专利名称：酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，配合料的制作方法
酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，配合料技术领域
本发明属于饲料领域，特别涉及一种酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，预混料。
背景技术：
益生菌(Probiotics)是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主(人和动物)健康水平和健康佳态的活菌制剂及其代谢产物。
酵母菌作为一类已被人熟知的益生菌广泛用于食品、制药、饲料领域。本发明所涉及的酿酒酵母菌(Saccharmyces cerevisiae)属于酵母属(Saccharomyces)，酿酒酵母广泛用于制作面包、馒头和酿酒。有些酿酒酵母如布拉氏酵母用于治疗成人或儿童感染性或非特异性腹泻。无论在体外或体内，该菌具有抗菌(包括白色念珠菌)作用。当在动物中诱发实验性感染时，它可促进动物体内的免疫作用。它能合成维生素B，如维生素BI，维生素B2， 维生素B6，泛酸，烟酸。此外，还能显著增加人与动物上皮细胞刷状缘内的二糖酶。酿酒酵母属于农业部公布允许使用的饲用微生物菌种之一。
腹泻是幼龄动物生长发育期间常发的一种疾病，分为营养性腹泻、细菌性腹泻和病毒性腹泻。使用抗生素治疗后，易产生抗药性和药物残留，且腹泻后肠道粘膜受损，从而影响营养物质的消化吸收，因此造成畜禽生长速度放缓，进而加大养殖成本。
目前市场上的微生物饲料添加剂种类繁多，但存在菌种活力不够，在饲料加工过程中活菌数降低，饲喂动物后无法起到益生作用等问题，功能性微生物饲料产品亟待开发。发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，预混料。
首先，本发明提供一种酿酒酵母新菌株。本发明提供的新菌株分离自新鲜荔枝皮中，经鉴定为酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae),命名为Kl,并于2012年09年11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 6560。
其次，本发明还提供含有所述菌株的冻干菌粉。优选的，该菌粉活菌数不低于I.OxIO10CFU/ 克。
进一步地，本发明还提供含有所述冻干菌粉的饲料添加剂。
在本发明另一个实施方案中，所述的饲料添加剂还含有稀释载体，所述稀释载体为玉米面、红糖、麦芽糊精中的一种或几种。
进一步地，本发明还提供所述饲料添加剂的制备方法，其包括制备所述酿酒酵母 Kl菌泥，菌泥与冻干保护剂混合后冷冻干燥制备成冻干菌粉。
在一个优选的实施方案中，所述饲料添加剂的制备方法还可包括将制备的菌粉用稀释载体进行稀释，稀释后，酿酒酵母Kl的活菌数不低于I. OX IO8CFU/克。
其中，所用的稀释载体为70-100%的玉米粉或麦芽糊精和0-30%的红糖。
其中，所述的冻干保护剂为4-6% (质量体积比)的蔗糖、O. 8-1. 2% (质量体积比)Vc 和O. 8-1. 2% (质量体积比)海藻糖水溶液以及10-20%菌泥重量的脱脂奶粉。
进一步地，本发明还提供含有所述饲料添加剂的配合料，所述配合料中所述饲料添加剂的比例为1飞％。。
本发明提供的酿酒酵母Kl与现有的酿酒酵母相比，对猪肠道常见的革兰氏阴性和阳性细菌均有抑制作用，因此具有意料不到的技术效果。且这种酵母易培养，发酵、处理后活菌数较高，是一株值得开发的新型益生菌株。
用添加本发明的畜禽饲料添加剂的日粮饲喂畜禽，特别是幼龄畜禽，腹泻发生率较低，进而其死淘率降低，提高料肉比，生产性能有较大的提高，为畜禽以后的生长打下良好的生长基础。
本发明的酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)Kl,于2012年09年11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6560。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例I酿酒酵母菌的分离鉴定
分离培养基I :1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，IOOml蒸馏水。12rC，15min灭菌。
分离培养基2 :1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2. 5%琼脂，IOOml蒸馏水。121。。， 15min灭菌，制备平皿备用。
无菌操作下，用接种环挑取新鲜荔枝皮放入分离培养基I中，30°C，ISOrpm，培养 36h。
