专利名称：一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法
技术领域：
本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。
背景技术：
随着转基因植物产业化水平不断提高，其安全问题已经引起国际社会和各国政府的广泛关注，并成为国家之间环境保护、国际贸易等合作的敏感议题，致使转基因产品的安全性问题由学术观点分歧，发展到环境问题、经济问题甚至政治问题。为了加强对转基因植 物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。其中，转基因产品标识制度已成为国际公约。澳大利亚和新西兰从2001年7月开始对所有转基因食物实施标识制度，阈值为每种成分的1%，即当某一种成分内的转基因成分超过1%，则必须标识为转基因食物。巴西、以色列等国也把转基因成分阈值定为1%。韩国和日本分别为3%和5%。建立健全转基因产品标识制度，转基因产品的检测技术是关键。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种一种是基于核酸的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。在转基因植物及其加工产品的检测过程中，以DNA检测为基础的核酸检测方法已经成为最主要、最适用的转基因植物及其加工产品的检测方法。基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即(I)针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；(2)目的基因特异性检测；(3)基因构建特异性检测；(4)品系特异性(转化事件)检测。由于品系特异性检测方法具有高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。品系特异性检测是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。基于上述优点，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并将为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，为石竹科石竹属多年生草本植物，是当代世界最主要的切花品种之一，其生产面积和销售量居切花品种之首。澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司从杂交矮牵牛中克隆到二氢黄酮醇_4_还原酶基因(Dihydroflavonol-4-Reductase，DFR)和类黄酮-3 ' ,5'-羟基化酶基因(Flavonoid-3 ' , 5 ' -Hydroxylase, F3’ 5’ H),构建载体 pCGP1470 并通过农杆菌介导转化花色为白色的香石竹品种，经筛选获得了花色呈蓝紫色的转基因香石竹。月之霓裳(Moonshade)是其中I个主要品系。转基因香石竹是在我国进行环境安全评价试验的第一例观赏植物，在转基因植物环境安全研究领域具有重要意义。所以研究开发灵敏度高、特异性强的转基因香石竹品系特异性检测方法和标准，已成为一项重要而紧迫的任务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因花色香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。本发明利用LM-PCR技术分离、测序分析得到了外源基因插入位点的左边界旁邻序列，并设计了一系列特异性引物和探针序列，建立了适用于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证了该检测方法的特异性和灵敏度。本发明的原理为根据已知的外源插入载体，设计2条同向且退火温度较高的特异性引物 MP1/MP2 与试剂盒 “LA_PCR in vitro Cloning” (TaKaRa BiotechnologyCo.，Ltd. Japan)提供的引物C1/C2结合，进行LM-PCR反应，得到外源基因插入香石竹基因组DNA位点的旁邻序列。据此设计特异性引物和探针，并优化PCR扩增条件，建立标准曲线，确定检测的灵敏度，同时对混合样品进行分析检测，建立适合于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下 利用 Primer Express software version3. 0(Applied Biosystems, FosterCity, CA)设计特异性引物和荧光探针。特异性引物和探针的序列、扩增片段长度参见表I。引物和探针由上海英骏公司(Invitrogen Co. , Ltd, Shanghai )合成。其中，采用ans基因作为香石竹的内标准基因。特异性引物MP1/MP2和试剂盒引物C1/C2用于LM-PCR扩增。shadeClF/shadeClR用于品系特异性定性PCR扩增。shadeRlF/shadeRIR和探针shade-Probe用于品系特异性定量PCR扩增。ANS-F1/ANS-R1用于内标准基因ans定性PCR扩增。ANS-F2/ANS-R2和ANS-Probe用于内标准基因ans定量PCR扩增。GenomeClF/GenomeClR用于香石竹基因组DNA定性PCR扩增。表I. PCR体系所用的特异性引物和探针
权利要求
