柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖、表现、纯化、性质分析及应用方法

专利名称：柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖、表现、纯化、性质分析及应用方法
技术领域：
本发明是有关于一种柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖及表现方法，尤其指利用聚合酶连锁反应(PCR)技术，自新鲜柠檬果实选殖出一铜锌型超氧岐化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA，此选殖及表现出的Cu/Zn-SOD，可去除自由基；当Cu/Zn-SOD应用于化妆品可去除黑斑、雀斑及防止皱纹产生，且Cu/Zn-SOD加于烫伤药膏可加速伤口愈合，且Cu/Zn-SOD在整形外科的皮肤移植、人造皮移植，可防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合。
背景技术：
自由基的生成会产生氧化压力(oxidative stress)，而氧化压力可能会引起细胞的功能丧失(disfunction)及细胞死亡；在许多动物的疾病发展上，自由基的生成扮演相当重要的角色，包括老化、白内障、癌症、自体免疫失调和心血管疾病等；且自由基的生成同样也会造成细胞蛋白质、脂质、核酸的功能改变。
兹将自由基及其生成、种类、伤害、防御系统等说明如后(一)、自由基自由基(free radical)是指含有一个或多个不成对电子而独立存在的原子或分子，可依其未成对电子所在位置而区分成以碳、氧、氮或硫为中心的自由基；不同型态的自由基其化学反应差异相当大，大部分的自由基具有较高的自由能并处于不稳定状态，容易以它特有的强氧化作用攻击邻近的分子，并产生大量的加成物，使分子发生连锁反应，影响极大。
氧是维持生命所必须的基本组成，亦是形成反应性氧分子(reactive oxygenspecies；ROS)的前趋物，在大气中是以稳定的三重态氧(triplet state oxygen)存在；氧可以经由数种途径活化，形成的一系统的中间产物如超氧阴离子(·O2-)和过氧化氢(H2O2)，或者吸收能量激发为单重态氧(singlet oxygen)；在细胞中平常代谢及NADPH氧化系统中所产生的副产生包括H2O2、·OH及·O2-都包括在ROS范围内，其中有些是自由基，而含氧的自由基称氧自由基(oxyradicals)；氧自由基与其它非自由基活性氧亦合称为ROS。
(二)、自由基的生成自由基和活性氧会经由生物性和环境性过程产生，并引起连锁反应而形成更多的自由基。
生物体中的活性氧与自由基(内生性)；在好氧状况下，生物体主要是经由以下两种途径产生活性氧和自由基
(a)代谢产生(metabolism)这类自由基在新陈代谢的过程中产生，生物体在正常的好氧性呼吸作用下，氧分子自粒腺体电子传递链、微粒体细胞色素P-450或其他系统，经由连续步骤接受四个电子和四个氢原子而还原成水，在此过程中经由电子转移会依序产生·O2-、H2O2和氢氧自由基(·OH)。此外一些较复杂的生化合成或代谢过程中亦会产生其他的自由基如·NO。
(b)生物合成物(biosynthesis)生物体计划性的产生具利用性的活性氧，典型的例子是白血球活化产生·O2-、HOCl与H2O2，此种特性对于白血球在杀死细菌和真菌上扮演相当重要的角色；除了白血球之外，体内其他型态的细胞如淋巴细胞、纤维细胞和血管内皮细胞亦会产生·O2-；由上述途径产生的活性氧和自由基会经由连锁反应而产生更多的自由基；在正常状态下以大鼠为例其每个细胞每天约产生2×1010个·O2-和H2O2，且当生物体受到疾病侵袭时，所产生的活性氧数目将会更多。
环境中的活性氧与自由基(外生性)；环境中自由基的主要来源包括辐射离子、空气污染、抽烟和暴露于化学物质等；当生物体持续暴露于离子辐射下，会使体内水分子O-H键裂解而生·OH；生物体暴露于NO2下，其会加入细胞的不饱和脂肪酸的和双键上而产生自由基，并引发自身氧化反应；抽烟是人体暴露于自由基伤害的另一项重要来源，香烟燃烧时会产生多种氧化物和自由基，包括氧化烷基(Alkoxyl)和以碳为中心的自由基，日常生活中的许多化学物质摄入体内时，也可能产生自由基，例如除草剂paraquat和diquat经氧化还原循环后会形成·O2-，还有一些致癌物与抗致癌药物在体内代谢时也会形成自由基。
(三)、自由基的种类自由基的种类相当的多，大多是瞬间产生，半衰期很短，但具有严重的破坏性，其中对于生物体影响较深的有下列三种(a)·O2-·O2-是最常见的自由基，其在细胞内不像·NO一样会穿透细胞膜，所以通常·O2-的作用及产生都是在区间中；·O2-的产生及代谢过程，因其半衰期极短，所以很少直接对生物体造成伤害；若由超氧化物自由基引发的连锁反应所产生的二级产物、三级产物等，即可能造成严重的伤害。
