一种反硝化菌的保藏方法
【专利摘要】本发明涉及一种反硝化菌的保藏方法，包括如下步骤：（1）将反硝化菌培养至生长稳定期，并收集菌体；（2）配制反硝化菌保藏营养液；（3）步骤（1）收集的反硝化菌体与步骤（2）配制的保藏营养液混合，含水率为40%～80%，含水率指反硝化菌保藏体系中水的重量含量；（4）低温冷冻保藏。与现有技术相比本发明方法适宜于大量反硝化菌的保藏，具有方法简单、存活率高、活性恢复快速、安全可靠等优点。
【专利说明】一种反硝化菌的保藏方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种菌体保藏方法，具体涉及一种简单有效的低温冷冻保藏反硝化菌的方法。
【背景技术】
[0002]氨氮是国家实现水污染控制总量控制的污染物，水体中氨氮含量过高会引起水质富营养化，导致水体中某些藻类过度繁殖，其它生物生长受到影响，从而破坏了水生生态系统，导致水质恶化并影响到其使用功能。生物脱氮技术以其环保高效无二次污染等优点是目前国内外脱氮技术研究应用的热点。生物脱氮是在好氧条件下通过硝化反应先将氨氮氧化为硝氮或亚硝氮，再通过缺氧条件下的反硝化反应将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去。由此可见，反硝化过程才是真正脱氮的步骤，而完成反硝化的高性能反硝化菌被选育出来后，如何能够长期有效的保藏至关重要。
[0003]微生物菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期应用于生产中。菌种保藏的基本原理主要是根据其生理生化特征，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便在生产上能推广使用。为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性研究选用适宜的保藏方法。菌种保藏方法很多，目前国内外常用的有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中定期移植法、液体石蜡法、沙土管 法、真空冷冻干燥法不适合大量菌种的保藏；超低温液氮冷冻法和超低温冰箱冷冻法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等，目的是防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐。完全玻璃化是低温保存的一种新方法，即在高浓度保护剂下，细胞连同保护剂于快速降温中都进入玻璃化状态，避免胞内冰晶形成，使器官和组织各部分都进入相同的状态，具有设备简单、程序简单和冻存效果好等优点。但是保护剂仅能保证菌体的存活率，对菌体活性是否有影响及影响的程度还不明确。
[0004]CN200810124325.5提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法:将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石腊后竖直存放入6~8°C的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。采用此方法可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。但是工序复杂繁琐，不适合大量菌体的保藏。
[0005]CN201010299763.2提供了一种冷冻保存红细胞的方法，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或N~乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，还原剂终浓度各为
0.5~300mM ;甘油的量以终体积比计为5%~10% ;乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为0.1~IOmM ;充分混匀并调节酸度值至6.5~8.0，将容器封口，静置I小时后在_40°C以下冷冻保存。以该方法冷冻保存的红细胞，一年后解冻，红细胞破碎率大于95%，血红蛋白无变性，未被氧化为高铁血红蛋白。此种方法适合细胞保藏法，不适合菌种活性的保藏。
[0006]CN200810190852.6涉及一种菌种保藏方法，包括:(I)将需要保藏的菌种接种到灭过菌的麸皮培养基中；培养基配方为50~60%麸皮、35~45%粉碎后的谷壳、I~2%硝酸钠、I~2%尿素、I~2%米粉、0.2~1%生物素营养添加剂，加入上述混合物相同重量的去离子水，混合均匀即可；(2)当菌丝长到需要的菌龄时，不需分离出菌丝制成菌悬液，直接将冻干液立即加入安瓿管中与培养物混合均匀；冻干液配方为10~20克脱脂牛奶、0.2~