1.一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤 1)转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取； 2)转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认利用LM-PCR方法分离得到包括如SEQ ID Nol所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeClF/GenomeClR进行PCR扩增,PCR扩增结果证明如SEQ ID Nol所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID Nol所示； 3)转基因香石竹Moonshade的定性PCR检测采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeClF/shadeClR 进行定性 PCR 扩增； 4)转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测由转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准品，采用Moonshade品系特异性定量引物对shadeRlF/shadeRIR和探针shade-Probe进行定量PCR扩增，同时，采用内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe进行内标准基因定量PCR，并建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线；再利用相对定量法对样品进行定量检测； 其中，引物GenomeClF/GenomeClR，其序列分别如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物对 shadeClF/shadeClR序列分别如 SEQ ID No4 和 SEQ ID No5 所示；定量引物对 shadeRlF/shadeRIR 和探针 shade-Probe 序列分别如 SEQ ID No6、SEQ ID No7 和 SEQ ID No8 所示；内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe序列如SEQ IDNo9、SEQ ID NolO 和 SEQ ID Noll 所示。
2.根据权利要求I所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的扩增反应体系为第I轮扩增反应总体积30iiL，3iiLlXPCR缓冲液，3u L2mM dNTPs，I y LlO y M引物Cl，I y LlO y M引物MP1，0. 3 y L5U LA-Taq DNA聚合酶，2 y LMoonshade DNA, 19. 7 u L 双蒸水；第2 轮反应:总体积 30 u L,3u L I XPCR 缓冲液，3 u L 2mMdNTPs, I u L 10iiM$*MP2，liiL10iiM$*C2，0.3iiL5U Taq DNA 聚合酶，19. 7 y L 双蒸7faP2iiL(25ng/iiL)第一轮PCR产物;其中，引物Cl的序列如SEQ ID Nol2所示，引物MPl的序列如SEQ ID Nol3所示，引物C2的序列如SEQ ID Nol4所示，引物MP2的序列如SEQID Nol5 所示。
3.根据权利要求I所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测的反应体系为总体积25 ii L，5 ii L Moonshade DNA, 2. 5 u LlX PCR缓冲液，2. 5 ii L2mM dNTPs, 12. 7u L 双蒸水，IOuM 定性引物对 shadeClF/shadeClR 各 I y L 和0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶；反应程序94°C,5min ；94°C, 30s, 58°C, 30s, 72°C, 30s, 35 个循环；72°C，7min。
4.根据权利要求I所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测的反应体系为总体积25u L,2. 5u LI XPCR缓冲液，2. 5 u L2mM dNTPs, 5 u L25mMMgCl2, IOuM 定量引物对 shadeRlF/shadeRIR # 0. 5 u L, I. 0 u LlO u M 探针 shade-Probe,0. 25 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA 和 7. 75 y L 双蒸水；反应程序50°C，2min ;95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72°C，45S，45个循环，在60°C，45s的退火阶段收集荧光信号。
5.根据权利要求I所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述内标准基因定量PCR的反应条件为反应体系总体积25 ii L，2. 5 ii LI XPCR缓冲液，2. 5 u L2mMdNTPs，5iiL25mM MgCl2，10iiM 弓 I 物对 ANS-F2/ANS-R2 各 0. 5 y L，0. 5 y LlO y M 探针ANS-Probe, 0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA和 8. 2 y L双蒸水；反应程序50°C，2min ;.95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72 V，45S，45 个循环，在 60°C，45s 的退火阶段收集荧光信号。
全文摘要
本发明公开了一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤1)转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；2)转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认；3)转基因香石竹Moonshade定性PCR检测；4)转基因香石竹Moonshade定量PCR检测。本发明建立了适用于转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证了该检测方法的特异性和灵敏度，为转基因香石竹的进口检测、监管及环境安全评价提供重要依据。
文档编号C12Q1/68GK102719552SQ20121024481
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者唐雪明, 李鹏, 潘爱虎, 白蓝, 贾军伟 申请人:上海市农业科学院