专利名称：一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
技术领域：
本发明提供一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。
背景技术：
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，也是目前核酸检测的主流技术，PCR产物的检测判定方法为琼脂糖凝胶电泳，而琼脂糖凝胶仅可区分相差约IOObp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且电泳时常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常接触对身体健康不利。蚊媒病是一组以蚊虫为媒介而传播的疾病，包括黄热病、登革热、流行性乙型脑炎、西尼罗热等，是重要的公共健康问题。随着全球气候逐渐上升、城市化进程的加快、旅游和贸易的快速发展、生态环境的不断变化，全球蚊媒传染病发病呈上升趋势，原有疾病的流行区域不断扩展、疾病的流行频度不断增加。随着疾病谱发生变化，相应的检测和监测技术要及时跟进，以适应新的疾病监测需求。检测及监测蚊虫携带的病原体，在传染病监测中属于早期监测和发现传染病流行的方法，对于蚊媒传播疾病的有效预警和控制有重要的意义。以往的研究都是针对一种病原体检测，且有些非诊断性检测方法灵敏度不够高，不能够早期发现蚊媒传染病的流行；此外，从生物学分类角度来看，蚊媒病原体涉及微生物学与寄生虫学专业，目前蚊媒病监测也是针对单病种，不同病原体分类专业人员分别从自身专业领域进行检测，浪费人力、财力，且各专业独力实施，不利于高效、综合采取防治措施。因而，对于蚊媒病的检测应当综合考虑。悬浮芯片(suspensionarray)也称液相芯片(liquid array, liquid chip),是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应，从而实现对核酸的多重检测。但传统的悬浮芯片的非诊断性检测方法耗时长，步骤繁琐，在多重检测中，由于多重探针的存在，杂交温度的选择也是一个技术开发时的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性好的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。为实现上述目的，本发明一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为
I)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测弓丨物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；2)PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
3)微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
4)加入链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列为
权利要求
1.一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，其特征在于，该方法具体为1)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；2)PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；3)微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；4)加入链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；其中，所涉及的引物序列为2
2.如权利要求I所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
3.如权利要求I所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37°C进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
4.一种改进的针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤I) PCR检测弓I物标记Tag和生物素，2 ) PCR扩增待检样品；3 )加入相应的微球与PCR产物杂交；4)上机对杂交后的微球进行检测；其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’标记不同的Tag，引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’进行生物素标记，以便检测。
5.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述非诊断性检测方法涉及的引物序列为
6.如权利要求5所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
7.如权利要求5所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为37°C进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
全文摘要
本发明提供一种蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，还涉及对悬浮芯片非诊断性检测方法中反应条件及步骤的改进。本方法中的芯片主要由带有标签微球、带有标签及生物素化的引物、链霉亲和素－藻红蛋白组成。本发明主要针对野外采集的蚊虫综合检测多种携带的病原体,如黄病毒属病毒、甲病毒属病毒等。将野外采集蚊虫样本同批次处理后高通量检测，经济、高效检测蚊传病原体，可为卫生防病部门提供简化的检测、监测步骤和程序，提高效率和减少重复工作量。
文档编号C12Q1/70GK102943128SQ201210420139
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者王静, 王旺, 杨宇, 刘丽娟, 赵婷婷, 韩辉, 孙肖红 申请人:中国检验检疫科学研究院