专利名称：一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法
技术领域：
本发明涉及一种窖泥微生物群落的分析方法，尤其是浓香型白酒窖泥古菌群落及多样性特征的分析方法。
背景技术：
随着分子生物学技术的快速发展，以PCR技术为核心的现代分子生物学免培法被广泛应用于环境微生物群落及多样性特征的评价。高质量、高纯度基因组DNA的提取是成功进行PCR扩增及环境微生物群落特征解析的首要前提。然而，由于微生物细胞结构的复杂性及采样环境的特殊性，提取的粗DNA往往含量低、纯度低。研究表明，腐殖质及其类似物对环境基因组DNA的污染及提取过程微生物细胞破壁是否充分均是影响DNA质量的关键因素。目前已有诸多关于底泥、土壤、沉积物、活性污泥等基因组DNA提取过程去除腐殖质及细胞破壁处理的相关报道。有如专利申请号为201010183580. 4记载了一种池塘底 泥样品高纯度总DNA的提取方法，具体涉及样品总DNA提取前采用EDTA及PBS缓冲液对池塘底泥进行预处理，并将提取的粗DNA过柱纯化。有如专利申请号为201110089153. 4公布了一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于结合了 TENP、PBS缓冲液进行预处理及细胞破壁过程的反复冻融，以提高DNA的含量及纯度。有如专利申请号为201210107413. O报道了一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，通过含吐温_80的灭菌生理盐水、无水乙醇及无菌水进行反复洗涤以去除窖泥中的酸、醇及酯类组分。然而，柱纯化必然会导致基因组DNA的大量损失，反复冻融过程未必能将古菌细胞壁有效裂解，对DNA的释放有一定局限性。同时，由于酿酒窖池窖泥处于高酸、高醇的特殊微环境及古菌的复杂细胞结构，如窖泥特征性古菌产甲烷菌的细胞壁含假肽聚糖，甲烷八叠球菌不含假肽聚糖而含复杂聚多糖，不受溶菌酶和内酰胺抗生素的作用。前述方法应用于研究窖泥古菌群落结构均存在一定局限性。因此，一种针对腐殖质污染及古菌特殊细胞结构的DNA提取、扩增的方法显得十分必要。
发明内容
针对现有窖池窖泥微生物群落多样性分析技术手段的局限性，本发明的目的在于提供一种针对腐殖质污染及古菌特殊细胞结构的DNA提取、扩增方法。本发明采用了以下技术方案
I)样品预处理
称取5g样品，加入20mL无菌PBS，充分混匀，加入5mL O. lmol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀后800r/min离心，收集上清液；重复洗涤沉淀并合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量O. lmol/L硫酸招溶液，10000r/min离心IOmin,弃上清液。2)基因组DNA提取
①将I)所得沉淀溶解于500μ LDNA提取缓冲液(0. IM Tris-HCl,0. IM EDTA，I. 5ΜNaCl，1%CTAB，pH8. O )，加入溶菌酶(100mg/mL)、纤维素酶(200mg/mL)、蜗牛酶(100mg/mL)及消化肽酶(250U/mL)各20 μ L，37°C水浴2h ；
②向上述样品中加入20%SDS 25μ L，65°C保温I. 5h ；
③向上述样品中加入10μ L蛋白酶K (250mg/mL), 55°C水浴摇床lh, 5000r/min离心4min，转移上清液；
④向上述上清液中加入等体积酹氯仿异戍醇(25:24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收集上清液；
⑤向上述上清液中加入等体积氯仿异戍醇(24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收
集上清液；
⑥向上述上清液中加入O.6倍体积预冷的异丙醇，-20°C下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤广2次后吹干；
⑦将DNA溶解于50 100μ L TE中，-20°C保存。3) PCR 扩增
PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50 uL 25uL 2 X Taq Master Mix,引物 PRA46f/PREA1100r (10umol/L)各 2uL，模板 2uL，ddH20 补足 50uL ;第二轮扩增体系为50uL 25uL 2 X Taq Master Mix，引物 PARCH340f_GC/PARCH519r (lOumol/L)各 2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH20补足50uL。扩增条件为92°C预变性2min，92°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸6min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。DGGE变性剂浓度梯度为35% 65%，I X TAE电泳缓冲液，60°C，130V，电泳5h后SYBR Green I立即染色。本发明的优点在于在DNA提取前为窖泥微生物提供了PBS缓冲体系，加入的硫酸铝能高效去除腐殖质；有针对性地加入能有效裂解古菌细胞壁的消化肽酶，达到了提高基因组DNA质量及纯度的目的；结合巢式PCR-DGGE指纹图谱技术得到了较真实、可靠的酿酒窖池古菌群落多样性信息，为准确剖析浓香型白酒窖池古菌群落随窖龄变迁的规律提供了 准确、快速的分析手段。
图I为浓香型白酒窖池4种不同窖龄窖泥基因组DNA的琼脂糖电泳 图2为浓香型白酒窖池4种不同窖龄窖泥的古菌基因组DNA巢式PCR第二轮扩增产物琼脂糖电泳 图3为浓香型白酒窖池4种不同窖龄窖泥的古菌DGGE指纹图谱。
具体实施例方式 本发明提出一种针对腐殖质污染及古菌特殊细胞结构的DNA提取、扩增方法
I)样品预处理
⑴称取5g不同窖龄窖泥(I年、50年、100年及300年)于50mL无菌离心管，加入20mL无菌PBS (pH6. 0)，涡旋混匀后加入5mL 0. lmol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀，800r/min离心，收集上清液，沉淀用PBS (pH6. 0)重复洗涤f 2次，合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量0. lmol/L硫酸招溶液；10000r/min离心IOmin,弃上清液。2)基因组DAN提取①将I)所得沉淀溶解于500μLDNA提取缓冲液(O. IM Tris-HCl,0. IM EDTA，I. 5ΜNaCl，1%CTAB，pH8. O )，加入溶菌酶(100mg/mL)、纤维素酶(200mg/mL)、蜗牛酶(100mg/mL)及消化肽酶(250U/mL)各20 μ L，37°C水浴2h ；