无菌操作下，用接种环挑取培养36小时的培养液，在分离培养基2的平皿上划线， 共制备3个平皿。30°C，培养36h。选择单菌落呈米白色、隆起、表面光滑、近圆形，再进行平皿划线，30°C，培养36h。按以上步骤，平皿划线3次，分得的单菌落进行编号。
26sDNA提取用无菌牙签挑取带编号的单菌落，放入微量离心管管底，加 100μ IddH2O,开水煮8 10min，取出迅速放入_80°C冰箱冷冻lmin，重复上述步骤，再用开水煮 8 lOmin，12000rpm 离心 lmin,加入 PCR 反应体系50μ lPCRmix、2. 5μ INLl 引物、2.5 μ 1NL4引物、10 μ I菌液、35 μ lddH20。使用伯乐PCR仪，条件设计94°C预变性，5min，I 个循环;951变性455，601退火455，721延伸lmin，30个循环;72°C延伸lOmin，I个循环； 4°C无限。使用上海生工DNADL2000 Marker, PCR扩增产物电泳，选择在650bp出现清晰条带的样品，送上海英骏生物技术有限公司测序。
将序列与NCBI的核酸序列进行比对，其中有一株菌株的序列(SEQ ID No. 3)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)有99%的同源性,确定其为一株酿酒酵母菌，命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Kl。
NLl :5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’
NL4 :5’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’
实施例2酿酒酵母Kl抑菌功能试验
过夜培养的致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，沙门氏菌菌液用平板计数法计数。分别在4管5ml的大肠杆菌K88、K99、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中加入5ml酿酒酵母Kl菌液。另取未接入酿酒酵母菌液的大肠杆菌K88、K99、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作对照。30°C培养8h，平板菌落计数法计算加酿酒酵母Kl菌液的大肠杆菌K88、K99、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的活菌数以及未加酿酒酵母Kl这四种致病菌的活菌数。经计算， 残存的致病性大肠杆菌K88、K99、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的活菌数为24. 7%,30. 2%,25.6% 和 31. 8%ο
实施例3酿酒酵母菌Kl冻干菌粉的制备
配制种子培养基1. 0%酵母浸粉，2. 0%蛋白胨，2. 0%葡萄糖，IOOml蒸馏水。121°C, 15min灭菌。从培养好的酿酒酵母Kl斜面上挑取一环接入到种子培养基中。培养条件 28°C, 180rpm,36ho
酿酒酵母发酵培养基1. 5%酪蛋白胨，2. 5%酵母浸粉，3. 0%葡萄糖，O. 24%磷酸二氢钾，I. 6%磷酸氢二钾，加入蒸馏水。12rC，15min灭菌。按5%接种量接入种子培养基。培养条件28°C,150rpm,72ho
所得发酵液用高速冷冻离心机离心，离心条件6000rpm，4°C，lOmin。离心后弃上清液，得菌泥。配制5%蔗糖、l%Vc和1%海藻糖保护剂，按菌泥重量的2倍稀释搅拌菌泥，再加入10%进口脱脂奶粉混匀。先置于-80°C超低温冰箱冷冻，再置于真空冷冻干燥机干燥 24h，取出粉碎，过60目筛，得冻干菌粉。
取冻干后的菌粉O. 5g，在无菌条件下放入装有4. 5ml无菌水的试管，震荡，混匀， 取O. 5ml菌液再放入装有4. 5ml无菌水的试管，震荡，混匀，以此类推，将菌液稀释至10_8 后，取10_8、10_7、10_6浓度菌液各200 μ I涂平皿，每个浓度涂两个平皿，使用商业麦芽汁琼脂平皿，培养、计数。活菌计数活菌数约I. OX 101(lCFU/g。
实施例4断奶仔猪活性酿酒酵母饲料添加剂的制备
实施例3中所得酿酒酵母冻干菌粉用玉米粉(过40目筛)，红糖(食品级)按70% 30%稀释，使最终活菌数达到I. O X 109CFU/g。
配制I吨断奶仔猪配合饲料玉米521公斤，饼干粉150公斤，大豆柏250公斤，豆油5公斤，鱼粉40公斤，磷酸氢钙15公斤，石粉6公斤，食盐3. 5公斤，赖氨酸3. 5公斤，大北农预混料5公斤，活性酿酒酵母饲料添加剂I公斤。共计1000公斤。
实施例5断奶仔猪活性酿酒酵母饲料添加剂的制备
实施例3中所得酿酒酵母冻干菌粉用玉米粉(过40目筛)，红糖(食品级)按70% 30%稀释，使最终活菌数达到I. O X 109CFU/g。
