专利名称：源于B10BR的Nrf2过表达黑素细胞株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种源于BlOBR的Nrf2过表达黑素细胞株，及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。背景技术：
白癜风是由于表皮黑素细胞缺失引起的色素障碍性皮肤病，其发病机制不明确，临床治愈困难。近几年人们对于黑素细胞缺失机制有了新认识内源性损伤导致了免疫应答，进而引起黑素细胞自毁，引发白癜风(J Invest Dermatol. 2005, 124(4): 798-806.)。氧化应激易引起细胞损伤，在进展期和稳定期的白癜风患者中都发现有氧化-抗氧化失衡的现象，这表明氧化应激对白癜风的发病乃至进展过程中都有重要的影响，而且这些现象的研究已直接引起临床治疗理念的革新，抗氧化治疗已成为白癜风临床治疗新策略。
存在于植物、水果、蔬菜及中药中的天然的抗氧化剂不尽其数，包括多酚类化合物、黄酮类化合物、皂苷类化合物和多糖类等。绿茶提取物、槲皮素等抗氧化物能够减少过氧化氢诱导的黑素细胞死亡，具有抗氧化保护作用，临床疗效显著，可以促进白癜风患者皮损明显复色，而被普遍认为具有抗氧化作用的维生素C、叶酸、硒等对黑素细胞的抗氧化保护作用并不显著，这表明不同抗氧化剂对黑素细胞的保护作用是不同的。目前人们在白癜风研究中所用的抗氧化剂存在选择上的随机性，主要原因是目前尚无针对白癜风的高通量抗氧化药物筛选体系。药物筛选体系的建立是寻找和发现新药的重要条件之一，以往经典的抗氧化模型如过氧化氢等的检测方法比较复杂且有着明显的缺陷，因为它们不能反映化合物的抗氧化机制(如抗氧化蛋白之间的相互作用)、不能高通量和微量化检测。分子与细胞水平的筛选体系具有材料用量少，药物作用机制明确，可进行大规模筛选等特点，已成为目前药物筛选的主要方法。因此，建立白癜风抗氧化药物筛选体系是抗氧化药物筛选的重要基础，对抗氧化治疗白癜风具有重要意义。
人体内具备一套完整的防止活性氧自由基损伤的抗氧化酶(如谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)等)，维持体内自由基产生和清除的平衡，一旦平衡被破坏就会导致氧化应激。新近发现的核因子E2相关因子2 (NF-E2-related factor2, Nrf2) 是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，属于CNC (cap ‘n’collar)转录因子家族，由 bZIP、碱性区、酸性区、和cap ‘n’collar区组成，Nrf2基因位于染色体2q31，全长2884bp, 其蛋白分子量为 57 kDa (Cancer Lett. 2006，233(2) : 208-218·)。生理状态下，Nrf2 与胞质蛋白Keapl (Kelch-like ECH-associated proteinl)偶联并被锚定在胞衆,且被泛素蛋白酶体途径迅速降解。氧化应激源作用下，Nrf2从Keapl解离，然后稳定状态的Nrf2转位进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)上GCTGAGTCA位点结合，启动ARE调控的II相解毒酶基因(血红素氧合酶(H0-1)和NADPH醌氧化还原酶I (NQ01))和抗氧化酶基因的表达， 提高细胞抗氧化应激能力(Free RadicBiol Med, 2004, 36(10) : 1208-1213·)。
鉴于Nrf2是抗氧化反应的中枢调节者，Nrf2_ARE是调节II相解毒酶和抗氧化基因的转录激活的作用靶点，本发明拟通过构建包含Nrf2的真核表达载体并包裹慢病毒质粒，感染鼠永生化黑素细胞株B10BR，获得Nrf 2过表达黑素细胞株Nrf 2-B10BR，可以用于进一步构建体内外抗氧化药物筛选模型，从而深入研究黑素细胞中的抗氧化药物作用机制， 为白癜风临床治疗提供有应用价值的抗氧化药物，具有较好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株源于BlOBR的Nrf2过表达的黑素细胞株及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。
本发明采用的技术方案是
一种源于BlOBR的Nrf2过表达黑素细胞株Nrf2_B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年9月25日，保藏编号CCTCC No: C 2012124。