(b)·OH·Oh的反应性及破坏性是在所有的自由基中最严重的，主要来源是H2O2进行Fenton反应而产生，另外也可经由各类辐射线引发，如X光照射，也会产生大量·OH；其最主要的伤害是造成体内脂质过氧化而破坏细胞膜系，而且会和糖类、氨基酸、磷脂质、核醣体、有机酸等生物体内的物质反应，对细胞的毒害甚为严重。
(c)·NO1980年间，·NO只不过被认为是一种毒气分子，也被世界各国的环保团体列在黑名单中，因为·NO常在大气污染或抽烟的喷气中出现，并会与臭气(ozone)作用成为酸雨的来源；除此之外，·NO也易与体内生成的·O2-结合，所产生的peroxynitrite(·ONOO)也同样会攻击身体内的大型分子，所以·NO在十年前被视为毒性极强的自由基，但近几年来，有许多的研究纷纷证实·NO在人体的微妙功能，如在人体的免疫反应中，当病菌等外来物入侵体内时，巨噬细胞(macrophage)就会利用NOS(·NO synthase)产生大量的·NO去做防御的工作；除此之外·NO也被发现为人体神经系统的讯息传递分子(messenger molecule)与具有舒松血管、降低血压的功能。
(四)、常见的自由基伤害当自由基的产生及防御自由基的能力两者不平衡的情况下便会产生氧化压力(oxidative stress)，而氧化压力可能会引起细胞的功能丧失及细胞死亡；在许多的疾病发展上扮演相当重要的角色，包括老化、白内障、癌症、自体免疫失调和心血疾病等；同样也会造成细胞蛋白质、脂质、核酸的功能改变。
(a)对脂质的伤害脂质和脂蛋白的不饱和脂肪酸对自由基引起的氧化特别敏感，细胞膜不饱和脂肪酸的氧化是人体内常发生的氧化现象；ROS，特别是·OH的过量产生非常容易引发细胞膜的脂质氧化，脂质氧化不仅会破坏脂质，也会造成膜上蛋白质的破坏如接受体和酵素，而且会使膜的电位及流动性改变造成细胞膜对离子的通透性大增；多元不饱和脂肪酸受到自由基攻击后会形成脂质自由基，而且氧会与这些自由基反应而形成过氧化自由基(peroxylradicals)与H2O2，这些化合物会继续进行连锁反应而导致膜的损坏。
(b)对蛋白质的伤害蛋白质在氧化状态下其胺基酸残基会受到多种的氧化修饰，如蛋白质碳基(carbonyls)的形成；而许多ROS也可以氧化蛋白质上的-SH基，使许多重要的酵素失活；由于蛋白质上经常会结合过度金属离子，因而H2O2会在蛋白质的特定位置上形成·OH，使蛋白质成为攻击目标。
(c)对DNA的伤害在细胞内，DNA是自由基攻击的一个重要目标；·OH攻击DNA时会造成多种化学性的改变，进而造成DNA盐基的修饰、交叉联结(cross-linking)、DNA盐基与蛋白质结合及DNA断裂等，例如deoxyguanosine受到·OH攻击产生8-hdroxydeoxyguanosine(8-OHDG)，其为DNA受到氧化伤害的标记。
(五)、自由基的防御系统(defense system)虽然ROS与自由基会造成生物分子的损伤，而导致疾病产生，但在正常状况下，生物体中具有抗氧化的防御系统，包括抗氧化酵素及抗氧化物来移除ROS与自由基，并由修复系统修补自由基所引发的伤害；这些抵御自由基的防护系统，大致上可分为(A)非酵素性防御系统如维生素C、维生素E与胡萝卜素等。
(B)酵素性防御系统如SOD、过氧化氢酶(catalase)、麦氨基硫过氧化酶(glutathinoe peroxidase)等。
(C)DNA修复系统(repair system)生物体中存在多种酵素可以辨识不正常的DNA并藉由剪除(excision)、再合成(resynthesis)和再接合(rejoining)DNA单股来移除不正常部位；蛋白质上受到氧化的甲硫胺酸(methionine)残基可经由methionine sulfoxide reductase修复，其他受伤害的蛋白质则由细胞内的蛋白酶加以辨识并分解之。
另按，SOD广泛存在于好氧性或厌氧性的真核或原核生物中；SOD能将·O2-催化成O2或H2O2，提供了生物体抵抗毒性氧所带来的破坏与伤害，其反应式()；SOD是含金金属的蛋白酵素，根据其活性位置所结合的金属辅酶因子的不同一般可区分成铜锌型、锰型及铁型三种类型，这三种不同类型的SOD分布于不同的物种与不同的区位(a)Cu/Zn-SOD1939年Mann，T.与Keilin，D.与从牛的红血球及肝细胞中分离出hemocuprein和hepatocuprein，为一蓝绿色含有铜金属的蛋白质，在红血球中亦有含锌及铜的蛋白质被分离出来，但不被认为具有酵素的功能，因此这种蛋白质被当做只有储存金属的功用；直至1969年美国学者McCord与Fridovich发现此种含铜锌的蛋白质具有清除·O2-的功能，因此将它命名为SOD，随后陆续在各种生物体内发现有Cu/Zn-SOD的存在；真核细胞中的Cu/Zn-SOD蛋白质分子量约为32kDa，具有两个相同的次单元体(subunit)，每个次单元体都具有一个活性中心，含有一个铜离子与一个锌离子，纯化出来的蛋白质呈淡蓝绿色，会被cyanide(CN-)及diethyl-dithiocarbamate(DDA)抑制；在真核系统中，例如人类的胞外超氧歧化酶(EC-SOD)亦是一种Cu/Zn-SOD，由四个次单元体组成，分子量约130kDa，最早是由Mardlund从人类肺脏纯化出来。