呈的10肽GVYDGREHTV等等。由于MAGE基因在肿瘤中的特异性表达以及它们能够引起 特异性的CTL的肿瘤杀伤作用，使得MAGE基因编码的抗原成为肿瘤治疗的靶抗原。研究人 员通过先前的临床试验已经证实MAGE-A3多肽能够诱导免疫应答，在28-55%的患有转移性 黑色素瘤的患者中引起了肿瘤的消退。Bricard等发现MAGE-A10特异性的CTL在肿瘤损害 部位密集，而在正常肝组织中不存在，同时，CTL在体外具有强大的杀伤肿瘤细胞的能力，因 此对肝癌具有抗肿瘤作用，从而使通过应用MAGE-A10对肝癌进行免疫治疗成为可能。四、CTL作用机理1、机体T细胞免疫反应过程机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不 同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细 菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的 复发。CTL免疫应答大致分四个阶段(1)抗原识别APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；(2)抗原加工与递呈抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的 MHC- I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表 面；(3) T细胞激活(双信号学说)APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC 递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中⑶8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，⑶4+T细胞识别 MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二 信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL ；(4)靶细胞杀灭活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗 原表达细胞后进行杀伤和清除。但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数 量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患 者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀 灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。2、CTL表型与功能差异根据CTL表面分子的表达种类可分为两型中央记忆型CTL (CTL_cm)和效应记忆 型 CTL (CTL_em)。Klebanoff等研究发现表型分析为CD3+CD45R0+CD62L+CCR7+的CTL^具有更强 的抗肿瘤能力Johnson等比较了 MART-1 TCR基因修饰的CTL_cm和CTL_EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTL.输注后较表 型为CD3+CD45R0+CD62L-CCR7-的CTL_EM在体内能存活更长的时间。3、CTL技术开发现状综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为三种方法与来源(1)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增法从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(IL_2)培养，克隆稀释法筛 选肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。Li等选择HLA-A201阳性的IV期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞 悬液后，加入IL-2培养，5周后筛选扩增细胞中⑶8+T+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入 鼠抗人CD3单克隆抗体和辐照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2，再培养12天可 获得CTLs，能对负载MART-1多肽的T2细胞株特异性识别和杀伤。(2)TCR基因修饰法TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括a、0YS四条链，由二 硫键连接成a/0和Y/S两种异二聚体，其中a/0+T细胞占外周血T细胞的90-95%， 是主要的免疫效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体T淋巴细胞，导入能识别特 异性抗原多肽的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆 转录病毒质粒或慢病毒质粒。Morgan等采用抗⑶3+⑶28+磁珠激活⑶8+T细胞，应用慢病毒质粒转染修饰 MART-1或gplOO特异性的TCR基因，采用鼠抗人⑶3单克隆抗体和IL-2培养体系制备 CTLs，在12天能扩增培养至109个细胞，用于15例HLA-A2+的黑色素瘤患者的治疗，结果 显示有2例患者出现了明显的临床疗效，1例52岁男性患者的腋窝转移病灶消失，肝转移病 灶缩小了 89%，无病生存期为21个月；1例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期 为20个月。Perro等采用白细胞介素-15 (IL-15)和白细胞介素_21 (IL-21)细胞因子组合 促进TCR基因转染非增殖的T细胞，可以维持T细胞高表达⑶62L和⑶28。 (3)体外抗原致敏法用人工APC (Artificial APC)，或抗原(蛋白质，多肽，或全细胞)体外反复刺激T 细胞，获得抗原特异性CTL。浙江大学的发明专利(专利号CN102168066A)体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞 毒性T淋巴细胞的方法即采用该方法。将MHC- I -lg和抗⑶28mAb包被磁珠构建人工APC， 抗原表位肽负载APC后，体外致敏3-4周，再以磁珠吸附分离抗原特异性CTL，Tetramer染 色鉴定。上述三种方法的缺陷(1) TIL体外扩增法①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组 织来源有限；②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较 复杂，分离细胞的时间长，一般都需要1个月以上；③TIL中混有⑶4+⑶25+Treg亚群，其会抑制CTL扩增效率；
