专利名称：一种从维生素c发酵醪液中提取蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种从维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，特别涉及一种菌丝体收集破碎和蛋白质分离提取的生产技术，属于生物技术领域。
背景技术：
维生素C是维持人身健康的一种不可缺少的物质。它是活细胞氧化还原反应的催化剂、参与体内多种代谢、具有促进体内 多种急速合成的生理作用。机体内缺乏维生素C易发生坏血病，严重时可造成死亡。临床应用防治坏血病；促进机体代谢，增强抗感染能力，阻止产生致癌物质；各种疾病的急救；使组织产生胶原质可促进伤口愈合；可帮助酶将胆固醇转化成胆固酸排掉，以减轻血管壁的脆性，预防冠心病；大剂量静脉注射用于克山病的治疗。食品应用用于食品添加剂。如食品的抗氧化剂、啤酒的抗老剂、面粉的改性剂、罐头食品的亚硝酸盐抑制剂及糕点、糖果、饮料、乳制品的营养添加剂。VC用于化妆品行业及饲料添加剂等。目前，维生素C主要是以玉米淀粉为原料，采用二步发酵法进行生产。二步发酵法是美国的Tengerdy和Huang等首先发现的,其经过的是L-山梨糖的途径，即L-山梨醇先经过细菌转化的L-山梨糖，后者再经过细菌发酵生成维生素C前体2-KGA。国外的二步发酵法研究较早，L-山梨糖代谢途径和代谢机制研究也比较深入，但是由于其2-KGA转化率低而至今未被用于生产实践。我国维生素C二步发酵法是由中国科学院微生物研究所和北京制药厂合作于20世纪70年代初发明的，它是目前唯一成功应用于维生素C工业生产的微生物转化法，该办法属L-山梨糖途径，其特点为第二步发酵由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌等伴生菌混合发酵完成。我国最初筛选出的一组能利用L-山梨糖产生2-KGA的优良菌株是氧化葡萄糖酸杆菌及其伴生菌条纹假单孢菌，以后经不断实践改进，1976年6月通过中试鉴定并逐渐在全国范围内推广使用。维生素C二步发酵生产法会产生大量的菌丝体、蛋白质等副产物，约占发酵液的4%，经超滤截留成分粘度比较大，含有一定的古龙酸钠成分，气味难闻，无法直接作为动物饲料，很多维生素C生产厂家将这部分截留成分置于空场堆放、锅炉焚烧或者直接外售。维生素C发酵副产物的不及时处理对空气造成污染，影响厂容，因此有必要对维生素C发酵副产物进行综合利用，对社会和公司发展都有双赢意义。我国是世界最大的饲料消费国，我国养殖业对饲料蛋白的需求量日益增加，例如饲用大豆蛋白的70%依靠进口(参见丁国文，扩大非粮食饲料原料供给[J].中国饲料，2006,22:22-23)。因此，从维生素C发酵副产物中提取蛋白质用作饲料蛋白具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种从维生素C发酵副产物一维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，该方法能方便、快捷的将蛋白质从醪液中提取出来，实现了资源的综合利用，即解决了发酵醪液对环境造成污染的问题，又变废为宝减少了资源的浪费，具有很好的经济学和社会学意义。
本发明公开了一种从维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，其步骤为收集维生素C发酵醪液超滤滤渣，通过超低温速冻，高压均质机对菌丝体等物质进行破碎，酶法水解提取蛋白，离心、絮凝沉降、干燥得到蛋白粉，具体技术方案如下
一种从维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，其特征是具体包括以下步骤
(1)将维生素C发酵醪液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从醪液中截留出来，收集截留成分；
(2)将步骤(I)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压 均质机将所得悬浊液进行破碎处理；
(3)将蛋白复合酶加入步骤(2)处理后的悬浊液中，酶解提取其中的蛋白质成分；
(4)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液；
(5)调节步骤(4)所述上清液的pH，使蛋白质絮凝沉降，过滤取沉淀；
(6)将步骤(5)中的沉淀进行干燥，得蛋白粉。上述步骤(I)中，所述超滤膜的截留分子量为1000 2000道尔顿；发酵醪液进行超滤的条件为进水压力O. 2 O. 5Mpa，超滤温度29 39°C，发酵醪液pH值5. O 7. 5。上述步骤(2)中，水的加入体积与截留成分的体积比为1:0. 5 1:5 ;超低温速冻温度为-35 -50°C，速冻时间为5 IOmin ;悬浊液通过高压均质机的压力为100 150Mpa，流速为 150-260m/s。上述步骤(3)中，所述蛋白复合酶由羧肽酶和酶 A组成，酶A选自下列酶中的一种或多种胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶；其中羧肽酶与酶A的质量比为I: I. 0-2.0，优选的所述蛋白复合酶由羧肽酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，它们的质量比为羧肽酶碱性蛋白酶胰蛋白酶=1:1. 2 :0. 5。上述步骤(3)中，蛋白复合酶的用量为悬浊液质量的O. 35% 1.2%，酶解温度为40 60°C，酶解时悬浊液pH为5. 5 8. 5，酶解时间为2 3. 5h。上述步骤(4)中，在30 40°C下进行离心分离，转速为800 1500rpm，时间为30 90mino上述步骤(5)中，将上清液pH调节至2. O 4. 5，使蛋白质絮凝沉降，蛋白质沉降时间为6-14h。上述步骤(6)中，干燥采用喷雾干燥的方法,喷雾干燥进风温度为200 300°C,出风温度为50 100°C。本发明具有的优点和积极效果
