专利名称：一种用于提取紫珠属植物叶片dna的方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，具体而言，涉及一种紫珠属植物新鲜叶片和硅胶干燥叶片的DNA提取方法。
背景技术：
马鞭草科紫珠属植物共有150余种，中国产49种，其中大多数种类叶片和根中富含黄酮类、缩合鞣质、多糖类等次生代谢物质，具有止血、散瘀、消炎等功效，因此本属许多种植物是我国传统的中药材。此外，本属植物因果实紫色似串串珍珠而得名，是优良的秋冬季观果园林植物，极具观赏价值和开发前景，但有些种类存在株型散乱、果实小、抗性差等问题，因此，为了改良上述不良性状，开发本属植物的园林观赏价值，有必要开展紫珠属植物的育种研究，从而获得园林性状更加优良的资源。
随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助育种技术可大大加快育种进程，提高育种效率。而DNA提取是开展分子标记研究的前提和关键。紫珠属植物作为药用植物，其叶片和根部都含有较多的黄酮类、缩合鞣质，这些次生代谢物的存在严重影响了 DNA提取的纯度，进而影响到后续的DNA扩增工作。因此，紫珠属植物的DNA成功提取是开展本属植物分子标记和辅助育种研究的重要前提。关于紫珠属植物叶片DNA提取方法未见报道。
电泳结果表明，传统的DNA提取方法(如SDS法)提取出来的本属植物老鸦糊、紫珠、枇杷叶紫珠等种类的叶片DNA中常含有蛋白质，在紫外灯下表现为点样孔呈现亮带，DNA纯度检测显示A26(i/2M小于I. 80，且由于叶片中含有较多的黄酮类、缩合鞣质等杂质，这些物质的存在对后续的分子标记技术有很大的影响。因此，有必要对紫珠属植物的叶片DNA提取方法进行改进。
发明内容
针对上述情况，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于通过大量试验研究，提供一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法。该方法可有效解决传统SDS提取法提取的总DNA带有少量蛋白，并消除紫珠属植物叶片内过多的黄酮类、缩合鞣质等杂质造成的DNA纯度低的问题。本发明的目的是这样实现的
一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，包括如下步骤
(1)在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分pH8.0的Tris HCl80-120mM、pH8.0 的 EDTA 30_60mM、NaCl 60-120mM、3_6wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2_3wt% 巯基乙醇、0. 7-1. 2wt% RNAase ；
(2)取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述离心管中，使样品与裂解液充分混勻；
(3)将上述离心管置于62-68°C水浴中保温15-30min，期间轻轻摇动离心管2_4次；
(4)取出离心管，加入KAc使终浓度为0.8-1. 2M，然后冰浴15_30min ；(5)室温下10000-15000rpm 离心；
(6)取上清液置另一灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，混匀，室温下6000-10000rpm离心；
(7)取上清液置于新的灭菌离心管中，重复步骤(6)操作；
(8)离心后取上清液转入新的灭菌离心管中，加入2/3体积的_20°C下预冷的异丙醇，混匀，置于_20°C冰箱中20-40min ；
(9)取出后6-12°C下10000-1500 0rpm离心，弃上清液，收集沉淀；
(10)加入70%(v/v)乙醇漂洗沉淀，然后6-12°C下13000-18000rpm离心，弃上清，收集沉淀；
(11)重复步骤(10)操作；
(12)弃上清，得基因组DNA。优选地，所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，包括如下步骤
(1)在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分pH8.0的Tris HCl90-110mM、pH8. (^AEDTA 45-50mM、NaCl 90-100mM、4_5wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2. 3-2. 7wt%疏基乙醇、0. 9-1. lwt% RNAase ；
(2)取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述灭菌离心管中，上下颠倒，使样品与裂解液充分混匀；
(3)将上述离心管置于65°C水浴中保温20min，期间轻轻摇动离心管2_3次；
(4)取出离心管，加入KAc使终浓度为0.95-1. 05M，然后冰浴20 min ；
(5)室温下13000 rpm 离心 20 min ；
(6)取上清液置另一灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，轻轻颠倒离心管，混匀，室温下8000 rpm离心IOmin ；
(7)取上清液置于新的灭菌离心管中，重复步骤(6)操作一次；
(8)离心后取上清液转入新的灭菌离心管中，加入2/3体积的_20°C下预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置于-20 °C冰箱中30 min ；