该细胞株采用Nrf2编码基因(即人NFE2L2基因)过表达慢病毒感染获得。具体步骤如下1)构建人NFE2L2基因过表达慢病毒质粒；提取人黑素细胞总RNA，根据Nrf2基因序列(基因库登录号 NM006164 )设计特异性引物，NFE2L2-AgeI-F( 5，-GAGGATCCCCGGGTACCGG TCGCCACCATGATGGACTTGGAGCTGC-3’,含交换配对碱基、Age I酶切位点(下划线标记的)以及表达增强序列(双下划线记的)，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因)和 NFE2L2- Nhe I-R (5’ -TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTTTTTCTTAACATCTGGCTTC-3，，含交换配对碱基和Nhe I酶切位点，并含有目的基因3’端部分序列用于PCR钓取目的基因)扩增Nrf2基因1818bp。使用Age I和Nhe I双酶切消化慢病毒载体pGC-FU_EGFP_3Flag (阳性对照)， 目的基因亚克隆至慢病毒载体pGC-FU-EGFP-3Flag的Age I和Nhe I酶切位点，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆并测序验证，蛋白免疫印迹检测慢病毒载体目的质粒(PGC-FU-NFE2L2 )转染293T后样品中的目的蛋白表达。2)慢病毒包装； 由上海吉凯基因化学有限公司完成，步骤如下制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen 公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。3)慢病毒感染BlOBR细胞；感染前一天接种5X IO4个细胞接种于 6孔培养板中培养，每孔加2 ml培养基，病毒复感染指数为100，感染后24h观察病毒转染效率。4)检测目的蛋白；病毒感染BlOBR后获得Nrf2过表达黑素细胞株(Nrf2-B10BR)，蛋白免疫印迹观察该株细胞的目的融合蛋白Flag-Nrf2的表达，以及中药单体银杏叶提取物和抗氧化物叔丁基对苯二酚(TBHQ)作用于Nrf2-B10BR细胞后Nrf2的表达。
本发明还涉及所述的黑素细胞株Nrf2-B10BR在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。具体为所述黑素细胞株Nrf2-B10BR作为体外抗氧化药物筛选细胞模型用于白癜风抗氧化药物的筛选。
本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种新型黑素细胞Nrf2过表达细胞株Nrf2-B10BR，其起源于BlOBR细胞，过表达Nrf2蛋白，这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究黑素细胞抗氧化机制，筛选和评估新型抗氧化药物等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
图I为倒置显微镜和荧光显微镜观察感染和未感染目的基因慢病毒质粒的BlOBR 细胞的照片；
图2为蛋白免疫印迹检测Nrf2-B10BR细胞中目的融合蛋白Flag_Nrf2的表达；
图3为MTT法测定银杏叶提取物(A)和TBHQ (B)的作用浓度；
图4为蛋白免疫印迹检测不同处理的Nrf2-B10BR细胞中Nrf2核蛋白的表达；
图5为蛋白免疫印迹检测不同处理的Nrf2-B10BR细胞中NQOl蛋白和HO-I蛋白的表达；具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例I :人NFE2L2慢病毒表达质粒包装病毒感染BlOBR后细胞形态学观察
(I)实验材料
细胞株小鼠永生化黑素细胞株B10BR(美国耶鲁大学皮肤科实验室惠赠并由本实验室保存)。
试剂耗材F12培养液，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，双抗(青霉素+链霉素)， 马血清(HS)，35mm培养皿(美国corning生物公司)；鼠抗flag多克隆抗体，FITC标记山羊抗小鼠IgG，免疫封闭液(购于碧云天生物技术研究所)，仪器荧光倒置显微镜，倒置光学显微镜，细胞培养箱，超净工作台。
(2)实验方法
接种I X IO4个BlOBR细胞于6孔培养板中，所加培养基为2 ml，细胞融合率约为 3(Γ50%进行病毒感染，步骤如下以病毒原液ENi. S=I 19按需制备病毒工作液，每孔加 Λ 30 ul病毒工作液，24h后进行细胞免疫荧光检测，具体如下4%多聚甲醛于室温固定10 min后，加入透膜液O. 5% Triton X-100作用IOmin,免疫封闭液室温作用30min, lmol/L PBS洗3次后加入鼠抗Flag多克隆抗体室温作用lh，lmol/L PBS洗3次后加入FITC标记山羊抗小鼠IgG，室温作用30min，lmol/L PBS洗3次后倒置荧光显微镜或光学显微镜观察细胞形态，拍照。