用来防御大量来自细胞外的·O2-如经紫外光照射所产生的·O2-，其活性同样会被cyanide(CN-)抑制；EC-SOD-knockout的老鼠经过高浓度氧的处理后，存活率比起野生株(wild type)老鼠低很多，死因为急性肺水肿。SOD与·O2-的反应速率极快，几乎接近于扩散极限，但活性中心的铜离子暴露于溶剂的面积却不及酵素表面积的0.1％，Cu/Zn-SOD蛋白质次单元体表面多是带负电，所以因为同性电荷的斥力，将同样带负电的·O2-带到带正电的活性中心，进行酵素的催化反应，因此静电力被认为对引导阴电性的·O2-到达活性中心有促进作用。铜离子在此歧化反应中扮演了氧化与还原两种角色，而锌离子并没有参与催化作用，其功能主要是在稳定整个酵素的结构；若以其它金属离子取代铜离子时，酵素将失去活性，但若以Co2+、Hg2+甚至空位取代锌离子，则酵素分子仍具有部份活性。
(b)Mn-SODMn-SOD在1970年首先由Keele等人由大肠杆菌中分离出来呈淡红色，主要位于原核细胞与真核细胞的粒线体中。蛋白质的活性随着次单元体活性中心锰离子的价数改变而改变，当活性中心锰离子带正二价电荷时具有酵素的催化能力；当活性中心锰离子带正三价电荷时则呈休息状态(resting state)，不具有酵素的催化能力 Mn-SOD多为由两个蛋白质单元体组成的二元体，但亦有发现四元体甚至三元体的存在；其每个单元体分子量约19～22kDa，每个蛋白质单元体中含有一个锰离子；其由His26，His81，Asp175，His179与锰离子键结，而His30，His31，Trp133，Tyr181则组成Mn-SOD的活性部位；人类的细胞粒线体基质中所含有的Mn-SOD基因位于染色体上6q25的位置上。
(c)Fe-SODFe-SOD分布于原核细菌细胞基质(cell matrix)中，藻类、某些高等植物及其叶绿体中，在所有的动物组织中都没有发现Fe-SOD存在，但在一些高等植物组织中则发现有Fe-SOD存在，例如Ginkgo biloba、tomato、十字花科的油菜、水稻的花器；Fe-SOD呈淡黄色，在核酸与胺基酸序列上与Mn-SOD相似，对热及pH值较不如Cu/Zn-SOD稳定，亦不受cyandide抑制，但对过氧化氢则较无抵抗力，但与Cu/Zn-SOD的胺基酸序列有明显的不同；每个蛋白质次单元体的分子量约18.5～22kDa左右；Fe-SOD通常是由两个蛋白质单元体组成，但亦有发现有以四元体的形式存在，在每个单元体中含有0.5或1个铁离子，以 为例，其以His27，His81，Asp162，His167与铁离子键结；酵素的活性随着次单元体活性中心铁离子的价数而改变，当活性中心铁离子带正二价电时，具有酵素的催化能力，带正三价电时酵素呈现休止状态。
以下为Cu/Zn-SOD的结构Cu/Zn-SOD的每个单元体各含有一个铜离子和一个锌离子，其主要结构是由一个八条反向平行(antiparallel)的β-strain所构成的圆桶，也就是β-barrel的结构，由二条loops形成圆桶的上下缘，成一深长的活性通道，而活性通道底部就是与·O2-进行氧化还原反应的铜离子，铜离子暴露出部分面积于蛋白质表面，可与溶剂接触，而锌离子则位于铜离子之下，完全的包埋于蛋白质内部；由X-光晶格绕射bovine Cu/Zn-SOD分子中发现有三个带正电荷的胺基酸形成正电荷的活性通道，分别是Arg141、Lys120、Lys135，铜离子在活性中心的位置是由四个His(44、46、61、118)的imidazole ring形成配位键结，锌离子则是以His61做为桥梁与铜离子连结，其它与锌离子键结的氨基酸残基尚有His61、His69、His78及Asp81；内生性的双硫键位于Cys60及Cys161。

发明内容
本发明人有鉴于自由基的生成不当产生侵害生物体健康的种种弊端，特以其参与相关产品研究开发的实务经验及其一贯秉持具有的优良创作理念，针对去除自由基而致力，终于创作出一种柠檬Cu/Zn-SOD cDNA，其柠檬Cu/Zn-SOD对于自由基的生成具有确实的去除功能，且柠檬Cu/Zn-SOD可应用于化妆品、整形外科及皮肤移植、人造皮移植上，是符合产业利用性的发明创作。
本发明柠檬Cu/Zn-SODcDNA的选殖实验缘起；申请人不断的进行有关各种SOD的选殖、表现，并致力于SOD实质上的应用与发展；目前已获得多条无论是植物或动物的Cu/Zn-SOD及Mn-SOD序列，而就Cu/Zn-SOD的表现上，发现植物来源的活性皆比动物来源的要好的多；因此也许就此特性可使植物来源的Cu/Zn-SOD在医学、食品、学术研究等方面更具利用价值及贡献；申请人对于不同植物的Cu/Zn-SOD深感兴趣，其中凤梨Cu/Zn-SOD转染老鼠神经胶(microglia)细胞后，已初步证明可舒缓细胞内突增的氧化压力，所以继凤梨之后，仍想继续开发其他植物的Cu/Zn-SOD。
