专利名称：一种体细胞核移植中的电融合方法
技术领域：
本发明涉及细胞核融合方法，具体涉及一种体细胞核移植中的电融合方法。
背景技术：
细胞核移植(nuelea rtransfer 或 nuelear transplantation)技术也即广为人知的动物克隆技术。通常是通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核注入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体(即重构卵)，移入的核在受体胞质的作用下，发生发育程序重编Oteprogramming)，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体(张运海，2005)，其获得的个体与亲本具有相同遗传性状。将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，这个过程称之为融合。最早使用的融合方法是使用灭活的仙台病毒(HVJ) (McGrath and Solter, 1983)介导细胞融合融合,获得了成功，但是效果很不稳定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的是直流电介导融合的方法，简便而且高效，电融合技术也是从这个时候开始发展起来的，其原理是通过电流的刺激使紧密接触的细胞膜磷脂双分子层发生结构改变，进而形成细胞间的孔道，随着孔道逐渐扩大使胞质交融在一起。目前已经成为动物克隆中普遍采用的融合方法。然而，由于技术操作上的差异和供体细胞类型等因素的影响导致融合率不稳定，是影响克隆效率的重要因素。在现有技术中普遍的操作是重构卵放入融合槽内后，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行后即施加不同参数的的直流电脉冲诱导融合，而没有考虑体细胞朝向正极或负极对融合效率的影响，从而使融合效率很不稳定。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种融合效率高的电融合方法。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案，一种体细胞核移植中的电融合方法，包括以下步骤SI、将恢复后的重构卵分批转移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗涤重构卵；S3、将洗涤后的重构卵放入装有融合液的融合槽内，调整供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行并使供体细胞一端朝向电极的负极，用融合仪施加直流电脉冲诱导融合同时激活重构卵；S4、将融合激活后的重构卵用胚胎培养液洗涤，然后转入培养箱中，在矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中融合；该方法在融合的过程中，将供体细胞一端朝向电极的负极，提高了融合效率。所述融合激活液中含有含有浓度为O. 2 W O. 5mmol/L甘露醇、浓度为O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、浓度为 0· 05 …O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、浓度为0. 5 ^ 2mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、浓度为O. 01%聚乙烯醇(W/V)。所述步骤SI中平衡的时间为1-5分钟。所述步骤SI中每批放入装有融合液的融合槽内的重构卵的数量为5-8个。所述步骤S3中融合激活参数电场强度为80-100v/mm，脉冲时间为80-100 μ S，实施2-3次电脉冲。
所述步骤S4中培养箱内的温度为38. 5°〇或39°〇。所述步骤S4中培养箱内的C02的饱和度为5%。本发明的有益效果，采用本融合方法能显著提高融合效率。
具体实施例方式将供体细胞的细胞核注入到去核的卵母细胞以后形成重构卵，因为这个过程对卵母细胞是一个伤害的过程，需放置于培养箱内，待卵母细胞胞质恢复30min后利于后面的融合操作，即恢复过程。每批将5-8个恢复后的重构卵转移到融合液中平衡2min，当换一种液体时，都需预先放入相应的液体中，相当于一个适应的过程，即平衡。用融合激活液洗涤3遍，再将洗涤后的重构卵放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行同时使供体细胞一端都朝向电极的负极，用BLS-150B融合仪(匈牙利)施加不同融合参数的的直流电脉冲诱导融合同时激活，其中融合激活参数为电场强度为80-100v/mm，电脉冲时间为80-100 μ s，实施2-3次电脉冲。接着将重构卵用培养液洗涤3遍，立即将洗涤后的重构卵转入矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中，放置入38. 5°C或39°C，5%C02饱和度的培养箱中培养，4h后在体视显微镜下判定融合。其中融合激活液中含有含有浓度为O. 2 ^ O. 5mmol/L 的甘露醇(Mannitol )、浓度为 O. 05 ^ O. 2mmol/L 的 CaCl2 · 2H20、浓度为O. 05 O. 2mmol/L 的Mg Cl2 ·6Η20、浓度为 O. 5 …2mmol/L 的 4-轻乙基喊嚷乙横酸(HEPES)、浓度为O. 01% (W/V)的聚乙烯醇(PVA)。经多次试验，得到如表I的结果表I、融合时体细胞朝向对核移植效率的影响
权利要求
1.一种体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，包括以下步骤 51、将恢复好的重构卵分批转移到融合激活液中平衡； 52、用融合激活液洗涤重构卵； 53、将洗涤后的重构卵放入装有融合激活液的融合槽内，调整供体细胞-受体卵细胞膜接触面使之与电极平行并使供体细胞一端都朝向电极的负极，用融合仪施加直流电脉冲诱导融合同时激活重构卵； 54、将融合激活后的重构卵用胚胎培养液洗涤，然后转入培养箱中，在矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中融合。
2.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述融合激活液中含有含有浓度为O. 2 μ O. 5mmol/L甘露醇、浓度为O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、浓度为O. 05 ^ O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、浓度为O. 5 ^ 2mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、浓度为O. 01%聚乙烯醇(W/V)。
3.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述步骤SI中平衡的时间为1-5分钟。
4.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述步骤SI中每批移入融合液平衡的重构卵的数量为5-8个。
5.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述步骤S3中融合激活参数电场强度为80-100v/mm，脉冲时间为80-100 μ S，实施2_3次电脉冲。
6.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述步骤S4中培养箱内的温度为38. 5°〇或39°〇。
7.根据权利要求I所述的体细胞核移植中的电融合方法，其特征在于，所述步骤S4中培养箱内的C02的饱和度为5%。
全文摘要
本发明公开了一种体细胞核移植中的电融合方法，包括以下步骤S1、将恢复后的重构卵分批转移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗涤重构卵；S3、将洗涤后的重构卵放入装有融合液的融合槽内，调整供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行并使供体细胞一端朝向电极的负极，用融合仪施加直流电脉冲诱导融合同时激活重构卵；S4、将融合激活后的重构卵用胚胎培养液洗涤，然后转入培养箱中，在矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中融合；该方法在融合的过程中，将供体细胞一端朝向电极的负极，提高了融合效率。
文档编号C12N15/873GK102876719SQ20121041970
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月27日 优先权日2012年10月27日
发明者吴珍芳, 周荣, 石俊松 申请人:广东温氏食品集团有限公司