专利名称：一种鱼卵分类分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼卵分类分子鉴定方法，能快速、准确地对形态学难以鉴定的鱼卵进行分类鉴定，属于渔业资源技术领域。
背景技术：
鱼卵记载了鱼类许多早期发育生活史特征及相关生态学信息，在环境评估、渔业资源解析、渔业资源增殖放流和养殖等研究领域都具有重要意义。鱼卵种类的准确鉴定是研究鱼类生活史和鱼类资源评估的工作基础。一方面鱼卵种类的准确鉴别是进行渔业资源评估的前提，另一方面鱼类早期发育又与渔业资源的早期补充机制密切相关。因此，越来越多的学者开始关注鱼卵分类及其生物、生态学研究。目前鱼卵种类鉴定主要依赖传统形态学方法，即依据胚胎的外部特征(如鱼卵的形状、卵径、卵膜构造、油球有无及油球径大小、卵黄构造、卵黄大小、胚体形态及色素出现的早晚等)来判断。由于部分鱼卵在形态上高度 相似、产卵期和产卵区的交叉重叠及缺乏可靠的鉴定资料，鱼卵种类的准确鉴定十分困难。迄今为止，只有较少数的鱼卵可以被鉴定到种，许多鱼卵只能鉴定到科或属的水平。
发明内容
本发明的目的即为克服传统形态学鉴定方法的不足之处，提供一种鱼卵分类分子
鉴定方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为首先分别提取调查水域鱼类的DNA，选择线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚单位I基因(CO I)为特征片段，通过扩增后测序，建立线粒体CO I基因DNA指纹库，然后提取需要鉴定的鱼卵的DNA，扩增CO I基因后测序，与指纹库中的序列进行比对，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判断属于同一个种，从而鉴定出鱼卵种类。上述方法中，鱼类的样本应尽量全面，提取的鱼类或鱼卵的DNA，可以为总DNA，也可以仅提取线粒体DNA ;总DNA的提取方法可采用常规苯酚-氯仿法(《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔))；线粒体DNA的提取方法可采用Triton法、碱变性法、改进高盐沉淀法等(参见李伟文，线粒体DNA提取方法的比较.国外医学分子生物学分册；2003 ；25 (3) ；191) ；DNA的扩增方法可采用常规PCR方法。线粒体DNA中CO I基因较保守，同源性高，无组织特异性，进化速度快，在鱼卵中也存在大量的拷贝数，非常适合作为分子标记物。本发明选择线粒体细胞色素氧化酶亚单位I基因(COI)为特征片段建立DNA指纹库，实验操作简单，分类鉴定准确。使用该方法对鱼卵进行分类鉴定与传统形态学方法相比具有以下优势
(I)传统形态学方法借助显微镜根据胚胎形态差异对鱼卵样本进行鉴定，不仅要求鉴定者具备扎实的鱼类早期分类鉴定知识，而且准确鉴定到种极其困难；而鱼类线粒体COI基因在DNA片段中相对保守，是稳定可靠的种间分子标记，分类鉴定结果准确；(2)传统形态学方法在无法对鱼卵样本准确分类的情况下，需要对鱼卵进行孵化培养，待胚胎发育至形态发生分化，直至有明显的形态差异时再进行分类鉴定。这种方法对鱼卵采集后的孵化条件及孵化技术要求很高，而且需要耗费大量的时间和精力。本发明的方法在采集鱼卵后仅需要用95%的酒精保存，不需要复杂的保存条件，带回实验室后经过步骤简单的实验，获得CO I基因序列后经比对DNA库可以快速、准确的对样本进行分类鉴定。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明不限于下述实施例。一种鱼卵分类分子鉴定方法，采用以下步骤
1、在调查水域通过现场捕捞、市场购买等方法获取可以准确分类鉴定的鱼类样本，用95%乙醇固定，带回实验室_4°C保存备用； 2、取上述一种鱼类样本肌肉约IOOmg装入I.5ml的Eppendorf管中，参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔)采用常规苯酚-氯仿法提取样本总DNA ；
3、选择COI基因为特征片段，采用PCR扩±曾，上游引物(5 , — 3 '):AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC，下游引物(5 ' — 3 ' ) CCTGCAGGAGGAGAYCC，PCR 反应体系为20μ L，包括 IOXbuffer (含 Mg2+)2y L、2. 5 mmol/L dNTP 2 μ L、10 μ mol/L 上下游引物各IuL, 5 U TaqDNA 聚合酶 O. 2μ L.50 ng/μ L 的 DNA 模板 I μ L，用超纯水补足 20 μ L ;PCR扩增的反应条件为94°C预变性3min ;每一循环94°C 30 s，55°C 40 s,72°C 50 s;共35个循环，最后72°C延伸8min ；
4、PCR产物经I.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk(上海申能博彩生物有限公司)纯化试剂盒回收，送测序；
5、重复步骤2-4，获得各鱼类样本的线粒体COI基因序列，汇总建立该水域各种鱼类DNA指纹库；
6、在调查水域采集鱼卵样本，保存于95%酒精中带回实验室，分别取鱼卵约IOOmg按步骤2-4所述的实验方法获得鱼卵线粒体CO I基因的序列；
7、将鱼卵线粒体COI基因序列与已经建立的CO I基因DNA指纹库进行比对，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判断属于同一个种，从而鉴定出鱼卵种类。本发明提供的鱼卵分子鉴定方法准确度高，实验周期短，对样本要求低，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。
权利要求
1.一种鱼卵分类分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 (1)分别提取调查水域鱼类的DNA，选择线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚单位I基因COI为特征片段，通过PCR扩增后测序，建立线粒体CO I基因DNA指纹库； (2)提取需要鉴定的鱼卵的DNA，PCR扩增COI基因后测序； (3)将所述鱼卵的COI基因序列与所述指纹库中的基因序列进行比对，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判断属于同一个种，从而鉴定出鱼卵种类。
2.如权利要求I所述的鱼卵分类分子鉴定方法，其特征在于所述提取的鱼类或鱼卵的DNA，为总DNA或线粒体DNA。
3.如权利要求I所述的鱼卵分类分子鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增所用的引物为上游引物(5 ' - 3 ' ) AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC ;下游引物(5 ' - 3 ')CCTGCAGGAGGAGAYCC。
全文摘要
本发明公布了一种鱼卵分类分子鉴定方法，首先分别提取调查水域鱼类的DNA，选择线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚单位I基因(COI)为特征片段，通过扩增后测序，建立线粒体COI基因DNA指纹库，然后提取需要鉴定的鱼卵的DNA，扩增COI基因后测序，与指纹库中的序列进行比对，从而鉴定出鱼卵种类。本发明的方法操作简单，分类鉴定准确。
文档编号C12Q1/68GK102864240SQ20121038230
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者张敏莹, 施炜纲, 徐东坡, 刘凯, 周彦锋, 段金荣, 方第安 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心