I.本发明利用维生素C发酵副产物提取蛋白粉，提取蛋白中氨基酸种类丰富，可作为饲料蛋白，亦可作为蛋白质深加工的原料，实现了维生素C发酵副产物的综合有效利用，增加了饲用蛋白粉来源的一个新渠道，节约了资源，保护了环境。2.利用均质机对维生素C发酵菌丝体等成分进行了先速冻后破碎，对发酵副产物中的蛋白质成分进行了提取，通过蛋白复合酶提取维生素发酵副产物中的蛋白质，蛋白提取率高。3.本发明原料成本低，设备简单，操作方便，能耗小，副产物综合利用价值高，易于实现规模化生产，减小了维生素C生产对环境的污染，提高了产业附加值。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。下述实施例中，采用15 _30wt%的盐酸溶液、15_40wt%的硫酸溶液、氢氧化钠或其水溶液、氢氧化钾或其水溶液调节pH。实施例I
(I)发酵醪液超滤处理
取维生素C发酵醪液100g，通过截留分子量2000道尔顿的超滤膜系统进行处理，进水压力控制在O. 4 O. 5Mpa，调节发酵醪液pH值5. 0，操作温度35 39°C，超滤处理后菌丝体和蛋白质等副广物得到截留，截留率达98. 0%,收集截留成分。(2)破碎处理
收集截留成分，加入蒸馏水并搅拌均匀，水与截留成分的体积比为1:0. 5，然后将混合液加入超低温速冻设备，在_35°C速冻5min，然后再在压力120Mpa，流速200m/s条件下通过高压均质机对悬浊液进行破碎处理，菌体破碎率为94%。(3)酶法水解
往破碎后的浆液中添加浆液质量O. 35%的蛋白复合酶(羧肽酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶质量比为1:1:1)，对蛋白质进行酶解，反应温度为50 55°C，pH为7 8，反应时间为
3.5h。(4)离心分离
利用离心机对酶解液进行离心分离，离心处理转速为800rpm，离心温度为30°C，离心时间为60min，收集离心上清液，蛋白收率为95%。(5)絮凝沉降
加盐酸溶液调节上清液PH值至3. 5-4. 5，自然沉降6h，弃去上清液，蛋白收率为86%。(6)干燥
利用喷雾干燥器对沉降组分进行干燥处理，进风温度为200°C，喷雾干燥过程中对蛋白浆液进行搅拌，出风温度为80°C，可得到淡黄色蛋白粉49. 62g。实施例2
(I)发酵醪液超滤处理取维生素C发酵醪液100g，通过截留量1500道尔顿的超滤膜系统进行处理，进水压力控制在O. 2-0. 3Mpa，调节发酵醪液pH值7. 5，操作温度30_34°C，菌丝体和蛋白质等副产物得到截留，截留率达97. 5%，收集截留成分。(2)破碎处理
收集截留成分，加入蒸馏水并搅拌均匀，水与截留成分的体积比为1:1，然后将混合液加入超低温速冻设备，在-50°C速冻8min，然后再在压力lOOMpa，流速260m/s条件下通过高压均质机对悬浊液进行破碎处理，菌体破碎率为95. 5%。(3)酶法水解
往破碎后的浆液中，添加浆液质量I. 2%的蛋白复合酶(羧肽酶、木瓜蛋白酶质量比为1:1)，对蛋白质进行酶解，反应温度为55-60°C，pH为5. 5-6. O，反应时间为3h。
(4)离心分离
利用离心机对酶解液进行离心分离，离心处理转速为1500rpm，离心温度为35°C，离心时间为30min，收集离心上清液，蛋白收率为93%。(5)絮凝沉降
加盐酸溶液调节上清液PH值至3. 0-4. O,自然沉降14h，弃去上清液，蛋白收率为93%。(6)干燥 利用喷雾干燥器对沉降组分进行干燥处理，喷雾干燥过程中对蛋白浆液进行搅拌，进风温度为300°C，出风温度为100°C，得到淡黄色蛋白粉52. 28g。实施例3
(I)发酵醪液超滤处理
取维生素C发酵醪液100g，通过截留量1000道尔顿的超滤膜系统进行处理，进水压力控制在O. 2-0. 25Mpa，调节发酵醪液pH值6. 0，操作温度29_33°C。菌丝体和蛋白质等副产物得到截留，截留率达99. 0%，收集截留成分。(2)破碎处理
收集截留成分，加入蒸馏水并搅拌均匀，水与截留成分的体积比为I: I. 5，然后将混合液加入超低温速冻设备，在_50°C速冻lOmin，然后再在压力150Mpa，流速150m/s的条件下通过高压均质机对悬浊液进行破碎处理，菌体破碎率为99. 0%。(3)酶法水解
往破碎后的浆液中，添加浆液质量O. 75%的混合酶(羧肽酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的质量比为1:1. 2:0. 5)，对蛋白质进行酶解，反应温度为40-45°C，pH为7. 5-8. 5，反应时间为2h。(4)离心分离
