专利名称：一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法
技术领域：
本发明涉及一种增强粪红假单胞菌絮凝性能的方法。
背景技术：
化石燃料储量的不断减少和能源需求的不断增长以及化石燃料燃烧造成的环境污染和温室气体排放，使21世纪的能源供应和地球环境面临巨大挑战。可再生清洁能源将成为未来可持续发展能源系统的主体。氢能清洁可再生，燃烧只产生水和巨大能量，生物制氢技术反应条件温和、能耗低、能妥善解决能源与环境的矛盾。光发酵生物制氢是在厌氧光照条件下，光发酵细菌利用小分子有机物、还原态无机硫化物或氢气做供氢体，光驱动产氢，产氢过程没有氧气的释放。光发酵细菌只含有光合系统PSI，不含有PSII，所以同绿藻和蓝细菌相比,在产氢的同时不产生氧气,不存在氧气对产氢酶的抑制,产氢纯度和产氢效 率高，可以简化工艺过程。光发酵产氢过程使氢气的生产、有机物的转化和光能的利用耦合到一起，显示了光合细菌利用有机物进行光能转化的巨大潜力。在光发酵产氢过程中，微生物必须消耗相当一部分的碳水化合物，用以生长繁殖维持一定的生物量，并合成催化产氢过程进行的各种酶。而光发酵细菌絮凝性能差，在反应体系中处于稳定的悬浮分散状态。细胞与出水不能有效的分离，随出水不断流失。为了维持发酵过程的进行，大量的底物用以细胞合成补充流失的生物量，导致了反应体系氢气产率低下。同时反应体系出水由于含有大量流失的光发酵细菌，浊度较高，出水直接排放会对环境造成较大的危害。因此，由于光发酵细菌絮凝性能差导致了反应体系生物持有量较低和出水浊度较高，反应体系稳定性大大降低。这极大的限制了光发酵产氢工艺的应用。
发明内容
本发明是要解决目前光发酵细菌絮凝特性差，生物量不断流失，导致光发酵产氢反应器产氢效能低的间题，提供一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法。本发明增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，按以下步骤进行一、将细胞浓度为 0. 8 I. Og/L 的幾红假单胞菌(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53菌液按10%的接种量接种至生长培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养16小时，光照强度为150W/m2，得种子液；二、将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含0. 75 I. 25g/L L-半胱氨酸的产氢培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养72小时，即得到含有絮凝体的菌悬液。本发明具有以下有益效果1、本发明方法絮凝后获得的光发酵细菌(粪红假单胞菌RLD-53)悬液静止5min，上清液吸光度明显降低，光发酵细菌与上清液实现有效分离，菌种流失大大降低。2、在L-半胱氨酸作用下，光发酵细菌表面氧、氮元素含量逐渐增多，官能团丰度增加。3、L-半胱氨酸促进光发酵细菌胞外聚合物的合成，尤其是蛋白的分泌，从而增强了光发酵细菌的絮凝性能。4、采用DLVO理论研究表明，L-半胱氨酸有效降低了光发酵细菌细胞间的斥力势能，使得细菌细胞在接触过程中更易越过能垒，形成絮凝。因此，本发明创造可以有效提高光发酵细菌的絮凝性能，实现光发酵细菌的絮凝生长。
图I为具体实施方式
五中光学相机拍摄的光发酵细菌絮凝体照片；图2为具体实施方式
五中扫描电镜拍摄的光发酵细菌絮凝体微观结构图；图3为具体实施方式
五中光发酵细菌的氢气产率、絮凝性能及上清液吸光度曲线；图4为具体实施方式
五中光发酵细菌胞外聚合物含量变化图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，按以下步骤进行一、将细胞浓度为 0. 8 I. Og/L 的幾红假单胞菌(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53菌液按10%的接种量接种至生长培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养16小时，光照强度为150W/m2，得种子液；二、将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含0. 75 I. 25g/L L-半胱氨酸的产氢培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养72小时，即得到含有絮凝体的菌悬液。本实施方式步骤一所述幾红假单胞菌(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53已在《Hydrogen production with R. faecalis RLD-53 isolated from freshwater pondsludge》(《从淡水池塘污泥中分离产氢粪红假单胞菌RLD-53》)(Bioresource Technology,100(2009)484-487)中公开。