一种敞开式培养微藻的方法
【专利摘要】本发明公开了一种敞开式培养微藻的方法。该方法包括：（1）培养兼性厌氧细菌种子液；（2）培养自养微藻种子液；（3）将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液接入内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反应器内进行半混合培养，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个区域，厌氧细菌在膜分离装置下部区域进行发酵，微藻细胞在膜分离装置上部区域进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中，补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。该法具有提高自养微藻收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置，提高自养微藻规模化培养效率等优点。
【专利说明】一种敞开式培养微藻的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种敞开式培养微藻的方法，具体涉及一种敞开式半混合培养自养产油微藻和兼性厌氧细菌来获取高微藻细胞收获量，同时提高微藻细胞油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002]当今世界，石油资源的日益紧缺、油品供需矛盾的日渐突出，环境污染问题也更加突出，开发可替代资源成为必然。以微生物油脂等可再生资源为来源的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、环境友好、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为石化能源的替代品。
[0003]微藻是含油微生物之一，微藻富含不饱和脂肪酸、淀粉和蛋白质等营养成分(如螺旋藻等)，可用作能源、医药和食品等领域原料；通过条件调控，微藻细胞可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含量可占细胞干重的30%~60%。与传统生物燃料相t匕，藻类有含油量高、生长快、环境适应性强、占用耕地少、产品附加值高等优势。同时，藻类占海洋生物资源50%，因而开发时可利用海洋资源，节省陆地资源。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能和固定二氧化碳开发可再生资源最热门的研究领域。不仅具有巨大的市场潜力，而且具有突出的社会价值。
[0004]微藻细胞生长方式一般分为光自养和碳源异养两种，光自养即利用(302进行光合作用获得生物量累积，因而CO2的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解吸、排出的问题。CN200410020978.0及CN03128138.9均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧解析效果。碳源异养即利用有机碳源为底物替代自养过程中的CO2来进行微藻生物量的积累，该种培养方式虽然可以实现细胞`较快生长，但细胞内油脂积累水平较低。
[0005]利用其它非藻类微生物与微藻进行混合培养的研究也比较多，CN200910038908.0公开了一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，该方法在混合培养体系中使用芽孢杆菌对各微藻进行混合培养时发现，各微藻生长均衡，稳定性好，可避免混合培养体系中藻相的生物多样性单一，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势，因此该方法主要用于控制某种微藻在水体中的泛滥。CN200910038910.8公开了一种乳酸杆菌调控微藻混合培养及协同净化养殖排放水的方法，该方法通过乳酸杆菌的直接或间接作用，调控各种微藻的数量比例，使各藻生长均衡，稳定性好，通过菌、藻间的协同作用达到对养殖排放废水的去氮除磷的目的。上述现有技术是通过菌体来控制水体中藻的生长均衡，并不是促进藻的生长和微藻细胞中的油脂积累。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明提供一种敞开式培养微藻的方法。该法利用膜分离装置将自养产油微藻与兼性厌氧细菌在敞开式光生物反应器中进行半混合培养，具有提高自养微藻收获量，提高无机碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置，提高自养微藻规模化培养效率等优点；同时不影响兼性厌氧细菌的发酵过程，在收获含油微藻细胞的同时还可通过分离培养液中的厌氧发酵产品，实现细菌厌氧发酵生产化学品，是一种油脂与生物化学品同时生产的高效培养方法。
[0007]本发明敞开式培养微藻的方法，包括如下内容:
