专利名称：一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养基及其制备方法和应用，特别涉及一种用于蜡蚧轮枝菌固体发酵培养的培养基及其制备方法和应用。属于生物技术领域。
背景技术：
近年来伴随着化学农药的使用，3R (抗性(resistance)、再增娼獗(resurgence)和残留(residue)已成为全世界公认的、亟待解决的难题。蜡蚧轮枝菌以其地理分布广、寄主范围广、对人畜和天敌昆虫安全、不污染环境等特点，越来越受到人们的重视，成为极具发展潜能的生防菌之一。腊阶轮枝菌(LecanicilliumIecanii),属半知菌亚门(Deuteromycotina) 丝抱纲(Hyphomycetes)丛梗抱目(Moniliales)丛梗抱科(Moniliaceae)轮枝菌属(Lecanicillium),是一种地理分布广泛的虫生病原真菌。腊阶轮枝菌的寄主范围广泛，能够寄生同翅目、半翅目、直翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和缨翅目等种类的昆虫，还可以寄生于螨类、线虫以及一些植物病原菌。作为温室害虫如粉虱、蚜虫、蓟马的生防菌得到广泛的应用。1861年，Neitner在锡兰首次发现寄生于咖啡蜡蚧上的蜡蚧轮枝菌。20世纪80年代中后期，英国、荷兰、俄罗斯等国相继有该菌商品制剂Vertalec、Thriptal和Mycotal等问世，用以防治花卉和温室蔬菜上的白粉虱、蚜虫和蓟马害虫，并取得了良好的防治效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基及其制备方法和应用。本发明通过采用以下技术方案实现上述目的本发明一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基，其特征在于所述的培养基是由玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2 1:5进行混配灭菌后得到；所述的营养液中含有葡萄糖22 28g · L'酵母膏22 28g · MgSO4 O. 05 O. 2g · L'K2HPO4 O. 5 O. 9g MnSO4 O. 05-0. 075g · L'FeSO4 O. 005-0. 015g · L'KCl0. 25 0. 4g · L-1，用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 0-7. O。在本发明中，优选的，所述的培养基是由玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配灭菌后得到。在本发明中，优选的，所述的营养液中含有葡萄糖24 26g · L'酵母膏24 26g · L' MgSO4 O. I O. 15g · L' K2HPO4 O. 6 O. 8g · L' MnSO4 O. 0625g · L' FeSO4O. Olg · L—1、KCl O. 3 O. 35g · L—1，用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 5，更优选的，所述的营养液中含有葡萄糖26g · L'酵母膏25g · L' MgSO4 O. 14g · L' K2HPO4 O. 7g · L'MnSO4 O. 0625g · L'FeSO4 0. Olg · L'KCl 0. 35g · L'用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5o在本发明中，优选的，所述的玉米芯粉末是将玉米芯晾干粉碎成粒径为2-4mm的颗粒后得到，优选的将玉米芯晾干粉碎成粒径为3_的颗粒后得到。
玉米芯是玉米棒脱粒后的棒芯。本领域技术人员可自行采集或从市场购买得到。进一步的，本发明还提供了一种制备以上任一项所述的培养基的方法，其特征在于包括以下步骤( I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到玉米芯粉末；(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2 1:5进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖22 28g · L'酵母膏22 28g · L' MgSO4 O. 05 O. 2g · L' K2HPO4
O.5 O. 9g .IAMnSO4 O. 05-0. 075g .IAFeSO4 O. 005-0. 015g .L'KCl 0. 25 0. 4g · Λ用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 0-7. O ；
(3)培养基的灭菌高压湿热灭菌，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体
发酵培养基。在本发明中，优选的，步骤(I)中所述的玉米芯粉末是将玉米芯晾干粉碎成粒径为2-4mm的颗粒后得到，优选的将玉米芯晾干粉碎成粒径为3_的颗粒后得到。在本发明中，优选的，步骤(2)中是将玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配。在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的营养液中含有葡萄糖24 26g · L'酵母膏 24 26g · L' MgSO4 O. I O. 15g · L' K2HPO4 O. 6 O. 8g · L' MnSO4 O. 0625g · L'FeSO4 O. Olg .L'KCl O. 3 O. 35g · Λ用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 5，更优选的，所述的营养液中含有葡萄糖26g 酵母膏25g*r\MgSO4 O. 14g*r\K2HPO4 O. 7g .L-1、MnSO4 0. 0625g · L'FeSO4 0. Olg · L'KCl 0. 35g · L'用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5o在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的高压湿热灭菌是在温度为121°C，压力为103. 4205kPa 的条件下灭菌 45_60min。更进一步的，本发明还提供了所述的培养基在蜡蚧轮枝菌固体发酵培养中的应用。本发明的特点本发明以玉米芯为培养基质和原料，按照适宜蜡蚧轮枝菌产孢的碳源含量和碳氮比添加营养物质葡萄糖和酵母膏，同时补充了蜡蚧轮枝菌产孢所需的无机盐。以农产品废料玉米芯作为培养基的载体和原料与传统的虫生真菌培养基的生产原料(主要是大米，谷物等)相比大大降低了生产成本，在获得经济效益的同时在一定程度上减少了环境污染。本发明的培养基适用于蜡蚧轮枝菌的产孢培养。用本发明的固体培养基培养蜡蚧轮枝菌，能够使得每克基质产孢量达到3. 5 7. 5 X IO9个。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基的制备(I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到粒径为3mm的玉米芯粉末；