(9)取出后9"€下13000 rpm离心10 min,弃上清液,收集沉淀；
(10)加入70%(v/v)乙醇漂洗沉淀,然后9°C下15000 rpm离心15 min,弃上清,收集沉淀；
(11)重复步骤(10)操作一次；
(12)弃上清，得基因组DNA。进一步优选地，所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其中步骤(2)所述的植物叶片应去除叶柄、叶脉部分，取叶肉部分，其用量为约Icm2面积，质量约20mg。进一步优选地，所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其中所述紫珠属植物为白棠子、老鸦糊、紫珠、枇杷叶紫珠、大叶紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠。进一步优选地，所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其中所述紫珠属植物的叶片为新鲜叶片或硅胶干燥叶片。本发明涉及的紫珠属植物叶片DNA提取方法与传统SDS提取法相比，具有以下优点和显著的进步
(I)最终提取的因组DNA纯度高，有效克服了传统CTAB法提取含有蛋白、DNA纯度较低等问题，保证了后续分子标记技术的顺利开展。(2)提取时间缩短为4-5h，提高了工作效率。(3)所需的样品量少，DNA得率高，仅需20mg叶片，提取的DNA可以满足分子标记
的用量。(4)根据紫珠属植物的特点进行改进，是适合紫珠属植物叶片DNA提取的通用方法，尤其适用于白棠子、老鸦糊、紫珠、枇杷叶紫珠、大叶紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠等本属植物叶片DNA提取。此外，本发明同样适用于其它蛋白不易去除以及含黄酮类、缩合鞣质等次生代谢物质的植物叶片DNA提取。(5)适用于采用硅胶法干燥保存的紫珠属植物叶片，解决了外地采样的长距离运 输导致样品失效的问题。
具体实施例方式以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例一新鲜叶片DNA的提取
裂解缓冲液成分为Tris .Cl 100 mM,pH8. 0 ；EDTA 50mM, pH8. 0 ；NaCl IOOmM ；5% PVP,配置好后高温121°C灭菌20min备用；
在I. 5 mL灭菌离心管中加入500 ML裂解缓冲液、50 ML 20%的SDS、14 ML巯基乙醇、5ML RNAase备用；取白棠子新鲜叶片大约Icm2，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，之后将粉末转移至上述离心管中，上下颠倒，使样品与裂解液充分混匀；将上述离心管置于65 °〇水浴中保温20 min，其间轻轻摇动离心管2-3次；取出离心管，加入150 ML 5M的KAc，然后冰浴20 min ;室温下13000 rpm离心20 min ;取上清液置灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，轻轻颠倒离心管，混匀，室温下8000 rpm离心10 min ;取上清液置于新的I. 5 mL无菌离心管中，重复等体积氯仿异戍醇抽提一次；离心后取上清液转入新的I. 5 mL离心管中，加入2/3体积的-20 °C下预冷的异丙醇，轻轻颠倒混勻，置于-20 °C冰箱中30min ;取出后9 "€下13000 rpm离心10 min,弃上清液，收集沉淀；加入70% (体积比)乙醇I mL漂洗沉淀，然后9°C下15000 rpm离心15min,弃上清，收集沉淀；重复70%乙醇漂洗一次；弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物，用50ML TE缓冲液溶解，即得高质量的基因组DNA，经过稀释后可直接用于PCR扩+
>曰o实施例二硅胶法干燥保存叶片DNA的提取
野外样品保存野外采集枇杷叶紫珠的幼嫩叶片3-4片，装入50mL离心管中，用蓝色硅胶颗粒填充叶片与离心管壁之间的空隙，注意尽量使叶片完全被硅胶颗粒包埋，然后旋紧离心管盖，于1-2天内、硅胶变为粉红色前带回室内，将叶片取出放入空离心管中，放A _70°C冰箱中保存。裂解缓冲液成分为=Tris Cl 100 mM, pH8. 0 ；EDTA 50mM, pH8. 0 ；NaCl IOOmM ；5%PVP，配置好后高温121°C灭菌20min备用；
DNA提取0嫩提取在1.5 mL灭菌离心管中加入500 ML裂解缓冲液、50 ML 20%的SDS、14 ML巯基乙醇、5ML RNAase备用；从超低温冰箱中取枇杷叶干燥叶片大约1cm2，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，之后将粉末转移至上述离心管中，上下颠倒，使样品与裂解液充分混匀；将上述离心管置于65 °C水浴中保温20 min，其间轻轻摇动离心管2-3次；取出离心管，加入150 ML 5M的KAc，然后冰浴20 min ;室温下13000 rpm离心20 min ;取上清液置灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，轻轻颠倒离心管，混勻，室温下8000 rpm离心10 min ;取上清液置于新的I. 5 mL无菌离心管中，重复等体积氯仿异戊醇抽提一次；离心后取上清液转入新的I. 5 mL离心管中，加入2/3体积的_20°C下预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置于-20 °C冰箱中30min ;取出后9 °C下13000 rpm离心10 min,弃上清液，收集沉淀；加入70%(体积比)乙醇I mL漂洗沉淀，然 后9°C下15000 rpm离心15 min，弃上清，收集沉淀；重复70%乙醇漂洗一次；弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物，用50ML TE缓冲液溶解，即得高质量的基因组DNA，经过稀释后可直接用于PCR扩增。