(3)实验结果
结果见图I，病毒感染人NFE2L2慢病毒表达质粒至BlOBR后免疫荧光检测Flag融合蛋白，可见绿色荧光，与其光镜图片对照，感染效率近100%，而未感染病毒质粒的BlOBR 中未见绿色荧光，与光镜图片对照，未见感染细胞。
(4)结论
人NFE2L2慢病毒表达质粒已成功感染至B10BR，所获得细胞株为Nrf2_B10BR。
实施例2 Nrf2-B10BR细胞中目的融合蛋白Flag-Nrf2的检测
(I)实验材料
细胞株同实施例I
试剂耗材F12培养液，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，双抗(青霉素+链霉素)， 马血清(HS), 35mm培养皿(美国corning生物公司)；鼠抗Flag多克隆抗体(购于江苏碧云天生物技术研究所)，IRDye 680RD Goat anti Mouse IgG Highly cross adsorbed (700nm 抗鼠)(购于美国基因生物公司)，仪器licor odsessy双色红外线凝胶成像系统。
(2)实验方法
病毒感染BlOBR细胞同实施例1，细胞裂解后收集总蛋白进行蛋白免疫印迹检测， 具体如下每组蛋白上样量50μ g进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。PVDF膜常温下5%BSA封闭Ih后，加入I 1000稀释的Flag多克隆抗体，室温孵育I h，PBST洗涤3次，后加入I : 10000稀释的IRDye 680RD Goat anti Mouse IgG Highly cross adsorbed (700nm 抗鼠)，室温下避光孵育 30 min, PBST 洗漆 3 次后 licor odsessy双色红外线凝胶成像系统拍照。
(3)实验结果
结果见图2，病毒感染人NFE2L2慢病毒表达质粒至BlOBR后蛋白免疫印迹检测 Flag-Nrf2融合蛋白，可见一条分子质量约110 000 Da大小的特异性条带,而未感染病毒质粒的B10BR中未检测出特异性条带。
(4)结论
人NFE2L2慢病毒表达质粒已成功感染至B10BR，所获得细胞株为Nrf2_B10BR。
实施例3 =MTT法确定银杏叶提取物和TBHQ的作用浓度
(I)实验材料
细胞株Nrf2-B10BR(CCTCC No: C 2012124)。
试剂耗材F12培养液，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，双抗(青霉素+链霉素)，马血清(HS)，35mm培养皿(美国Corning生物公司)；银杏叶提取物和叔丁基对苯二酚 (TBHQ)(均购于美国Sigma生物公司)，噻唑蓝(MTT)(购自美国Gibco公司)。
(2)实验方法
MTT法测定细胞活性取对数期Nrf2-B10BR细胞，按I X 105/ml的细胞浓度接入 96孔板，每孔IOOul体积，不同浓度银杏叶提取物((^11101/1-16(^11101/1)，了8即(Oymol/ L-160ymol/L)处理Nrf2-B10BR细胞，置37°C、5%C02条件下培养24 h。结束前4 h加入 MTT液(5 mg/ml) 10 μ I/孔，4 h后弃上清液，加入二甲基亚砜100 yL/孔，微振荡10 min, 使结晶物充分溶解，置酶标仪于490 nm波长测吸光值。每处理设3个复孔，取三次独立重复实验的平均值进行SPSS统计学差异分析。
(3)实验结果
结果见图3，银杏叶提取物及TBHQ处理细胞后，对细胞活性有显著抑制作用，因此，选择对细胞活性开始有抑制作用的最小浓度用于后续实验，本实验结果中，20 μ mo I/L 银杏叶提取物和25ymol/L的TBHQ可以用于后续实验中。
(4)结论
银杏叶提取物和TBHQ作用于Nrf2-B10BR的浓度如下银杏叶提取物20 μ mol/L, TBHQ 25 μ mol/L。
实施例4 :蛋白免疫印迹检测不同处理的Nrf2_B10BR细胞中Flag_Nrf2核蛋白的表达
(I)实验材料
细胞株Nrf2_B10BR。
试剂耗材F12培养液，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，双抗(青霉素+链霉素)， 马血清(HS), 35mm培养皿(美国corning生物公司)；鼠抗Flag多克隆抗体(购于江苏碧云天生物技术研究所)，鼠抗his标签单克隆抗体(购于美国Abcam公司)；IRDye 680RD Goat anti Mouse IgG Highly cross adsorbed (700nm抗鼠)(购于美国基因生物公司)，仪器 licor odsessy双色红外线凝胶成像系统。
(2)实验方法