(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖 25g · L-1、酵母膏 25g · L-1、MgSO4 O. 15g · L-1、K2HPO4 O. 7g · L-1、MnSO4O. 0625g · L' FeSO4 0. Olg · L' KCl 0. 3g · Λ 用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5 ；(3)培养基的灭菌在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下高压湿热灭菌45min，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。实施例2蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基的制备(I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到粒径为4mm的玉米芯粉末；(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:4进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖 25g · L-1、酵母膏 25g · L-1、MgSO4 O. 15g · L-1、K2HPO4 O. 7g · L-1、 MnSO4O. 0625g · L' FeSO4 0. Olg · L' KCl 0. 3g · Λ 用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5 ；(3)培养基的灭菌在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下高压湿热灭菌60min，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。实施例3蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基的制备(I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到粒径为3mm的玉米芯粉末；(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:5进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖 24g · L'酵母膏 26g · MgSO4 O. Ig · K2HPO4 O. 8g · Γ1,MnSO4O. 06g · L'FeSO4 0. Olg · L'KCl 0. 4g · L-1，用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为 6. O ；(3)培养基的灭菌在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下高压湿热灭菌45min，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。实施例4蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基的制备(I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到粒径为2mm的玉米芯粉末；(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖 28g 酵母膏 24g MgSO4 O. 2g · IAK2HPO4 0. 5g MnSO4O. 075g .L'FeSO4O. 015g · L'KCl 0. 25g · L-1，用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为 7. O ；(3)培养基的灭菌在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下高压湿热灭菌45min，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。实施例5蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基的制备(I)原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到粒径为3mm的玉米芯粉末；(2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配，所述的营养液中含有葡萄糖 26g · L-1、酵母膏 25g · L-1、MgSO4 O. 14g · L-1、K2HPO4 O. 7g · L-1、MnSO4O. 0625g · L' FeSO4 0. Olg · L' KCl 0. 35g · L'用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5 ；(3)培养基的灭菌在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下高压湿热灭菌45min，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。实施例6本发明的固体发酵培养基在蜡蚧轮枝菌固体发酵培养中的应用I、材料蜡蚧轮枝菌菌株V4引进俄罗斯全俄植物保护研究所，菌株在已发表的文章中有记载，文献名为《蜡蚧轮枝菌 生物学特性及其对温室白粉虱致病性的研究》，发表在2002年12月第28卷第6期植物保护期刊中，现由黑龙江农业科学院植物保护研究所保存，提供。2、方法在无菌室的超净工作台上，用接种针挑取小块带有菌丝体的蜡蚧轮枝菌菌株V4的琼脂块移到已灭菌装有ro培养液的三角瓶中，在全温震荡培养箱中25°C，180r/min条件下培养96h。培养完毕后，用血球计数板测定H)培养液中的菌体芽生孢子产量，用无菌水调整菌液的孢子浓度为IO7个/mL备用。在无菌室的超净工作台上，用移液器将上述得到的菌液(孢子浓度为IO7个/mL)定量的接种到装有IOOg本发明所述的固体发酵培养基的三角瓶中，培养基的配制按照实施例1-5所述的方法进行配制，每个培养基进行4组重复试验，共分为5组，作为实验组，接种量为5mL菌液/瓶。接种完毕后，轻轻的摇动三角瓶，使接种液与培养基质充分混匀，然后将三角瓶放到恒温培养箱中发酵培养，培养温度为25°C，培养3-4d后在培养基质上即可见布满白色的菌丝体，继续培养14d后，进行分生孢子产量的测定。对照组采用单体培养基大米，称取一定量的大米，加入适量的水使大米充分吸水，称取相同重量已充分吸水的大米装入三角瓶中，4次重复。在温度为121°C，压力为