(1)培养兼性厌氧细菌种子液；
(2)培养自养微藻种子液；
(3)将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液接入内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反应器内进行半混合培养，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个区域，厌氧细菌在膜分离装置下部区域进行发酵，微藻细胞在膜分离装置上部区域进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中，补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。
[0008]本发明方法中，膜分离装置为陶瓷膜分离装置，膜孔直径为0.05 ~0.5 Pm。
[0009]本发明方法中，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个部分的体积比为1:1~5:1。
[0010]本发明方法中，所述的敞开式光生物反应器还包括布气装置，铺设在反应器下部区域的底部，分布的气体可以经过膜分离装置进入整个光生物反应器中。
[0011]本发明方法中，兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌等，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纤维素水解液等，兼性厌氧细菌的代谢产物，即兼性厌氧细菌发酵产物一般为1，3-丙二醇和/或有机酸等，不同的兼性厌氧细菌得到的发酵产物有所不同，根据兼性厌氧细菌的种类不同而有所不同。兼性厌氧细菌种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和兼性厌氧细菌，在适宜的条件下进行培养。
[0012]本发明方法中，自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、硅藻等，自养微藻种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用常规的气升式光生物反应器进行种子液培养。
[0013]本发明方法中，敞开式半混合培养过程中，兼性厌氧细菌种子液与微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。半混合培养的初始培养基采用兼性厌氧细菌所需的培养基，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素(如按SE培养基的组成添加相关物质)等。敞开式半混合培养过程以批次或连续等方式补充兼性厌氧细菌发酵过程所需有机碳源。
[0014]本发明方法中，敞开式半混合培养条件一般采用与兼性厌氧细菌发酵过程的条件相似的条件，如温度一般为20°C~37°C，pH值一般为6~9，优选为6.5~7.5等。
[0015]本发明方法对兼性厌氧细菌和微藻细胞进行敞开式半混合培养，兼性厌氧细菌与微藻细胞生长条件和所需碳源的不同，互相补充和促进。微藻细胞利用兼性厌氧细菌发酵后废弃碳源(CO2)为自身生长碳源，同时维持系统较平稳的渗透压条件(pH值)，通过补充有机碳源保证兼性厌氧细菌不断生长，而微藻通过光条件和厌氧细菌发酵产生的二氧化碳使微藻细胞不断生长，兼性厌氧细菌与微藻细胞通过膜分离装置隔离开，实现各自单独的生长空间。培养基组成则是实现共混与互通，从而实现兼性厌氧细菌与微藻细胞在敞开式光生物反应器中的半混合培养过程。选择适宜种类兼性厌氧细菌和适宜种类微藻细胞，通过控制兼性厌氧细菌和微藻细胞的培养过程，使两者形成稳定的半混合培养体系，并建立起不同细胞间共同利用环境营养条件而细胞间不互相干扰的生长关系，实现了含油微藻的高效生长过程，并提高了油脂的累积效果，提高了单一含油微藻培养过程中单位发酵体系内的油脂收获量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。同时对兼性厌氧细菌的发酵过程不存在影响，可以同时获得所需的发酵产物。微藻对发酵过程使用的碳源和发酵产物均具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累。与两种微生物同步混合培养过程相比，微藻生物质收获简单，避免与细菌细胞一起收获，而影响藻泥油脂提取部分的效能。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明一种具体工艺流程示意图。
[0017]其中:1-兼性厌氧细菌种子，2-微藻种子，3-兼性厌氧细菌种子液培养反应器，4-微藻种子液培养反应器，5-兼性厌氧细菌种子液接种管线，6-微藻种子液接种管线，7-膜分离装置，8-敞开式光生物反应器，9-混合培养基及酸碱中和剂进入管线，10-微藻生长区，11-兼性厌氧细菌生长区，12-布气装置，13-尾气出口。
【具体实施方式】