而一般酵素要进行反应都要在适当的pH值下才可作用，通常其pH值皆接近于7左右；但是就柠檬而言其果味极酸pH值介于2～3之间，因此我们对于在如此酸性环境下作用的柠檬Cu/Zn-SOD产生好奇，于是便开始着手进行柠檬Cu/Zn-SOD的选殖表现及其性质的研究，其研究结果如下(a)柠檬Cu/Zn-SOD cDNA的选殖由2.3g柠檬果实可得83ug total RNA，利用Magnetight oligo(dT)particle纯化出2.8ug mRNA，以1ug mRNA合成双股cDNA并与adaptor连接作为模板。根据本实验室先前自台农二号木瓜果实所选殖到的Cu/Zn-SOD cDNA核酸序列，合成核酸引子Ta-NR，与根据Clontech提供的核酸引子AP-2，进行PCR，经subclone获得一段258bp的片段，经过定序属于lemon 3’-RACE的序列(含有polyA与stop codon)，依此片段设计往5’端的specific primer，以此primer进行5’-RACE，得到550bp DNA，经subclone与autosequence证实为lemon5’-RACE的序列；由前述的3’-RACE及5’-RACE可以得全长Cu/Zn-SOD cDNA。
(b)柠檬Cu/Zn-SOD cDNA的对比所选殖到的柠檬Cu/Zn-SOD cDNA全长为744bp，5’端非转译区有127bp，3’端非转译区有158bp，转译区(open reading frame)含456bp，可转译出152个胺基酸[请参阅图1]，转译起始点(translation start site)的序列CACA ATG G，与其他植物(AACA ATG G)比，相似度很高。利用PILEUP program(Universityof Wisconsin Genetics Computer group)将柠檬Cu/Zn-SOD胺基酸序列与其它物种Cu/Zn-SOD序列加以比较，发现与铜锌离子结合有关的七个胺基酸(His-45，47，62，70，79，119及Asp-82)，与形成双硫键的cysteine(Cys-56，145)高保守区相符合；除此之外也发现柠檬Cu/Zn-SOD N端并无一段与蛋白质运送有关的序列(transit peptide sequence)，另一方面由胺基酸的相似性对比发现与cytoplasmic form的Cu/Zn-SOD同质性较高，因而推论所选殖到的柠檬Cu/Zn-SOD为cytosolic form。
(c)柠檬Cu/Zn-SOD cDNA的表现(expression)对于cDNA之表现，实验室有二种系统1.以pET-20B(+)为表现型载体的构筑；设计N端(Lecu-1)与C端引子(Lecu-2)，以Cu/Zn-SOD cDNA为模板与Lecu-1及Lecu-2为引子进行PCR得到450bp，将此DNA送入。E.coli进行筛选，抽取质体DNA用限制酶Eco RI及Xho I处理后与相同限制酶处理过的pET-20b(+)接合，送入E.coli BL21(DE3)以1mM IPTG在此37℃下诱发其表现，电泳后作蛋白质活性染色得知可获得含有活性的protein，经15％SDS-PAGE，于19kDa处可看到明显色带，此即为柠檬Cu/Zn-SOD。
2.为方便SOD穿过细胞膜，在前端接上含九个胺基酸的Tat，将接上Tat的SOD DNA送入酵母菌中进行表现。
(d)柠檬Cu/Zn-SOD的纯化培养能够表现柠檬Cu/Zn-SOD的菌株，并进行亲和性管柱快速纯化，可得到纯度高的柠檬Cu/Zn-SOD。用His-tag亲和性管柱快速纯化的蛋白质需透析去除纯化步骤中冲提液所含的imidazole，培养500mL菌液，约可得到2.7mg的重组蛋白质。
(e)柠檬Cu/Zn-SOD的性质500mL菌液经由His-tag纯化得到2.7mg酵素，酵素比活性为7456U/mg。取得3ug Cu/Zn-SOD以SDS在37℃下处理，进行15％SDS-PAGE电泳后，由蛋白质染色可观察到同时存在双元体及次单元体。
(f)热稳定性(thermal stability)酵素液在90℃加热不同时间后，进行电泳分析，经蛋白质染色及活性染色后的结果，发现在90℃加热40min后，仍能维持60％活性[请参阅图2]。另外，也发现以双元体形式存在的酵素较次单元稳定，可以是因为存在于次单元体间的作用力(subunit interaction)如氢键(hydrogen bond)或疏水性作用(hydrophobicinteraction)，稳定双元体的蛋白质构形(conformation)，且结构较为紧密，因而有较高的热稳定性，依据文献指出牛Cu/Zn-SOD于85℃加热40min仅残余38％的活性和鸡肝Cu/Zn-SOD于45℃以上活性开始下降的情况相较之下柠檬Cu/Zn-SOD对热的稳定性较高。
(g)pH的影响酵素液在不同pH值的缓冲下，于37℃下反应1h之后，进行电泳，经蛋白质染色及活性染色[请参阅图3]，和甘蔗及木瓜Cu/Zn-SOD重组蛋白质在高pH值的环境下趋于以双倍体存在，在低pH值的环境下，则趋于以次单元体存在，所以一般无论是植物或动物来源的Cu/Zn-SOD显然在碱性环境较酸性环境稳定，但柠檬Cu/Zn-SOD在pH值2.3～11.0的处理，对其活性看不出有影响，柠檬果实本身极酸，或许Cu/Zn-SOD在演化上为了适应酸性环境，已作了适当的改变。