利用离心机对酶解液进行离心分离，离心处理转速为1200rpm，离心温度为40°C，离心时间为90min，收集离心上清液，蛋白收率为99. 3%。(5)絮凝沉降
加盐酸溶液调节上清液PH值至蛋白等电点3. 5-4. 5，自然沉降10h，弃去上清液，蛋白收率为95%。(6)干燥
利用喷雾干燥器对沉降组分进行干燥处理，喷雾干燥过程中对蛋白浆液进行搅拌，进风温度为280°C，出风温度为50°C，可得到淡黄色蛋白粉59. 44g。实施例4
采用实施例3的步骤提取蛋白粉，不同的是所用的混合酶是质量比为1:0. 5:0. 5的羧肽酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，离心收集上清液，测得蛋白收率为98%。
权利要求
1.一种从维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，其特征是包括以下步骤 (1)将维生素C发酵醪液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从醪液中截留出来，收集截留成分； (2)将步骤(I)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理； (3)将蛋白复合酶加入步骤(2)处理后的悬浊液中，酶解提取其中的蛋白质成分； (4)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液； (5)调节步骤(4)所述上清液的pH，使蛋白质絮凝沉降，过滤取沉淀； (6)将步骤(5)中的沉淀进行干燥，得蛋白粉。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(I)中，所述超滤膜的截留分子量为1000 2000道尔顿；发酵醪液进行超滤的条件为进水压力O. 2 O. 5Mpa，超滤温度29 39 0C，发酵醪液pH值5. O 7. 5。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(2)中，水的加入体积与截留成分的体积比为1:0. 5 1:5 ;超低温速冻温度为-35 -50°c，速冻时间为5 IOmin ;悬浊液通过高压均质机的压力为100 150Mpa，流速为150_260m/s。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(3)中，所述蛋白复合酶由羧肽酶和酶A组成，酶A选自下列酶中的一种或多种胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶；其中羧肽酶与酶A的质量比为1:1.0-2. O。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤(3)中，所述蛋白复合酶由羧肽酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，它们的质量比为羧肽酶碱性蛋白酶胰蛋白酶=1:1. 2 :0. 5。
6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征是步骤(3)中，蛋白复合酶的用量为悬浊液质量的O. 35% I. 2%，酶解温度为40 60°C，酶解时悬浊液pH为5. 5 8. 5，酶解时间为2 3. 5h。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(4)中，在30 40°C下进行离心分离，转速为800 1500rpm，时间为30 90min。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(5)中，将上清液pH调节至2.O 4. 5，使蛋白质絮凝沉降，蛋白质沉降时间为6-14h。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(6)中，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为200 300°C，出风温度为50 100°C。
全文摘要
本发明公开了一种从维生素C发酵醪液中提取蛋白质的方法，包括以下步骤将维生素C发酵醪液用超滤膜进行超滤，收集截留成分；将截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，然后再用高压均质机将进行破碎处理；将蛋白复合酶加入破碎处理后的悬浊液中，酶解提取其中的蛋白质成分，将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液；调节上清液的pH，使蛋白质絮凝沉降；将沉淀进行干燥，得蛋白粉。本发明利用维生素C发酵副产物提取蛋白粉，提取蛋白中氨基酸种类丰富，可作为饲料蛋白，亦可作为蛋白质深加工的原料，实现了维生素C发酵副产物的综合有效利用，增加了饲用蛋白粉来源的一个新渠道，节约了资源，保护了环境。
文档编号C12P21/06GK102766671SQ201210281439
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者付吉明, 刘敏, 庄祎, 张全景, 王乔隆, 郑秀宁 申请人:山东天力药业有限公司