[0018]本发明敞开式培养微藻的方法，具体包括如下内容:半混合培养之前，两种微生物分别单独进行种子液培养，采用搅拌式生物反应器进行兼性厌氧细菌种子液培养，采用光生物反应器进行自养微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括兼性厌氧细菌、厌氧细菌发酵培养基，光生物反应器内包括微藻藻种和自养SE培养基。种子液培养合格后，分别经过各自的接种管线转移到培养兼性厌氧细菌的内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反应器的下部区域和培养微藻细胞的光生物反应器的上部区域，并加入经过无菌处理的混合培养基营养成分和酸碱中和剂调节至半混合培养所需生长条件。其中混合培养基中的有机碳源用于兼性厌氧细菌生长，而兼性厌氧细菌生长所产生的CO2用于微藻生长。兼性厌氧细菌种子液与微藻细胞种子液接种体积比例为1:1~1:10。接种后敞开式半混合培养体系通过正常PH控制、温度控制和通 气量等控制培养过程。其中半混合培养时有机碳源最优选采用流加方式进行，其被兼性厌氧细菌利用生长，兼性厌氧细菌发酵后产生较多的二氧化碳，排出细胞外进入培养系统中。由于兼性厌氧细菌排出的CO2处于溶解状态，因此可以立即通过膜孔隙传递到敞开式光生物反应器的上部区域被培养基系统中的微藻细胞利用，作为微藻细胞生长的碳源供应。
[0019]下面通过附图进一步说明本发明的详细工艺过程。如图1所示，兼性厌氧细菌种子I经兼性厌氧细菌种子液培养反应器3培养生长达生物量OD值为5.0~15.0 ;微藻种子2经微藻种子液培养反应器4培养生长达生物量OD值为2.0~10.0。将培养好的厌氧细菌种子液由接种管线5转接到内部铺设膜分离装置7的敞开式光生物反应器8的下部区域，即兼性厌氧细菌生长区11 ;将微藻细胞种子液由接种管线6转接到该光生物反应器8的上部区域，即微藻生长区10进行半混合培养；并将混合培养基及酸碱中和剂9加入光生物反应器中进行混合，同时经过检测分析混合后培养系统中PH值来调节混合培养液的pH至6.5~7.5。气体由布气装置12进入反应体系内，通入气体经兼性厌氧细菌生长区11到达微藻生长区10，从而实现向兼性厌氧细菌和敞开式光生物反应器内供气的需要，通入的气体统一由尾气出口 13排出整个反应体系。
[0020]本发明方法中，兼性厌氧细菌在有机碳源条件下实现快速生长，兼性厌氧细菌消耗有机碳源，生成细胞生物质和各种代谢产物，细胞生物质由于体形较大而被膜分离装置截留光生物反应器的下部区域，同时发酵产生CO2气体排出细胞外后经过膜孔隙传递到敞开式光生物反应器的上部区域，使培养体系内无机碳源含量增加，微藻细胞利用这些无机碳源进行光合作用，获得微藻细胞自身的生长。同时兼性厌氧细菌发酵使系统的PH值下降，而随着微藻细胞的生长，利用溶解的CO2，使系统的pH值上升，两者互为作用，调节系统的pH处于适应范围。
[0021]本发明方法中，敞开式光生物反应器可以是敞开池、板式等敞开式反应器，可以通入的氮气或含二氧化碳气体。光生物反应器的其它操作条件按常规的细菌和微藻培养条件控制。可以设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。同时提供PH电极检测，以便通过外源加入酸、碱来实现系统pH的控制。
[0022]本发明方法中，pH控制酸中和剂为HCl、H2SO4, HNO3等常用的无机酸，碱中和剂为NaOH, NaHC03> K0H、Ca (OH) 2、氨水等常用的无机碱。
[0023]本发明方法中，敞开式半混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
[0024]本发明方法中，敞开式半混合培养中，向铺设膜分离装置的光生物反应器的下部区域和上部区域内可以通入氮气或含二氧化碳的气体，气体通过下部区域后由膜空隙进入上部区域，进而引出整个反应器；通入气体量随敞开式半混合培养的培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培养系统装液体积比例为0.1vvm~1.0vvm(单位液体体积每分钟通入的单位气体量)。
[0025]本发明方法中，所用的敞开式光生物反应器内培养基为兼性厌氧细菌和微藻细胞所需的混合培养基，可以提供兼性厌氧细菌的发酵生长所需营养物质，也提供微藻细胞光合生长所需营养成份，两种细胞通过膜分离装置被分隔开来，实现单独生长，减弱不同细胞间生态影响，同时也为微藻细胞的收获提供了方便。兼性厌氧细菌利用其适宜的培养基，其中碳源为有机碳源，进行生长，获得生物量的增长，部分有机碳源通过发酵过程呼吸生成CO2，兼性厌氧细菌所生成的CO2在培养体系中作为微藻进行光合作用的碳源，从而获得微藻细胞的生长。
[0026]本发明方法中，兼性厌氧细菌细胞所需的有机碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等，该有机碳源的加入采用流加方式进行，根据培养液成样品成份分析，随时检测系统的有机碳源浓度水平，将配制好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