所述粪红假单胞菌RLD-53可从文章作者处购买得到。本实施方式步骤一所述细胞浓度为0. 8 I. 0g/L指菌液中的细胞干重。本实施方式所述接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液的体积之比。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述生长培养基由Ig乙酸钠、Ig琥拍酸钠、I. Og氯化铵、Ig牛肉膏、0. 5g蛋白胨、0. 2g氯化钠、0. 2g七水硫酸镁、0. 012g七水硫酸亚铁、0. 08g无水氯化HlmL微量元素液、0. 5g磷酸氢二钾、0. 5g磷酸二氢钾、0. 5g L-半胱氨酸、ImL生长因子液和IL蒸馏水组成，pH为7. 0 ;其中每升微量元素液由0. 05mg四水氯化猛、0. 05g五水硫酸铜、5mg六水氯化铁、0. 5mg六水硝酸钴、Img七水硫酸锌、Img硼酸和余量的蒸馏水组成；每升生长因子液由0. 35g烟酸、0. Ig生物素、0. 3g盐酸硫胺素、0. Ig泛酸I丐、0. 2g对氨基苯甲酸、0. 05g维生素B12、0. Ig盐酸卩比口多铵和余量的蒸馏水组成，PH为7. O。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中所述产氢培养基由4. Ig乙酸钠、I. 69g谷氨酸钠、0. 2g氯化钠、0. 2g七水硫酸镁、0. 012g七水硫酸亚铁、0. 08g无水氯化HlmL微量元素液、0. 5g磷酸氢二钾、0. 5g磷酸二氢钾、ImL生长因子液和IL蒸懼水组成；其中每升微量元素液由0. 05mg四水氯化猛、0. 05g五水硫酸铜、5mg六水氯化铁、0. 5mg六水硝酸钴、Img七水硫酸锌、Img硼酸和余量的蒸馏水组成；每升生长因子液由o. 35g烟酸、0. Ig生物素、0. 3g盐酸硫胺素、0. Ig泛酸I丐、0. 2g对氨基苯甲酸、0. 05g维生素B12、0. Ig盐酸吡哆铵和余量的蒸馏水组成，pH为7.0。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二中将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含lg/L L-半胱氨酸的产氢培养基中。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，按以下步骤进行一、将细胞浓度为 I. Og/L 的幾红假单胞菌(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53菌液按10%的接种量接种至生长培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养16小时，光照强度为150W/m2，得种子液；二、将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含lg/L L-半胱氨酸的产氢培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养72小时，即得到含有絮凝体的菌悬液。光发酵细菌絮凝性能的表征采用絮凝指数F%表征光发酵细菌的絮凝性能，设置对照试验，对照试验与本实施方式的区别仅在于步骤二的产氢培养基中不加入L-半胱氨酸。将本实施方式和对照试验获得的菌悬液均在12000rpm下离心IOmin,得菌体,用去离子水清洗菌体2次，然后悬浮于0. 01mol/L NaCl溶液中。在660nm下测定悬浮液吸光度A0,随后悬浮液于IOOOrpm条件下离心2min，取上清液在660nm条件下测其吸光度k10细菌的絮凝性能表示为F%= (I-A1A0) X 100%。实验结果对照试验(没添加L-半光氨酸)获得光发酵细菌的絮凝性能为16. 73%，本实施方式(添加L-半光氨酸)获得光发酵细菌的絮凝性能为40. 86%。上述结果表明L-半光氨酸能够显著增强光发酵细菌的絮凝性能。在连续流运行过程中，L-半胱氨酸能够提高光发酵细菌与出水的分离效率，出水流失将大大减少，有利于保持产氢反应器中的生物量，提高出水水质。光学相机拍摄的本实施方式光发酵细菌絮凝体照片如图I所示，扫描电镜拍摄的本实施方式光发酵细菌絮凝体微观结构图如图2所示。由图可以看出细菌细胞通过胞外聚合物紧密连接在一起形成絮体。光发酵细菌的氢气产率、絮凝性能及上清液吸光度曲线如图3所示，图中+表示氢气产率，表示絮凝性能~表示上清液吸光度。可以看出本实施方式与对比试验相比，氢气产率、絮凝性能及上清液吸光度都有显著提高。光发酵细菌胞外聚合物含量变化图如图4所示，图中I~~!表示核酸,■表示腐殖质，■表示蛋白，■表示多糖，■表示总胞外聚合物。可知本实施方式的胞外聚合物含量在60. 47mg/g。胞外聚合物成分以多糖和蛋白质为主，此外，含有少量核酸。胞外聚合物中多糖增加量较少，蛋白质含量增加较大，占胞外聚合物物总增加量的49. 75%。DLVO理论可用来描述微生物菌体之间的吸附或者絮凝行为，通过表面热力学分析与DLVO理论的耦合，对光发酵细菌絮凝机制进行更好的解析。研究结果表明L-半胱氨酸有效的降低了光发酵细菌细胞之间的斥力势能，在悬浮生长时斥力势垒为335KT，在I. 0g/LL-半胱氨酸下,斥力势鱼降低至109KT。
