专利名称：郁金香黄烷酮-3-羟化酶TfF3H蛋白及其编码基因和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体是一种郁金香黄烷酮-3-羟化酶TfF3H蛋白及其编码基因和探针。
背景技术：
花的颜色是影响植物传粉的重要因素，同时也决定一种花卉的商品价值和观赏价值。改变花色，创造新花色，可以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵颜色是花瓣细胞中积累花色素的结果。类黄酮是花色素的一大类，它使花朵产生从黄到紫的全部颜色。在类黄酮的合成途径中，黄烷酮-3-羟化酶(F3H)是紧接查尔酮合成酶(CHS)，查尔酮异构酶(CHI)的第三个酶。它催化黄烷酮在C3位置羟基化形成无色的黄烷酮醇，也能够催化圣草酚、柚皮素、5羟基双氢黄酮等在3'位置的羟基化，生成二氢黄酮醇。由于二氢黄酮醇是黄酮醇和花色素的共同前体，因此，F3H是位于类黄酮合成通路分支点处的关键酶。
·
F3H在决定种皮和花的颜色中具有重要作用。拟南芥中F3H的突变会导致种皮中色素的减少，叶和茎等器官中的的花色素减少，从而使种皮颜色变为灰白色。抑制F3H基因的表达也可以直接阻碍类黄酮的合成。用反义RNA技术阻止F3H基因在一种同时缺乏二氢黄酮醇3'-羟化酶(F3, H)和二氢黄酮醇3'，5'-羟化酶(F3, 5' H)的康乃馨突变株中的表达时，得到了一系列颜色由原本橘色逐渐衰减至无色的转基因植株；矮牵牛花中通过反义抑制F3H的表达，使花颜色由原来的橙色/微红色减弱甚至完全失去。目前，很多植物中的F3H基因已被分离鉴定，如大麦、苹果、紫花苜蓿、玉米、拟南芥等，但对于球根花丼郁金香(Tulipa fosteriana),F3H基因的克隆、表达模式及F3H蛋白编码序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香F3H蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于填补郁金香F3H基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香F3H蛋白及其编码基因序列的空白，提供了一种郁金香Tf F3H蛋白，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针。本发明提供了郁金香TfF3H蛋白及其编码基因序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式，为今后利用基因工程技术对TfF3H基因的时空表达特性进行调控，从而改变花色，创新花色提供了理论依据，具有重大的应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的，—方面，本发明提供了具有郁金香黄烷酮-3-羟化酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄烷酮-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列经过I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20个以内氨基酸而得到的序列。进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中I 10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。优选的，所述核酸序列具体为(a)碱基序列如SEQ ID NO. 3第I 1101位所示；或(b)与SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能与SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸进行杂交的序列。
优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸序列中I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的序列。此外，本发明提供了一种用于检测上述核酸序列的探针，所述探针为包含有所述核酸序列8 100个连续核苷酸的核酸分子。该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香F3H相关的核酸分子。在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。在本发明中，术语“TfF3H蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfF3H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所不序列的第I 1101位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 3所示序列中第I 1101位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ IDN0. 4所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3所示序列中从核苷酸第I 1101位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfF3H相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。在本发明中，术语“ TfF3H蛋白”指具有郁金香TfF3H蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的蛋白质。该术语还包括具有与天然郁金香TfF3H相关相同功能的、SEQ ID NO. 4所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)通常为I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfF3H蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的郁金香TfF3H多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfF3H相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfF3H多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“郁金香TfF3H保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行替换而产生。表I
权利要求
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质(a)由如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQID NO. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄烷酮-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID NO. 4所示氨基酸序列经过I 50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I 20 个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID NO. 4所示氨基酸序列中I 10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为Ca)碱基序列如SEQ ID NO. 3第I 1101位所示；或(b)与SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能与SEQ ID NO. 3第I 1101位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID NO. 3第I 1101位所示的核酸序列中I 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在Y和/或:V 端添加60个以内核苷酸形成的序列。
7.一种用于检测如权利要求4所述核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有所述核酸序列8 100个连续核苷酸的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及一种郁金香黄烷酮-3-羟化酶TfF3H蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄烷酮-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术对郁金香TfF3H基因的时空表达特性进行调控，从而改变花色、创新花色提供了理论依据，具有重大的应用价值。
文档编号C12N15/11GK102994463SQ20121042845
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红 申请人:上海交通大学