专利名称：刀鲚性别特异srap标记带的筛选方法及性别鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及性别鉴定方法，属于渔业生物技术领域。
背景技术：
刀鲂(<Sbi7ia ectenes Jordan et Seale)又名长颌鲂,俗称刀鱼、毛刀鱼，隶属鲱形目(Clupeiformes),鲱科(Clupeidae),鲂属(Coilia)。其肉质细嫩,味道鲜美,是长江中下游重要的洄游性经济鱼类。由于多年持续高强度捕捞及水域环境污染等原因，刀鲚自然资源量锐减，洄游群体低龄化趋势明显。为了保护和利用刀鲚资源，近年来不少科研单位开始尝试刀鲚的池塘养殖和人工繁殖。要实现刀鲚的人工繁殖，需要对灌江纳苗养殖的刀鲚后备亲鱼进行雌雄配对和注射催产激素。刀鲚的性成熟期为2-3年，由于刀鲚雌雄鱼 没有明显形态差异，只在繁殖季节成熟雌、雄鱼腹部膨胀隆起的轮廓略有差异。传统的性别鉴定方法主要靠解剖性腺组织和在成熟期进行外部形态观察。但是，解剖法对鱼体有致命的伤害，外部形态观察只能在繁殖季节对性成熟亲鱼进行鉴定。对未达性成熟或非繁殖季节的成熟刀鲚，没有有效的方法来进行性别鉴定；现有性别鉴定技术严重制约了刀鲚的人工繁殖及池塘养殖技术的发展。SRAP (sequence-related amplified polymorphism)是由美国加州大学 Li 与Quiros博士开发出的新型DNA分子标记技术。其原理是利用独特的正反引物设计，对开放阅读框进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与外显子间隔区长度不同而产生多态性。该分子标记技术有简便、快速、稳定、不需预知序列信息等优点，不仅广泛应用于植物的遗传多样性分析、基因定位和遗传图谱构建等，近年来已在水产动物遗传多样性及相关分子标记的筛选等方面得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的提供一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及分子水平的刀鲚性别鉴定方法，克服了刀鲚现有性别鉴定技术的局限和不足，提供了一种准确、便捷的性别鉴定方法。刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法，包括以下步骤
(I)采集刀鲚样本，解剖鱼体进行性别鉴定，分别提取雌、雄样本总DNA ；(2)设计SRAP引物序列(见表I) 14条共49对，分别进行SRAP-PCR扩增，筛选出雌、雄性别特异标记带SRAPl 和 SRAP2 ；
表I用于刀鲚SRAP-PCR反应的引物信息
权利要求
1.一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法，其特征在于包括以下步骤 (I)采集刀鲚样本，解剖鱼体进行性别鉴定，分别提取雌、雄样本总DNA ；(2)设计SRAP引物序列(见表I) 14条共49对，分别进行SRAP-PCR扩增，筛选出雌、雄性别特异标记带SRAPl 和 SRAP2， 正向引物(5' —3') me I TGAGTCCAAACCGGATA me2 TGAGTCCAAACCGGAGC me3 TGAGTCCAAACCGGAAT me4 TGAGTCCAAACCGGACC me5 TGAGTCCAAACCGGAAG me6 TGAGTCCAAACCGGTAA me7 TGAGTCCAAACCGGTCC 反向引物(5' — 3') eml GACTGCGTACGAATTAAT em2 GACTGCGTACGAATTTGC em3 GACTGCGTACGAATTGAC em4 GACTGCGTACGAATTTGA em5 GACTGCGTACGAATTAAC em6 GACTGCGTACGAATTGCA em7 GACTGCGTACGAATTCAA ； (3)回收性别特异标记带SRAP1、SRAP2，测序。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述SRAP-PCR反应体系为25yL的PCR体系中含有Mg2+ I. 5 mmol/L、Taq酶O. 5U、模板DNA 60ng、dNTPs O. 20mmol/L、引物O. 2 μ mol/L0
3.一种刀鲚性别鉴定方法，其特征在于包括以下步骤 (I)采集未知性别的刀鲚样本，提取样本总DNA ;(2)分别以引物对P1F/P1R、P2F/P2R为引物，以样本总DNA为模板进行PCR扩增；(3)电泳检测扩增产物，能扩增出如权利要求I中所述的SRAPl标记带的即为雌刀鲚，能扩增出如权利要求I中所述的SRAP2标记带的即为雄刀鲚。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的PCR反应体系为25μ L的PCR体系中含有 Mg2+ I. 5 mmol/L、Taq 酶 O. 5U、模板 DNA 60ng、dNTPs O. 20mmol/L、引物 O. 2 μ mol/L0
全文摘要
本发明公布了一种刀鲚性别特异SRAP标记带的筛选方法及性别鉴定方法，通过49对引物对的SRAP-PCR反应，筛选刀鲚性别特异SRAP标记带，然后用特异引物对扩增性别未知刀鲚的DNA样品，通过能否扩增出相应特异条带来鉴别刀鲚的性别。本发明克服了刀鲚现有性别鉴定技术的局限和不足，提供了一种准确、便捷的性别鉴定方法。
文档编号C12N15/11GK102899321SQ20121038230
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者张敏莹, 施炜纲, 徐东坡, 刘凯, 段金荣, 方第安 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心