(h)SDS的影响酵素液在不同浓度的SDS下，于37℃下反应1h之后，进行电泳，经蛋白质染色及活性染色。由结果发现即使经4％SDS处理，柠檬Cu/Zn-SOD或活性都没有改变，足见其对denature reagent相当稳定。
(i)imidazole的影响酵素液在不同浓度的imidazole下，于37℃下反应1h之后，进行电泳，经蛋白质染色及活性染色的结果发现imidazole能使双倍体解离，此性质与甘蔗及木瓜Cu/Zn-SOD相似。
(j)蛋白酶的影响加入酵素液量1/20的chymotrypsin或trypsin在37℃下反应不同时间之后，进行电泳分析，经蛋白质染色及活性染色的结果。chymotrypsin或trypsin易水解次单元体。
本发明的实验结论利用PCR选殖到柠檬Cu/Zn-SOD cDNA，全长为744bp，转译区有456bp，可以转译出152个胺基酸，与其他植物来源的序列比较，有高的相似性；此柠檬Cu/Zn-SOD可将超氧自由基催化成氧分子或过氧化氢，提供了生物体抵抗毒性氧所带来的破坏与伤害。
本发明将柠檬Cu/Zn-SOD cDNA在E.coli或酵母菌系统表现，确实能表现出具有活性的重组蛋白质，经亲性性管柱进行快速纯化后，获得纯的Cu/Zn-SOD。
本发明经纯化得到的柠檬Cu/Zn-SOD的比活性为7,456U/mg，此柠檬Cu/Zn-SOD经热、4％SDS及酸碱等处理后其活性几乎不变，是目前世界上最稳定的SOD酵素。
本发明实验结果得知，自新鲜柠檬果实选殖出一铜锌型超氧歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD cDNA)cDNA，可表现出具有活性的Cu/Zn-SOD，此Cu/Zn-SOD可去除自由基。
本发明的主要目的，在提供一种可去除自由基的生成「柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖及表现方法」，此柠檬Cu/Zn-SOD，应用于化妆品，可去除黑斑、雀斑及防止皱纹，加于烫伤药膏可加速伤口愈合，在整形外科的皮肤移植、人造皮移植，可利用柠檬Cu/Zn-SOD，防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合，是为符合产业利用性及发明专利要件的Cu/Zn-SOD cDNA的选殖及表现方法。


图1柠檬铜锌型超氧歧化酶cDNA及其胺基酸序列图2柠檬铜锌型超氧歧化酶的热稳定性图3柠檬铜锌型超氧歧化酶在不同pH值的稳定性图4本发明的方法一流程5本发明的方法二流程图具体实施方式
本发明柠檬Cu/Zn-SOD cDNA的选殖及表现，其cDNA合成依方法方法一[请参阅图4]，是由柠檬total RNA的抽取(A)、柠檬m RNA的分离(B)、cDNA的合成(C)及cDNA接上adaptor(D)等程序达成。
柠檬total RNA的抽取(A)程序取2.3g柠檬果实以液态氮急速冷冻，于研钵中磨成粉末后取出，马上与20mlRNAclean(Hybaid)于25mL离心管中混合，震荡15sec，置于4℃下5min后以12,000xg在4℃离心15min，离心后取上面水溶液层，大约有10mL。将水溶液吸至新离心管中加入与之等量的isopropyl alcohol混匀，置于4℃下15min后也以12,000xg在4℃离心30min，沉淀物即为RNA；倒掉水溶液，加入0.8ml70％ethanol洗涤RNA随后以7,500xg在4℃下离心5min，共清洗三次，干燥后储存于-70℃备用。
柠檬m RNA的分离(B)程序取0.3mL的Magnetight oligo(dT)particle，利用separation stand移除上清液，再加入0.3mllysis/DTT buffer混合平衡particle并于室温下静置5min后移除上清液，此平衡动作重复二次；取total RNA pellet溶于0.4ml的水，加入平衡好的particle混合均匀后，再加入0.45mllysis buffer于室温下静置5min后去除上清液，接着用0.3ml的wash buffer冲洗与mRNA结合的particle二次，完全去除上清液后加入水0.5ml，震荡数秒后置于60℃，10min，此时mRNA即溶离出来，取出上清液于新的1.5ml微量管中，加入相当其1/10体积的3M NaOAc溶液及等量体积isopropanol，置于-20℃的温度上沉淀1h；而后，以12,000xg离心10min，除去上清液，而其沉淀物，以70％酒精溶液清洗3次，置于冷冻干燥机中，干燥后，置于-70℃冰箱待用。