配制I吨断奶仔猪配合饲料玉米517公斤，饼干粉150公斤，大豆柏250公斤，豆油5公斤，鱼粉40公斤，磷酸氢钙15公斤，石粉6公斤，食盐3. 5公斤，赖氨酸3. 5公斤，大北农预混料5公斤，活性酿酒酵母饲料添加剂5公斤。共计1000公斤。
实施例6肉仔鸡活性酿酒酵母饲料添加剂的制备
实施例3中所得酿酒酵母冻干菌粉用玉米粉(过40目筛)，红糖(食品级)按70% 30%稀释，使最终活菌数达到I. O X 109CFU/g。
配制I吨(Γ3周龄肉仔鸡配合饲料玉米600公斤，大豆柏318公斤，鱼粉20公5斤，玉米蛋白粉20公斤，大豆油10公斤，磷酸氢钙5公斤，食盐3. 6公斤，石粉14公斤，氯化胆碱I公斤，蛋氨酸2. 4公斤，5%。肉仔鸡预混料5公斤，活性酿酒酵母饲料添加剂I公斤。共计1000公斤。
实施例7肉仔鸡活性酿酒酵母饲料添加剂的制备
实施例3中所得酿酒酵母冻干菌粉用玉米粉(过40目筛)，红糖(食品级)按70% 30%稀释，使最终活菌数达到I. O X 109CFU/g。
配制I吨0 3周龄肉仔鸡配合饲料玉米596公斤，大豆柏318公斤，鱼粉20公斤，玉米蛋白粉20公斤，大豆油10公斤，磷酸氢钙5公斤，食盐3. 6公斤，石粉14公斤，氯化胆碱I公斤，蛋氨酸2. 4公斤，5%。肉仔鸡预混料5公斤，活性酿酒酵母饲料添加剂5公斤。共计1000公斤。
试验例I
试验动物
28日龄断奶仔猪，根据窝源、体重、性别随机分为3个处理，每个处理5个重复，每个重复8头猪，公母比例均衡。一共需要120头仔猪。
试验规程
试验从仔猪断奶时即28日龄时开始，一共进行35天，63日龄时结束。处理一、二分别使用实施例4、5日粮，处理三使用普通日粮。
仔猪的饲喂、管理、药物治疗按猪场规定程序进行。
试验开始、结束时称量仔猪体重，早晨空腹进行，试验结束前12小时将仔猪饲槽清理干净，仔猪饥饿12小时后进行称重。
整个试验过程中观察仔猪的健康状况，记录死、淘仔猪以及腹泻、用药情况。
腹泻率(％)=试验期腹泻仔猪头次/ (试验仔猪头数X试验天数)X 100%
平均日增重(ADG)=(试验结束窝重_试验开始窝重)/试验猪头数/试验天数
平均日耗料(ADFI)=消耗饲料/试验猪头数/试验天数
料肉比(F/G)=ADFI/ADG
死淘率(％)=淘汰猪头数/试验猪头数X 100%
试验结果
表I仔猪35天生产性能统计表
权利要求
1.一种酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)新菌株Kl,其保藏号为 CGMCC No. 6560。
2.含有权利要求I所述菌株的冻干菌粉。
3.如权利要求2所述的冻干菌粉，其特征在于，活菌数不低于I.OX IOltlCFU/克。
4.含有权利要求2或3所述的冻干菌粉的饲料添加剂。
5.如权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，还含有稀释载体，所述稀释载体为玉米面、红糖、麦芽糊精中的一种或几种。
6.权利要求4或5所述的饲料添加剂的制备方法，其包括制备所述酿酒酵母Kl菌泥，菌泥与冻干保护剂混合后冷冻干燥制备成冻干菌粉。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括将制备的菌粉用稀释载体进行稀释，稀释后，酿酒酵母Kl的活菌数不低于I. OXlO8CFU/克。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所用的稀释载体为70-100%的玉米粉或麦芽糊精和0-30%的红糖。
9.如权利要求61任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为4-6%的蔗糖、O. 8-1. 2%Vc和O. 8-1. 2%海藻糖水溶液以及10-20%菌泥重量的脱脂奶粉。
10.含有权利要求4或5所述的饲料添加剂的配合料，其特征在于，所述配合料中所述饲料添加剂的比例为1飞％。。
全文摘要
本发明公开了一种酿酒酵母新菌株，及含有其的饲料添加剂，预混料。本发明提供的酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)新菌株K1，其保藏号为CGMCC No.6560。本发明还提供还有所述菌株的畜禽饲料添加剂。用添加本发明的畜禽饲料添加剂的日粮饲喂畜禽，特别是幼龄畜禽，腹泻发生率较低，进而其死淘率降低，生产性能有较大的提高，为畜禽以后的生长打下良好的生长基础。
文档编号C12R1/865GK102925374SQ20121043009
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者闫轶洁, 宋维平, 胡婷, 贠桂玲, 李曼, 韩科厅 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 漳州大北农农牧科技有限公司, 吉林大北农农牧科技有限责任公司