103.4205kPa的条件下高压湿热灭菌45min，灭完菌后，在无菌室的超净工作台上，用移液器定量的接种(菌液的孢子浓度为IO7个/mL)到装有大米固体培养基三角瓶中，接种量同样为5mL菌液/瓶。将三角瓶放到恒温培养箱中发酵培养,培养温度为25°C,培养时间为14d，进行分生孢子产量的测定。分生孢子产量的测定采用血球计数板测定法，即将发酵培养后的基质用无菌水逐次稀释，然后用血球计数板测定分生孢子的产量。结果发现采用本发明其他实施例制备得到的培养基培养蜡蚧轮枝菌其分生孢子平均产量均在3. 5X IO9个/g以上。并且当所用固体发酵培养基中含有葡萄糖268·ΙΛ酵母膏 25g · L'MgSO4 O. 14g · L'K2HPO4 O. 7g · L'MnSO4 O. 0625g · L'FeSO4 0. Olg · L'KCl 0. 35g ，用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 5时(按照实施例5所述的方法制备)，测定的分生孢子平均产量达到了 7.5X109f/g。而对照组测定的结果平均为2X IO9个/g°从以上可知，使用本发明的蜡蚧轮枝菌固体培养基，较普遍使用的以农副产品为基质的固体培养基发酵培养后，分生孢子的产量有了明显的提高，分生孢子的产量提高了
I.75-3. 75倍。并且本发明以农产品废料玉米芯作为培养基的载体和原料与单体培养基大米相比大大降低了生产成本，在获得经济效益的同时在一定程度上减少了环境污染。
权利要求
1.一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基，其特征在于所述的培养基是由玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2 1:5进行混配灭菌后得到； 所述的营养液中含有葡萄糖22 28g · L'酵母膏22 28g · L' MgSO4 O. 05 O.2g · L'K2HPO4 O. 5 O. 9g MnSO4 O. 05-0. 075g · L'FeSO4 O. 005-0. 015g · L'KCl0.25 0. 4g · L-1，用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 0-7. O。
2.如权利要求I所述的培养基，其特征在于所述的培养基是由玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配灭菌后得到。
3.如权利要求I或2所述的培养基，其特征在于所述的营养液中含有葡萄糖24 26g · L'酵母膏 24 26g · L' MgSO4 O. I O. 15g · L' K2HPO4 O. 6 O. 8g · L' MnSO4O.0625g · L' FeSO4 O. Olg · L' KCl O. 3 O. 35g · L'用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5，更优选的，所述的营养液中含有葡萄糖26g -L'酵母膏ZSg-L^MgSO4 O. 14g -L'K2HPO4 O. 7g · L' MnSO4 O. 0625g · L' FeSO4 O. Olg · L' KCl O. 35g · L—1，用 NaOH 溶液调节营养液的pH值为6.5。
4.如权利要求I所述的培养基，其特征在于所述的玉米芯粉末是将玉米芯晾干粉碎成粒径为2-4_的颗粒后得到，优选的将玉米芯晾干粉碎成粒径为3_的颗粒后得到。
5.一种制备权利要求I所述的培养基的方法，其特征在于包括以下步骤 (O原料预处理将玉米芯晾干并用粉碎机将其粉碎得到玉米芯粉末； (2)原料的配比玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2 1:5进行混配,所述的营养液中含有葡萄糖 22 28g 酵母膏 22 28g MgSO4 O. 05 O. 2g K2HPO4 O. 5 O.9g · L' MnSO4 O. 05-0. 075g · L' FeSO4 0. 005-0. 015g · L' KCl 0. 25 0. 4g · L'用NaOH溶液调节营养液的pH值为6. 0-7. O ； (3)培养基的灭菌高压湿热灭菌，得到以玉米芯为原料和基质的蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的玉米芯粉末是将玉米芯晾干粉碎成粒径为2-4_的颗粒后得到，优选的将玉米芯晾干粉碎成粒径为3_的颗粒后得到。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中是将玉米芯粉末与营养液按质量比为1:3进行混配。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的营养液中含有葡萄糖24 26g · L'酵母膏 24 26g · L' MgSO4 O. I O. 15g · L' K2HPO4 O. 6 O. 8g · L' MnSO4O.0625g · L' FeSO4 O. Olg · L' KCl O. 3 O. 35g · L'用 NaOH 溶液调节营养液的 pH 值为6. 5，更优选的，所述的营养液中含有葡萄糖26g -L'酵母膏ZSg-L^MgSO4 O. 14g -L'K2HPO4 O. 7g · L' MnSO4 O. 0625g · L' FeSO4 O. Olg · L' KCl O. 35g · L—1，用 NaOH 溶液调节营养液的pH值为6.5。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的高压湿热灭菌是在温度为121°C，压力为103. 4205kPa的条件下灭菌45_60min。
10.权利要求1-4任一项所述的培养基在蜡蚧轮枝菌发酵培养中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明的一种培养基是将晾干的玉米芯用粉碎机粉碎成粉末，然后将玉米芯粉末与营养液按质量比为1:2～1:5进行混配，其中所述的营养液中含有葡萄糖、酵母膏、MgSO4、K2HP04、MnSO4、FeSO4以及KCl作为营养成分，用NaOH溶液调节营养液的pH值为6.0-7.0，高压湿热灭菌后即得。本发明的培养基适用于蜡蚧轮枝菌的产孢培养。本发明的一种蜡蚧轮枝菌固体发酵培养基与传统的虫生真菌固体发酵培养基相比，大大降低了生产的成本并在一定程度上减少了玉米芯处理所带来的环境污染。
文档编号C12N1/14GK102796672SQ201210288468
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者刘春来, 李新民, 夏吉星, 王克勤, 刘兴龙, 王爽, 杨帆, 邵天玉, 刘宇 申请人:黑龙江省农业科学院植物保护研究所