CDNA的合成(C)程序将2ug mRNA溶于8ul的水中，依序加入下列试剂5X 1st strand synthesis reaction buffer 8ulsodium pyrophosphate solution 2ulhuman placental ribonuclease inhibitor(HPRI)2uldeoxynucleotide triphosphate mixture4ulanchored dt25 4ulTotal28ul混合均匀，离心2sec后，加入40unit/2ul reserve transcriptase，在42℃下反应60min，移入冰中。
取出前述合成的第一股cDNA反应液，依序加入下列试剂1st stand cDNA reaction mixture 30ul2nd strand cDNA reaction buffer 80ulRibonucleaseH(0.8unit) 0.2ulDNA polymerase I 13.2ulH2O 54.8ulTotal180ul混合均匀，依序置于12℃反应60min，22℃反应60min，70℃反应10min，取出置于冰浴中。加入4unit T4DNA polymerase，混匀之后，置于37℃下反应10min，加入8ul 0.25 MEDTA(pH8.0)，中止反应的进行，取合成好的双股cDNA反应液，加入等体积的phenol/chloroform，振荡混匀，以10,000xg离心10min后，收集水层，剩下的有机层再加phenol/chloroform，重复萃取一次后，同样地也收集水层；将所有收集到的水层液，加入1/10体积的4M ammonium acetate(pH5.8)及2.5倍体积的绝对酒精，置于-20℃温度下30min以进行酒精沉淀；而后以10,000xg离心10min，除去上清液，而其沉淀物，以70℃酒精溶液清洗3次，置于冷冻干燥机中干燥之；将干燥好的cDNA，溶于TE buffer中，储存于-20℃中，以待进一步实验。
cDNA接上adaptor(D)程序double atrand cDNA1ugMarathon cDNA adaptor(10uM) 2ul5X DNA ligtion buffer 2ulT4DNA ligase1ulsterilized H2O to final volume 10ul振荡混匀之后离心数秒，置于16℃下反应8h或16-23℃下反应3-4h，此一接上adaptor的cDNA作为PCR的模板进行PCR。
Cu/Zn-SOD cDNA的选殖及表现依方法二进行方法二请参阅图5，PCR(a)、胶体的制备、电泳(b)、次选殖(subcloning)(c)、酵母菌表现型载体的构筑(d)、pET-20b(+)表现型载体的构筑(e)、蛋白质的诱发与样品的电泳分板(f)、重组DNA的构筑(g)及Western blotting(h)等程序达成。
PCR(a)程序将下列反应试料加至0.5mL微量试管中，依序加入下列试剂template DNA0.2ug5’-sense primer10pmol3’-antisense primer10pmol
10X Taq DNA polymerase buffer 5ul15mM Mgcl26ulTaq DNA polymerase 2.5units10mM dNTP 1.5ulsterilized H2O to final volume 50ul加入50-100ul矿物油，进行PCR(25 cycles of 95℃ denature 30sec，42-55℃ for30sec，72℃ for 30sec)。PCR反应结束后，可得大量DNA产物，经回收后可用来进行下一步的实验，例如进行DNA重组，分析其序列。
胶体的制备、电泳(b)程序所用的胶体为1.0％agarose gel，倒入1X TAE buffer以能完全覆盖住gel为原则。取15ul PCR产物，加上其1/10体积的追踪染剂(0.25％bromophenol blue，0.25％xylene cyanol FF，30％glycerol in water)，注入well中，另外也注入6ul的1kb DNAmarker(B.B.I.)用来了解DNA样品的大小，接着以100volt的电压进行电泳，待DNA dye移动至gel的2/3处，即可中止电泳。将完成泳的gel以EtBr(ethidiumbromide)染色15min后，放入水中退染，之后即可置于UV trans-illuminator box下观察，另外也以polaroid照相。
次选殖(subcloning)(c)程序(1)PCR产物与载体接合与宿主细胞转型(transformation)取1ul PCR产物，加入1ul salt solution，1ul的灭菌水与0.5ul的pCR2.1之后，于室温下反应5min以进行ligation。取前述已接合好的recombination DNA，加入18ul TOPO 10 competent cell中，置于冰上30min，后置于42℃的水浴中30sec进行heat shock后立即置于冰上2min，加入150ul SOC medium，在37℃下振荡培养60min，将其均匀涂布在含50ug ampicillin/mlLB agar的培养皿，在37℃培养12-16h之后，挑选50-80个单一菌株于新的ampicillin/mlLB arar上，待进一步实验。