权利要求
1.一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，其特征在于增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，按以下步骤进行 一、将细胞浓度为0.8 I. Og/L的粪红假单胞菌(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53菌液按10%的接种量接种至生长培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养16小时，光照强度为150W/m2，得种子液； 二、将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含0.75 I. 25g/L L-半胱氨酸的产氢培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35°C连续光照培养72小时，即得到含有絮凝体的菌悬液。
2.根据权利要求I所述的一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，其特征在于步骤一中所述生长培养基由Ig乙酸钠、Ig琥拍酸钠、I. Og氯化铵、Ig牛肉膏、0. 5g蛋白胨、0. 2g氯化钠、0. 2g七水硫酸镁、0. 012g七水硫酸亚铁、0. 08g无水氯化钙、ImL微量元素液、0.5g磷酸氢二钾、0.5g磷酸二氢钾、0.5g L-半胱氨酸、ImL生长因子液和IL蒸馏水组成，pH为7. 0 ;其中每升微量元素液由0. 05mg四水氯化锰、0. 05g五水硫酸铜、5mg六水氯化铁、0. 5mg六水硝酸钴、Img七水硫酸锌、Img硼酸和余量的蒸馏水组成；每升生长因子液由0. 35g烟酸、0. Ig生物素、0. 3g盐酸硫胺素、0. Ig泛酸I丐、0. 2g对氨基苯甲酸、0. 05g维生素B12、0. Ig盐酸吡哆铵和余量的蒸馏水组成，pH为7. O。
3.根据权利要求I或2所述的一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，其特征在于步骤二中所述产氢培养基由4. Ig乙酸钠、1.69g谷氨酸钠、0. 2g氯化钠、0. 2g七水硫酸镁、0. 012g七水硫酸亚铁、0. 08g无水氯化HlmL微量元素液、0. 5g磷酸氢二钾、0.5g磷酸二氢钾、ImL生长因子液和IL蒸馏水组成；其中每升微量元素液由0. 05mg四水氯化猛、0. 05g五水硫酸铜、5mg六水氯化铁、0. 5mg六水硝酸钴、Img七水硫酸锌、Img硼酸和余量的蒸馏水组成；每升生长因子液由0. 35g烟酸、0. Ig生物素、0. 3g盐酸硫胺素、0. Ig泛酸钙、0. 2g对氨基苯甲酸、0. 05g维生素B12、0. Ig盐酸吡哆铵和余量的蒸馏水组成，pH为7.O。
4.根据权利要求3所述的一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，其特征在于步骤二中将步骤一得到的种子液按10%的接种量接种至含lg/L L-半胱氨酸的产氢培养基中。
全文摘要
一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法，涉及一种增强粪红假单胞菌絮凝性能的方法。是要解决目前光发酵细菌絮凝特性差，生物量不断流失，导致光发酵产氢反应器产氢效能低的问题。方法一、将粪红假单胞菌RLD-53菌液按10％的接种量接种至生长培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35℃连续光照培养16小时，光照强度为150W/m2，得种子液；二、将步骤一得到的种子液按10％的接种量接种至含L-半胱氨酸的产氢培养基中，然后置于120rpm的摇床上，于35℃连续光照培养72小时，即得到含有絮凝体的菌悬液。本发明可有效提高光发酵细菌的絮凝性能，实现光发酵细菌的絮凝生长。用于光发酵产氢领域。
文档编号C12R1/01GK102816797SQ201210312398
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者任南琪, 谢国俊, 刘冰峰, 丁杰, 任宏宇 申请人:哈尔滨工业大学