6孔细胞培养板中接种Nrf2-B10BR细胞培养24h后，分别用20 μ mol/L的银杏叶提取物，25 μ mol/L的TBHQ处理细胞24h后提取胞核蛋白，操作参照胞核蛋白提取说明书 (美国Thermo Scientific公司)。蛋白免疫印迹同实施例2。取三次独立重复实验的平均值进行SPSS统计学差异分析。
(3)实验结果
结果见图4，未处理组与其它2组药物处理组的BlOBR细胞核蛋白中均可见分子质量约110 000 Da的特异性蛋白条带，而且可检测到分子质量约32 000 Da的核内参蛋白。TBHQ与银杏叶提取物处理Nrf2-B10BR细胞后核蛋白Flag-Nrf2相对表达量较未处理组极显著增加(P〈0. 01)，而且TBHQ促进Nrf2的核转位能力极显著高于银杏叶提取物 (Ρ〈0· 01)。
(4)结论
以Nrf2-B10BR为目标细胞，TBHQ与银杏叶提取物均可极显著促进该细胞中Nrf2 的核转位表达。
而以已知不具有抗氧化作用的二甲基亚砜(DMSO)(处理浓度为20 μ mol/L)和无水乙醇(处理浓度为50 μ mol/L)按照前述步骤进行实验，结果显示其均不能促进该细胞中 Nrf2的核转位表达。
实施例5 :不同处理的Nrf2-B10BR细胞中NQOl蛋白和H0-1蛋白的表达
(I)实验材料
细胞株Nrf2_B10BR。
试剂耗材F12培养液，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰蛋白酶，双抗(青霉素+链霉素)， 马血清(HS)，35mm培养皿(美国corning生物公司)；鼠抗NQOl单克隆抗体，鼠抗HOl单克隆抗体，鼠抗β-Actin单克隆抗体(购于美国Abcam生物公司)，IRDye 680RD Goat anti Mouse IgG Highly cross adsorbed (700nm 抗鼠)(购于美国基因生物公司)，仪器licor odsessy双色红外线凝胶成像系统。
(2)实验方法
细胞处理同实施例4，提取总蛋白后，蛋白免疫印迹同实施例2。取三次独立重复实验的平均值进行SPSS统计学差异分析。
(3)实验结果
结果见图5，未处理组与其它2组药物处理组的B10BR细胞中均可见分子质量约31 000 Da的特异性蛋白条带(NQ01蛋白)和分子质量约35 000 Da的特异性蛋白条带 (NQ01蛋白)，以及分子质量约42 000 Da的内参蛋白β-Actin。与未处理组相比，银杏叶提取物可以极显著增强HOl蛋白的表达(P〈0. 01)，但对NQOl的表达无显著影响(P>0. 05)。 而TBHQ对于NQOl和HOl的表达均有极显著的促进作用(P〈0. 01)。
而以已知不具有抗氧化作用的二甲基亚砜(DMSO)(处理浓度为20 μ mol/L)和无水乙醇(处理浓度为50 μ mol/L)按照前述步骤进行实验，结果显示其均不能促进该细胞中 NQOl和HOl的表达。
(4)结论
以Nrf2-B10BR为目标细胞，TBHQ与银杏叶提取物均可极显著促进该细胞中Nrf2 调控的下游抗氧化因子NQOl和/或HOl的表达，表明TBHQ与银杏叶提取物具有抗氧化作用，二甲基亚砜(DMSO)和无水乙醇不具有抗氧化作用，Nrf2-B10BR可以作为抗氧化药物筛选细胞模型。
权利要求
1.源于BlOBR的Nrf2过表达黑素细胞株Nrf2_B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年9月25日，保藏编号 CCTCC No: C 2012124。
2.如权利要求I所述的黑素细胞株Nrf2-B10BR在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述黑素细胞株Nrf2-B10BR作为体外抗氧化药物筛选细胞模型用于白癜风抗氧化药物的筛选。
全文摘要
本发明提供了一种源于B10BR的Nrf2过表达黑素细胞株，及其在白癜风抗氧化药物筛选中的应用。本发明黑素细胞株Nrf2-B10BR，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2012年9月25日，保藏编号CCTCC No: C 2012124。本发明提供了一种新型黑素细胞Nrf2过表达细胞株Nrf2-B10BR，其起源于B10BR细胞，过表达Nrf2蛋白，这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究黑素细胞抗氧化机制，筛选和评估新型抗氧化药物等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
文档编号C12Q1/02GK102936581SQ201210400898
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者关翠萍, 许文, 洪为松 申请人:关翠萍, 许爱娥, 许文