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所述的制备方法，步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到 的PBMC贴壁后加入rhGM-CSF、rhIFN a、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培 养三天，收获的DC再加入目标抗原孵育即得。所述的制备方法，步骤c中用于目标CTL扩增的、射线辐照的自体PBMC是通过下 列方法制备得到的留取部分单采获得的PBMC，经30-50GY的、射线辐照后保存；保存液 含20% (V/V)DMS0和20% (V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度_80°C超 低温保存。所述的制备方法，步骤d中用于目标CTL扩增的anti-human-⑶3mAb是如下操作 的将anti-human-Q)3mAb固相包被于用于扩增细胞的容器表面,anti-human-Q)3mAb可与 多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。所述的制备方法，各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为a.目标CTL第一轮扩增每次加入量rhIL_2终浓度为500_750IU/ml，rhIL-7终 浓度为50-75ng/ml，DC与起始T细胞数量比为1:5;b.目标CTL第二轮扩增rhIL-2终浓度为200_500IU/ml，rhIL-15终浓度为 100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1. 0-2. 5 u g/ml, y射线辐照的PBMC与起始CTL 数量比为2 1。所述的制备方法，各步骤操作后细胞数量与表型特征见表1。表权利要求
1.HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于该方法包括下列 步骤a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收 集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞；b.目标CTL诱导与第一轮扩增用负载HLA-A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时 加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第 一轮扩增；c.目标CTL纯化方法采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL,即选择Tetramer+Q)8+T淋巴 细胞；d.目标CTL第二轮扩增采用固相包被的anti-human-⑶3mAb和IL-2刺激目标CTL的生长；加入经、射线福 照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15继续培育，完成第二轮扩 增，收集鉴定。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中HLA-A0201限制性MAGE抗原 多肽长度为9-15个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性MAGE抗原多 肽，位点为271-279，序列如SEQ ID NO. 1所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC 是通过下列方法制备得到的将外周单个核细胞贴壁后加入含rhGM-CSF、rhIFNa、灭活的 混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获DC再加入目标抗原孵育即得。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中用于目标CTL扩增的、射线 辐照的自体外周单个核细胞是通过下列方法制备得到的留取部分权利1中单采获得外周 单个核细胞，经30-50GY的、射线辐照后保存；保存液含20% (V/V)DMS0和20% (V/V) 正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度-80°C超低温保存。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d中用于目标CTL扩增的 anti-human-Q)3mAb是如下操作的将anti-human-Q)3mAb固相包被于用于扩增细胞的容 器表面，anti-human-⑶3mAb可与多个CTL表面的⑶3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成， 促进细胞接触，快速进入增殖周期。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于目标CTL是指表达识别载HLA-A0201 限制性MAGE抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤中刺激分子或细胞的用量分别为a.目标CTL第一轮扩增每次加入量rhIL-2终浓度为500_750IU/ml，rhIL-7终浓度 为50-75ng/ml，DC与起始CD8+T细胞数量比为1:5;b.目标CTL第二轮扩增rhIL-2终浓度为200_500IU/ml，rhIL-15终浓度为 100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1. 0-2. 5u g/ml, y射线辐照的外周单个核细胞与起始CTL数量比为2 I。
9.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于各步骤操作后细胞数量与表型特征分 别为
全文摘要
本发明公开了HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集、纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性MAGE抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，并用rhIL-2和rhIL-7联合促进T细胞生长；采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL；采用固相包被的抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL的生长；加入γ射线辐照后的自体PBMC增强目标CTL的活化；加入rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM，可用于肿瘤等免疫治疗。
文档编号C12N5/0783GK102719401SQ201210231840
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者时宏珍 申请人:时宏珍