[0027]本发明方法中，敞开式半混合培养过程培养基的初始有机碳源浓度(以有机物质量浓度计，下同)为1.0%~5.0%，培养过程中通过厌氧细菌生长消耗，有机碳源经过补加泵进行不断补加，维持有机碳源浓度为1.0%~2.0%。
[0028]本发明方法中，兼性厌氧细菌种子液的培养基采用其适用的兼性厌氧细菌培养基，自养微藻种子液的培养基采用微藻SE培养基。半混合培养过程采用兼性厌氧细菌培养基和微藻培养基相结合，包括有机碳源、无机盐和微量兀素等成份，成为混合培养基。优选的培养条件为:种子液接种量(占光生物反应器体积，V/V):5%~20% ;温度:25°C~30°C ；通气量:0.1vvm ~1.0vvm,揽拌转速:IOOrpm ~400rpm,时间:24h ~120h。
[0029]方案I (比较例)将克雷伯氏菌(中国微生物菌种保藏中心CGMCC0798)在300mL摇瓶中进行培养，所用培养基为兼性厌氧细菌甘油培养基，培养20h后得到所需种子液，OD值为12.0左右。将培养的兼性厌氧细菌种子液接入本发明方法提到的内部铺设的陶瓷膜分离装置的20L光生物反应器的下部区域，膜孔直径为0.1y m，光生物反应器上下两个部分的体积比为1:1。底部铺设布气装置，可以实现培养液的返混。光生物反应器为玻璃体，反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。
[0030]兼性厌氧细菌为克雷伯氏肺炎杆菌，其培养基为甘油培养基。
[0031]甘油培养基配方(以每升计)=NH4Cl5.35 g, KCl 0.75 g, NaH2PO4 1.38 g, Na2SO40.28 g, MgCl2 ? 6H20 0.26 g, CaCl2 ? H2O 0.02 g，酵母提取物 1.0 g，甘油 40 g。
[0032]SE培养基配方(以每升计):
【权利要求】
1.一种敞开式培养微藻的方法，包括如下内容: (1)培养兼性厌氧细菌种子液； (2)培养自养微藻种子液； (3)将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液接入内部铺设膜分离装置的敞开式光生物反应器内进行半混合培养，膜分离装置将光生物反应器分成上下两个区域，厌氧细菌在膜分离装置下部区域进行发酵，微藻细胞在膜分离装置上部区域进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中，补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:膜分离装置为陶瓷膜分离装置，膜孔直径为 0.05 u m ~0.5 u m。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于:膜分离装置将光生物反应器分成上下两个部分的体积比为1:广5:1。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的敞开式光生物反应器还包括布气装置，铺设在反应器下部区域的底部，分布的气体可以经过膜分离装置进入整个光生物反应器中。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纤维素水解液。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌种子液培养采用搅拌式生物反应器，自养微藻种子液培养采用气升式光生物反应器。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻或娃藻。
8.按照权利要求1、5或7所述的方法，其特征在于:半混合培养过程中，兼性厌氧细菌种子液与微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养的初始培养基采用兼性厌氧细菌所需的培养基，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素。
10.按照权利要求1、5或9所述的方法，其特征在于:半混合培养过程以批次或连续方式补充兼性厌氧细菌发酵过程所需有机碳源。
11.按照权利要求9所述的方法，其特征在于:厌氧细菌培养基初始有机碳源浓度以有机物质量浓度计为1.0%~5.0%，半混合培养过程维持有机碳源浓度为1.0%~2.0%。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养的条件为温度20°C~37°C，pH值6~9。
【文档编号】C12R1/01GK103773693SQ201210404167
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】王领民, 金平, 廖莎, 吴丹, 李晓姝, 师文静, 张霖, 高大成, 乔凯, 程国香 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院