(2)菌体的转印与放射性探针的制备将转印纸覆于培养皿表面，并以针头扎洞作定位之后，轻轻取出转印纸，此时培养皿上的菌落(colony)转印到转印纸上，转印工作完成。准备一浅盘，上覆3mm滤纸，倒入denature solution(0.5M NaOH，1.5M NaCl)，倒入量以能充分湿润3MM滤纸为原则，将转印纸以吸附菌面朝上，放在湿润的3MM滤纸之上7min，接着取另一浅盘以neutralization solution(1M tris-HCL，1M NaCl，pH7.5)充分湿润3MM滤纸之上7min。重复neutralization solution步骤之后，将转印纸置于烘箱中，以60-70℃烘干，需时40min。之后，将转印纸放于UVcross-linker机器(Amersham)中，进行cross-link 15sec后，待进一步以放射性探针来筛选。
放射性探针的制备如下
oligonucleotide(2pmole/ul) 0.5ul10X T4polynucleotide kinase buffer 3.0ulT4polynucleotide kinase(12unit) 1.5ul[r-32p]ATP 3.5ulH2O 21.5ulTotal 30.0ul混合均匀，置于37℃下反应30min后，即完成放射性探针的制备。将放射性探针加入hybridization solution中，用来筛选我们所要的目标基因(cDNA)。
(3)目标基因cDNA的选殖取出前述经cross-link的转印纸，加入以1.5X SSC及0.1％SDS配制成的洗剂，在44℃下震摇30min，倒掉洗剂，加入不含放射性探针的hybridization solution(5X SSC.5X Denhard solution，0.5％SDS，100ug/mlsalmon sperm DNA)，目的为去除一些非特异性的结合，以降低背景值，此一过程称之为prehybridization。倒出hybridization solution，加入含有放射性探针之hybridization solution，置于44℃水浴震摇16h以上，倒出含有放射性探针的hybridization solution，用前述洗剂，在44℃震摇5min，重复此一步骤2-4次。压干转印纸，进行自动放射显影(autoradiography)，冲片后，挑出正反应株。
(4)细菌质体的纯化与检视挑出正反应株养于含ampicillin(50ug/mL)的LB，于37℃下培养6-8h。以10,000xg离心3min，取得菌体沉淀物，加入200ul resuspension solution(50mMTris，pH7.5，10mM EDTA)振荡，使菌体悬浮状态。加入200ul lysis solution(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻的混匀，使菌体能被完全溶掉，质体能溶离出来。加入200ul neutralization solution(1.32M potassium acetate)，小心的混匀，而后以12,000xg离心10min，取上清液，注于0.5mL离心管(含DNA吸附膜)，以12,000xg离心1min，使DNA能吸附于membrane上，之后加入700ml的washsolution，离心(12.000xg)2min后。再离心(12,000xg)2min以去除残留的酒精，最后加入50ul的热水(60℃)静置30sec后，离心(12,000xg)2min，收集离心下来的质体DNA作质体的限制酶反应与电泳分析。即取DNA以及适量的限制酶，加上10x reactin buffer，最后加无菌水使体积为10ul，在适当的温度下反应2h，以1％agarose gel电泳分析，以确定嵌入DNA的大小。
(5)序列的判读利用ABI PRISM 377-96 DNA Sequencer仪器进行autosequencing。
柠檬Cu/Zn-SOD cDNA之表现表现型载体的构筑(d)程序现载体为pPICZXA并在N-端(Cu/Zn-SOD)接上9个胺基酸的Tat，将其转殖入酵母菌作为表现宿主
f1SOD5’-CGG AGA CAG CGA CGA AGA GCA TGC ATG GTG AA-3’f2SOD5’-GCG AAT TCA TGA GGA AGA AGC GGA GAC AGC GA-3’rSOD5’-GTT CTA GAG GCC CTT GGA GGC C-3’取1ul cDNA当模板，与上述引子(f1SOD，rSOD)各10pmol进行PCR(30cycles of 94℃ for 30sec，55℃ for 30sec，72℃ for 30sec)，取2ul PCR产物当模板，与上述引子(f2SOD，rSOD)各10pmol进行PCR(30cycles of 94℃ for30sec，55℃ for 30sec，72℃ for 30sec)，次选殖后取6.5ul insert DNA与1.5ulp PICZXA(皆先以Eco RI和Xba I处理)，筛选挑出正反应株以进行蛋白质表现。