②向上述样品中加入20%SDS 25μ L，65°C保温I. 5h ；
③向上述样品中加入10μ L蛋白酶K (250mg/mL), 55°C水浴摇床lh, 5000r/min离心4min，转移上清液；
④向上述上清液中加入等体积酹氯仿异戍醇(25:24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收集上清液；
⑤向上述上清液中加入等体积氯仿异戍醇(24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收
集上清液；
⑥向上述上清液中加入O.6倍体积预冷的异丙醇，-20°C下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤广2次后吹干；
⑦将DNA溶解于50 100μ L TE中，-20°C保存。3) PCR 扩增
PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50 uL 25uL Taq Master Mix，引物 PRA46f/PREA1100r (IOumoI/L)各 2uL，模板 2uL，ddH20 补足 50uL ;第二轮扩增体系为50uL 25uL Taq Master Mix，引物 PARCH340f_GC/PARCH519r (lOumol/L)各 2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH20补足50uL。扩增条件为92°C预变性2min，92°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin,30个循环，最后72°C延伸6min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。DGGE变性剂浓度梯度为35% 65%，IXTAE电泳缓冲液，60°C，130V，电泳5h后SYBR Green I立即染色，染色完成后，在凝胶成像仪中拍照分析。
权利要求
1.一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤 1)样品预处理 ①称取5g样品，加入20mL无菌PBS，充分混匀，加入5mLO. lmol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀后800r/min离心，收集上清液； ②重复洗涤沉淀并合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量O.lmol/L硫酸招溶液，10000r/min离心IOmin,弃上清液。
2)基因组DNA提取 ①将I)所得沉淀溶解于500μLDNA提取缓冲液(O. IM Tris-HCl,0. IM EDTA，I. 5ΜNaCl，1%CTAB，pH8. O )，加入溶菌酶(100mg/mL)、纤维素酶(200mg/mL)、蜗牛酶(100mg/mL)及消化肽酶(250U/mL)各20 μ L，37°C水浴2h ； ②向上述样品中加入20%SDS 25μ L，65°C保温I. 5h ； ③向上述样品中加入10μ L蛋白酶K(250mg/mL), 55°C水浴lh, 5000r/min离心4min,转移上清液； ④向上述上清液中加入等体积酹氯仿异戍醇(25:24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收集上清液； ⑤向上述上清液中加入等体积氯仿异戍醇(24:1),摇勻，10000r/min离心IOmin,收集上清液； ⑥向上述上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20°C下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤广2次后吹干； ⑦将DNA溶解于50 100μ L TE中，_20°C保存。
3)PCR扩增 PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50uL 25uL Taq酶反应体系混合液，引物 PRA46f/PREAl IOOr (10umol/L)各 2uL，模板 2uL，ddH20 补足 50uL ;第二轮扩增体系为 50uL 25uL Taq 酶反应体系混合液，引物 PARCH340f_GC/PARCH519r (10umol/L)各 2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH20补足50uL。
扩增条件为92°C预变性2min，92°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸6min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。DGGE变性剂浓度梯度为35°/Γ65%，IXTAE电泳缓冲液，60°C，130V，电泳5h后SYBR Green I立即染色。
2.根据权利要求I所述一种有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于所述步骤3)中Taq酶反应体系混合液为2XTaq Master Mix。
全文摘要
本发明涉及一种窖泥微生物群落的分析方法，尤其是浓香型白酒窖泥古菌群落及多样性特征的分析方法。具体方法如下1)称取一定量的窖泥，加入PBS缓冲液及硫酸铝溶液进行预处理；2)加入DNA提取缓冲液、溶菌酶、消化肽酶等多酶体系进行细胞破壁处理；3)加入氯仿-酚抽提除杂；4)异丙醇沉淀，得到样品基因组DNA；5)以古菌基因组DNA为模版，进行巢式PCR-DGGE分析。本发明在DNA提取前为窖泥微生物提供了PBS缓冲体系，加入的硫酸铝能高效去除腐殖质；有针对性地加入能有效裂解古菌细胞壁的消化肽酶，达到了提高基因组DNA质量及纯度的目的；结合巢式PCR-DGGE指纹图谱技术得到了较真实、可靠的酿酒窖池古菌群落多样性信息，为准确剖析浓香型白酒窖池古菌群落随窖龄变迁的规律提供了准确、快速的分析手段。
文档编号C12Q1/04GK102912025SQ20121043536
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者周荣清, 何翠容, 郑佳 申请人:四川大学