权利要求
1.ー种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，包括如下步骤 (1)在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分pH8.O的Tris · HCl80-120mM、pH8.O 的 EDTA 30_60mM、NaCl 60-120mM、3_6wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2_3wt% 巯基こ醇、0· 7-1. 2wt% RNAase ； (2)取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述离心管中，使样品与裂解液充分混勻； (3)将上述离心管置于62-68°C水浴中保温15-30min，期间轻轻摇动离心管2_4次； (4)取出离心管，加入KAc使终浓度为O.8-1. 2M，然后冰浴15_30min ； (5)室温下10000-15000rpm 离心； (6)取上清液置另ー灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，混匀，室温下6000-10000rpm离心； (7)取上清液置于新的灭菌离心管中，重复步骤(6)操作； (8)离心后取上清液转入新的灭菌离心管中，加入2/3体积的-20°C下预冷的异丙醇，混匀，置于_20°C冰箱中20-40min ； (9)取出后6-12°C下10000-15000rpm离心，弃上清液，收集沉淀； (10)加入70%(v/v)こ醇漂洗沉淀，然后6-12°C下13000-18000rpm离心，弃上清，收集沉淀； (11)重复步骤(10)操作； (12)弃上清，得基因组DNA。
2.根据权利要求I所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分pH8.O的Tris · HCl90-110mM、pH8. O 的 EDTA 45_50mM、NaCl 90-100mM、4_5wt% PVPU. 5-2wt% SDS、2. 3-2. 7wt%疏基こ醇、0. 9-1. lwt% RNAase ； (2)取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述灭菌离心管中，上下颠倒，使样品与裂解液充分混匀； (3)将上述离心管置于65°C水浴中保温20min，期间轻轻摇动离心管2_3次； (4)取出离心管，加入KAc使终浓度为O.95-1. 05M，然后冰浴20 min; (5)室温下13000 rpm 离心 20 min ； (6)取上清液置另ー灭菌离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合溶液，其配比是氯仿异戊醇体积比为24 :1，轻轻颠倒离心管，混匀，室温下8000 rpm离心IOmin ； (7 )取上清液置于新的灭菌离心管中，重复步骤(6 )操作一次； (8)离心后取上清液转入新的灭菌离心管中，加入2/3体积的-20°C下预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置于-20で冰箱中30 min ； (9)取出后9°C下13000 rpm离心10 min,弃上清液,收集沉淀； (10)加入70%(v/v)こ醇漂洗沉淀,然后9で下15000 rpm离心15 min,弃上清,收集沉淀； (11)重复步骤(10)操作一次； (12)弃上清，得基因组DNA。
3.根据权利要求I或2所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其特征在于步骤(2)所述的植物叶片应去除叶柄、叶脉部分，取叶肉部分，其用量为约Icm2面积，质量约20mgo
4.根据权利要求I或2所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其特征在于所述紫珠属植物为白棠子、老鸦糊、紫珠、枇杷叶紫珠、大叶紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、裸花紫珠。
5.根据权利要求I或2所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，其特征在于所述紫珠属植物的叶片为新鲜叶片或硅胶干燥叶片。
全文摘要
本发明公开了一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，该方法是对传统SDS提取法的改进，适用于紫珠属植物的新鲜叶片或硅胶干燥叶片DNA提取，可有效解决传统SDS法提取的总DNA带有少量蛋白，并消除紫珠属植物叶片内过多的黄酮类、缩合鞣质等杂质造成的DNA纯度低的问题。
文档编号C12N15/10GK102851278SQ20121035882
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者许林, 杜克兵, 陈法志, 戢小梅, 谢焰锋, 郭彩霞, 周媛, 童俊, 陈卫东 申请人:武汉市林业果树科学研究所