0.5克琼脂粉、0.2~0.5克还原型谷胱甘肽、0.1~0.5克阿拉伯胶、0.5~I克叔丁醇，用去离子水定容到100毫升；(3)然后以2V /分钟的降温速率降温，冷冻干燥；(4)冻干后对盛菌的安瓿管抽真空，然后封口 ；以及(5)将所得到的管置入低温下保藏。该法采用真空冷冻干燥法保藏菌体，需要采用缓慢的降温程序将菌体冻干进而低温保藏，步骤繁琐，能耗较闻。
[0007]CN200610032334.2公开一种浸矿微生物嗜酸氧化亚铁硫杆菌深低温冷冻保藏过程中的保护剂。其配方组成为100G/L~150G/L甘油、80G/L~120G/L海藻糖、160G/L~200G/L蔗糖、40G/L~60G/L 二甲亚砜。该保护剂可以使冷冻嗜酸氧化亚铁硫杆菌的存活率最高达到89%，但该法需添加组合的保护剂，复杂的保护剂组成对菌体的活性的影响尚无法确定。
【发明内容】
`[0008]针对现有技术的不足，本发明提供一种反硝化菌的保藏方法，适宜于大量长期保存反硝化菌。本发明方法具有方法简单、存活率高、活性恢复快速、安全可靠等优点。
[0009]本发明反硝化菌的保藏方法，包括如下步骤:
(1)将反硝化菌培养至生长稳定期，并收集菌体；
(2)配制反硝化菌保藏营养液；
(3)步骤(1)收集的反硝化菌体与步骤(2)配制的保藏营养液混合，含水率为40%~80%，含水率指反硝化菌保藏体系中水的重量含量；
(4)低温冷冻保藏。
[0010]本发明步骤(1)的反硝化菌培养采用本领域常规的方法，如采用间歇式活性污泥法等。反硝化菌培养液可以采用人工配制的培养液，也可以采用废水对反硝化菌进行培养。反硝化菌培养液所含氮源为亚硝氮，亚硝氮浓度为200~800mg/L ;所含碳源为甘油，浓度以COD计为2000~5000mg/L ;还有少量Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金属离子以及磷酸根离子等。反硝化菌培养条件为:温度15~40°C,pH为7.0~8.5,搅拌转速10~50rpm,缺氧条件下培养3~10天至生长稳定期。反硝化菌培养至生长稳定期，此时是指菌体适宜保藏的生长期，通过沉降、过滤、离心等方法收集获得的反硝化菌体。反硝化菌培养的初始来源可以是任意的需要保藏的反硝化菌。[0011]本发明步骤(2)中，保藏营养液中含有的亚硝氮为NaNO2，同时含有微量物质FeSO4, KH2PO4, MgCl2和CaCl2。各种物质的用量按步骤(3)中所需的浓度确定。
[0012]本发明步骤(3)中，反硝化菌与保藏营养液混合后，甘油浓度以COD计为2~5g/L, NO2-~N 浓度为 0.2 ~0.8g/L, Fe2+ 浓度为 0.01 ~0.06g/L, K.浓度为 0.05 ~0.5g/L,Ca2+ 浓度为 0.01 ~0.lg/L, Mg2+ 浓度为 0.05 ~0.5g/L。
[0013]本发明步骤(4)中，低温冷冻保藏可以采用本领域常规的超低温冷冻设备。冷冻保藏温度为-20°C~-70°C。
[0014]本发明方法通过从菌体培养、含水率、营养液等方面进行综合优化考察，得到了最适宜的反硝化菌低温冷冻保藏方法。反硝化菌的培养碳源为甘油，甘油同时可以作为低温冷冻保藏的保护剂，不需要专门添加保护剂，反硝化菌对甘油具有适应性，不会影响菌体的活性。本发明方法可以延长菌种的保存时间，同时使菌种的活性保持相对稳定，菌体保藏后存活率高，活性恢复迅速，对于大量菌体保藏经济方便，为生产、试验节约成本。本发明方法简单，不需特殊设备，方便快捷，适合大量菌种保藏，存活率可以达到90%以上。
【具体实施方式】
[0015]本发明的一种具体实施过程如下:
Cl)利用适宜的培养液，在温度15~40°C，pH为7.0~8.5，搅拌转速10_50rpm，缺氧条件下将反硝化菌培养3~10天至生长稳定期，然后收集菌体。
[0016](2)菌悬液的含水率对于胞内外冰晶的形成有影响，进而影响保藏效果，因此需要适宜的含水率。菌体培养液的初始含水量较高，因此需要降低菌体含水率。
[0017](3)营养物质是菌体生存的必备条件，可使菌体在低温冰箱中保藏若干年，而不影响其活性，需要按照适宜的营养物质组成和浓度加入保藏所需的营养液。
[0018](4)低温冰箱冻存:低温冷冻温度是在_20°C至_70°C，保藏3~5年能力后，考察菌体的存活率和活性。
[0019]实施例1
配制亚硝氮浓度为200mg/L，甘油为碳源，浓度以COD计为2500mg/L的培养液，在IOL生物反应池中采用间歇式活性污泥法对反硝化菌进行培养，温度为27°C，pH为7.8，搅拌转速20rpm。当菌体进入稳定生产期后停止培养，沉降或离心后收集菌体。按照50%的含水率，将菌体与配制的营养液混合，于_50°C低温冰箱保藏。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过3d的恢复，菌体的活性可以完全恢复，存活率可达95%。
