专利名称：郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体涉及一种郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因和探针。
背景技术：
花的颜色是决定花商品价值和观赏价值的重要因素之一。改变花色，创新花色，可以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵的颜色是花瓣细胞中花色素积累的结果，花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素以及甜菜碱类。类黄酮作为花色素的一大类，使花朵产生从黄到紫的颜色。类黄酮的生物合成途径为可分为三个阶段，第一阶段是由苯丙氨酸到香豆酰CoA，这是许多次生代谢共有的；第二阶段由香豆酰CoA到二氢黄酮醇，这是类黄酮代谢的 关键反应，它合成花青素和其它黄酮物质。所有类黄酮合成的前体物都是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶(Chalcone synthase CHS)的作用下产生查尔酮开始的。第三阶段是各种花色素苷的合成。由于CHS是合成黄烷酮、黄酮、黄酮醇及花色苷所必需的酶，因此被认为是类黄酮生物合成途径的一个关键酶，为多基因家族编码。不同CHS基因功能上存在明显差异，在不同品系中的时空表达特点也不同。利用基因工程技术对CHS基因的表达进行调控是改变花朵颜色的途径之一。如小分子RNA干扰沉默CHS基因的表达可使花色素合成被打断，从而使花色变淡，甚至变成白色；将CHS的cDNA反向连接于35S启动子上，再连接双元载体转化矮牵牛会使花色同紫红色变为粉红色并来有白色，有些花朵完全呈白色；将菊花CHS基因正义导入菊花栽培品种之后产生了白色花和图案各异的彩瓣花；从三色龙胆中克隆得到的CHS基因启动子可在矮牵牛的花瓣唇部特异性表达；将CHS反义基因转入蓝猪耳中得到了具有彩色波浪边缘的花朵等等。目前，在很多植物中发现了CHS多基因家族，如矮牵牛、葡萄、甘薯、拟南芥、角堇等。但对于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana), CHS基因的克隆、表达模式及CHS蛋白编码序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香CHS蛋白及其编码基因相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于填补郁金香CHS基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香CHS蛋白及其编码基因的空白，提供了一种郁金香CHS蛋白TfCHS，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针。本发明提供了郁金香TfCHS蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式，为今后利用基因工程技术对TfCHS基因的时空表达特性进行调控，从而改变花色、创新花色提供了理论依据，具有很大的应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的，—方面，本发明提供了一种具有郁金香查尔酮合成酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差
巳优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列经过I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20个以内氨基酸而得到的序列。进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中I 10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。另一方面，本发明还提供一种编码上述蛋白质的核酸序列。优选的，所述核酸序列具体为
(a)碱基序列如SEQ ID NO. 3第I 1179位所示；或(b)与SEQ ID NO. 3第I 1179位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能与SEQ ID NO. 3第I 1179位所示的核酸进行杂交的序列。优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO. 3第I 1179位所示的核酸序列中I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的序列。此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8 100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香TfCHS相关的核酸分子。在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。在本发明中，术语“TfCHS蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfCHS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示序列中第I 1179位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID NO. 3所示序列的第I 1179位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 3所示序列中第I 1179位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3所示序列中从核苷酸第I 1179位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfCHS相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。在本发明中，术语“ TfCHS蛋白”指具有郁金香TfCHS蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfCHS相关相同功能的、SEQ ID NO. 4所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfCHS蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的郁金香TfCHS蛋白的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfCHS相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfCHS蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“郁金香TfCHS保守性变异多肽”指与SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行替换而产生。表I
权利要求
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求I所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID NO. 4所示氨基酸序列经过I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID NO. 4所示氨基酸序列中I 10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求I所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为 Ca)碱基序列如SEQ ID NO. 3第I 1179位所示； 或(b)与SEQ ID NO. 3第I 1179位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID NO. 3第I 1179位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID NO. 3第I 1179位所示的核酸序列中I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在Y和/或:V端添加60个以内核苷酸形成的序列。
7.一种用于检测如权利要求4所述核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有所述核酸序列8 100个连续核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及一种郁金香查尔酮合成酶TfCHS蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香查尔酮合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为今后利用基因工程技术调控郁金香TfCHS基因的时空表达特性，从而改变花色、创新花色提供了理论依据，具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/54GK102965352SQ20121042958
公开日2013年3月13日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红 申请人:上海交通大学