专利名称：黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在防治番茄病害上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及用途,更具体地说涉及一种黄麻链霉菌iStreptomycescorchorusii )NF0919菌株代谢产物及其在番茄病害防治上的应用，属于微生物农药技术领域。
背景技术：
番爺叶霉病/Wra)、番爺灰霉病ciflerea)和番爺枯萎病(.Fusarium oxysporum)和番爺疫病infestans)是番爺上主要的真菌和卵菌病害。番茄病害的防治当前主要通过化学防治来防控，常用的化学药剂有腐霉利、多菌灵、乙霉威、百菌清烟剂、嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、烯肟菌酯、唳酰菌胺和吡唑醚菌酯等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成番茄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗(耐)药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。目前成功用于防治番茄病害的微生物农药专用制剂较少。文献已报道生物防治控制病害的生防菌属(种)主要有木霉菌属真菌spp.)中的绿色木霉(Trichoderma viride )和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；芽抱杆菌属细菌 iBaciIlusspp.)中的枯草芽抱杆菌多粘芽抱杆菌Cfeci77w5·和巨大芽孢杆菌(ifeciJrJrW1S megaterium');假单胞菌属细菌spp.)中的突光假单胞细菌fluorescens')·;农用抗菌素，如农抗120、春雷霉素和武夷菌素等。本发明提供的可同时兼治番茄真菌和卵菌病害的颉颃细菌黄麻链霉菌NF0919菌株，在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
提供黄麻链霉菌iStreptomyces corchorusii) NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，及提取物在防治番爺叶霉病、番爺灰霉病、番爺枯萎病和番爺疫病上的应用。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886. I。黄麻链霉菌(拉丁文学名为Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V;
(B)二级种子培养液的培养
将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V ；
(C)发酵培养液的培养
将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2， 所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaCl
O.2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；
(D)NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本发明的有益效果是
本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时兼治番茄多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对番茄叶霉病、番茄灰霉病、番茄枯萎病和番茄疫病均有很好的防治效果。
具体实施方式
实施例本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886. I。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V;
(B)二级种子培养液的培养
将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V ；
(C)发酵培养液的培养
将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaCl
O.2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；
(D)NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本实施例的实施效果
(I )NF0919菌株发酵液的提取物，对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的毒力测定方法如下
取适量提取物，用无菌水梯度稀释，制成含提取物浓度分别5. 0,2. 5、I. 25,0. 625和
O.3125 mg/L的PDA平板，并设无菌水为空白对照，对照药剂用化学药剂为98%多菌灵(Carbendazim)按上述相同稀释浓度制成含药PDA平板。用直径为4 mm的打孔器分别在长有番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的PDA平板的边缘打取菌饼，将菌饼接种到上述含药(提取物和多菌灵)平板中央，每个病原菌的每个浓度设4个重复。将平板置于25°C保温培养箱中，培养72 h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径=菌落直径一菌饼直径)，计算抑制率。抑制率=(空白对照菌落净生长直径一含药的菌落净生长直径)/空白对照菌落净生长直径X 100%。用DPS 13. O软件计算毒力回归方程。NF0919发酵液的提取物对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌的毒力测定结果
毒力测定结果表明，NF0919菌株发酵液的提取物对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表I)，其EC5tl值(表3)分别为O. 4233 mg/L、
O.3652 mg/L和O. 5220 mg/L。相比之下，相同稀释倍数条件下98%多菌灵对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌菌丝生长抑制率(表2)较低，其EC5tl值(表3)分别为O. 7511mg/L、0. 6754 mg/L和O. 9656 mg/L。NF0919发酵液活性的提取物对番茄病原菌的室内毒力极显著高于化学药剂多菌灵。表I. NF0919菌株发酵液的提取物对番茄病原菌的平均抑制率
浓度(mg/L)_5^0_2^5_ I. 25O. 625O. 3125_O_
对番茄叶霉病菌的平均抑制率(％)_ 91.63 80.52 69.8056.2446.72_O_
对番茄灰霉病菌的平均抑制率(％)_ 92.92 83.49 72.9360.3449.20_O_
对番茄枯萎病菌的平均抑制率(％)_ 89.23 77.20 65.3453.4041.46_O_
表2. 98%多菌灵对番茄病原菌的平均抑制率
浓度(mg/L)_5^0_2^5_ I. 25O. 625 O. 3125_O_
对番茄叶霉病菌的平均抑制率(％)_ 80.26 69.32 57.6546.94 35.76_O_
对番茄灰霉病菌的平均抑制率(％) " 83. 13 —71.50 ~ 58. 35_ 49.20— 37.43 O
对番茄枯萎病菌的平均抑制率(％)_ 79.23 67.64 53.8041.56 29.84_O_
表3. NF0919菌株发酵液的提取物对番茄病原菌的毒力测定结果
权利要求
1.黄麻链霉菌iStreptomycescorchorusii ) NF0919菌株(该菌种特性见专利ZL201010236886. I)发酵液中代谢产物的提取方法。
2.根据权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治番爺叶霉病、番爺灰霉病、番爺枯萎病和番爺疫病上的应用。
3.权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤 (A)菌株的活化与一级种子培养液的培养 将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL 一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h,其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V ； (B)二级种子培养液的培养 将步骤(A)所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL 二级种子培养液中，170rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分:马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为VV； (C)发酵培养液的培养 将步骤(B)所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡齐IJ(XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂)1.6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 V，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白·2. 6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V; (D)NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法 把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏编号为CGMCCNo.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1)发酵液中活性代谢产物的提取方法。代谢产物能有效防治番茄叶霉病(Fulviafulva)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、番茄枯萎病(Fusariumoxysporum)和番茄疫病(Phytophthorainfestans)。
文档编号C12R1/465GK102911970SQ20121035462
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月23日 优先权日2012年9月23日
发明者杨敬辉, 陈宏州, 庄义庆, 张文文 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所