[0020]反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为:甘油浓度以COD计为 2.5g/L，NO2-~N 浓度为 0.2g/L，Fe2+ 浓度为 0.02g/L, K.浓度为 0.lg/L, Ca2+ 浓度为
0.05g/L, Mg2+ 浓度为 0.lg/L。
[0021]实施例2
配制亚硝氮浓度为600mg/L，甘油为碳源，浓度以COD计为4000mg/L的培养液，在IOL生物反应池中采用间歇式活性污泥法对反硝化菌进行培养，温度为30°C，pH为8.0，搅拌转速40rpm。当菌体进入稳定生长期后停止培养，沉降或离心后收集菌体。按照60%的含水率，将菌体与配制的营养液混合，于_60°C低温冰箱保藏。4年后取出考察菌体的活性和存活率，经过5d的恢复，菌体的活性可 完全恢复，存活率可达90%。[0022]反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为:甘油浓度以COD计为 4g/L,N<V ~N 浓度为 0.6g/L,Fe2+浓度为 0.02g/L,K+浓度为 0.lg/L,Ca2+浓度为 0.05g/L, Mg2+ 浓度为 0.lg/Lo
[0023]实施例3
配制亚硝氮浓度为400mg/L,甘油为碳源,浓度以COD计为3000mg/L的培养液中，在IOL生物反应池中采用间歇式活性污泥法对反硝化菌进行培养，温度为32°C，pH为8.0，搅拌转速30rpm。当菌体进入稳定生长期后停止培养,沉降或离心后收集菌体。按照70%的含水率，将菌体与营养液混合，于_70°C低温冰箱保藏。5年后取出考察菌体的活性和存活率，经过7d的恢复，菌体的活性可完全恢复，存活率可达92%。
[0024]反硝化菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为:甘油浓度以COD计为 3g/L，NO2-~N 浓度为 0.4g/L，Fe2+ 浓度为 0.02g/L, K+ 浓度为 0.lg/L，Ca2+ 浓度为 0.05g/L, Mg2+ 浓度为 0 .lg/Lo
【权利要求】
1.一种反硝化菌的保藏方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将反硝化菌培养至生长稳定期，并收集菌体； (2)配制反硝化菌保藏营养液； (3)步骤(1)收集的反硝化菌体与步骤(2)配制的保藏营养液混合，含水率为40%~80%，含水率指反硝化菌保藏体系中水的重量含量； (4)低温冷冻保藏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)的反硝化菌培养采用间歇式活性污泥法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)的反硝化菌培养液所含氮源为亚硝氮，亚硝氮浓度为200~800mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)的反硝化菌培养液所含碳源为甘油，浓度以COD计为2000~5000mg/L。
5.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:反硝化菌的培养温度为15~40°C, pH为7.0~8.5,搅拌转速10~50rpm,缺氧条件下培养3~10天至生长稳定期。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(1)的反硝化菌培养至生长稳定期后，通过沉降、过滤或离心方法收集获得反硝化菌体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)的保藏营养液中含有的亚硝氮为NaNO2,同时含有微量物质 FeSO4、KH2PO4、MgCl2 和 CaCl2。
8.根据权利要求1所述 的方法，其特征在于:步骤(3)的反硝化菌与保藏营养液混合后，甘油浓度以COD计为2~5g/L，NO2--N浓度为0.2~0.8g/L，Fe2+浓度为0.01~0.06g/L, K+ 浓度为 0.05 ~0.5g/L, Ca2+ 浓度为 0.01 ~0.1g/I, Mg2+ 浓度为 0.05 ~0.5g/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，低温冷冻保藏温度为-20°C~-70°C。
【文档编号】C12N1/04GK103773684SQ201210404038
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】孙丹凤, 高会杰, 张鹏, 李宝忠 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院