pET-20b(+)表现型载体的构筑(e)表现载体为pET-20b(+)，具有ampicillin selection marker可适用于多种E.coli，除此之外含有MCS(multiple cloning site)可承接外来基因。MCS之前为pel B leader sequence，使表现出的蛋白质能分泌到periplasmic中。另外在MCS后面则为His-tag，可快速纯化重组蛋白质。利用GCC program分析柠檬Cu/Zn-SOD cDNA并配合表现载体的cloning site分别设计N端核酸引子如下Lecu-15’-GATTCG ATG GTG AAA GCA GTT GCA GTT-3’Eco RILecu-25’-CTCGAG CCC TTG GAG GCC AAT TAT GCC-3’Xho I取1ul cDNA当模板，与上述引子各10pmol进行PCR(25 cycles of 94℃ for 30sec，50℃ for 30sec，72℃ for 40sec)，次选殖后取6.5ul insert DNA与1.5ulpET-20b(+)(皆先以Eco RI和Xho I处理)连接，筛选挑出正反应株以进行蛋白质表现。
蛋白质的诱发与样品的电泳分析(f)将筛选到的正反应株接种至150ml LB培养液中，在37℃，以150rpm振荡培养，至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG(isopropyl-thio-β-D-galactopyanoside)使最终浓度达1mM，同时另加50mL培养液于37℃继续培养2h之后，取180mL培养好的菌液，以7,000xg离心5min，除去上清液，加入1g glass bead及3ml 10mM Tri-HCl(pH8.0)，打破菌体，以10000xg离心5min，收集上清液后，再加入3mL缓冲液，重复此一萃取步骤，最后用4mL缓冲液再萃取一次，一共收集10mL上清液，此为粗蛋白质样品(crude exract)，待进一步的电泳，电泳的胶体大小为10cm×8cm×0.75mm。
(1)电泳胶体的制备将铝板与玻板拭净后，和隔条(spacer)组合好，放入制胶模型中，再依下表所列的用量配制胶体溶液separation gel，混匀并注入模型中，再加入适当的水压平，约经过1h，胶体形成后，移去水层，再注入stacking gel，并插上槽梳(comb)，待成胶即可。
(2)电泳取适量sample与sample loading buffer混匀后注入胶体孔洞中，以100伏特电压进行电泳，native-PAGE约需65min，SDS-PAGE约需130min后中止电泳，小心取下胶体，进行Coomassie blue染色将胶体浸于染剂中，均匀摇动30min后，移去染剂，用无菌水清洗一次后，加入退染剂，退染12h即可。
(3)活性染色利用riboflavin及光照条件下与TEMED反应，作为产生超氧的系统，NBT(nitroblue terazolium)作为呈色剂(chromogenic reagent)。有SOD在的胶体区域，超氧阴离子被分解，NBT不发生还原反应，而呈现透明的亮带。无SOD存在的区域，超氧阴离子与NBT发生还原反应，而生成蓝紫色的formaza。操作过程首先将完成电泳的胶体，浸泡于15ml2.5mM NBT的水溶液中，避光摇动15min，移去NBT溶液，以去离子水清洗胶体后，再浸泡于15ml 8×10-5M riboflavin及30mM TEMED之水溶液中，照光摇动，透明亮带存在的区域为具有SOD活性之处。
(4)胶体的干燥将欲干燥的胶体浸于10％ glycerol溶液中30min，取一玻板及两张配合玻板大小的玻璃纸，用水充分湿润玻璃纸后，将其中的一张平铺于玻板上，再放上所要干燥的胶体，最后铺上另一张玻璃纸，用塑胶夹固定，置于室温下阴干。
(5)柠檬Cu/Zn-SOD的纯化柠檬Cu/Zn-SOD的C端带有6个His，可用Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharosesuperflow来进行亲和性管柱纯化，方法如下4mL的resin管柱，用5vol.的PBS平衡，之后将16ml的crude extract注入并收集流下来的液体(pass through)约15mL。再以5vol.20mM imidazole洗管柱，继之以4ml 250mM imidazole(inTris-HCL or PBS)/fraction冲提，并收集4个fraction，其中有2个fraction共8ml有收集到Cu/Zn-SOD蛋白质，因为含有imidazole，所以需经过透析除去imidazole。
透析液含0.1％glycerol的PBS将样品约8mL装入透析膜中，以透析夹夹好，放入含1L透析液的烧杯中，于4℃下透析4 h以上即可分装待进一步分析。
(6)柠檬Cu/Zn-SOD的分析先制作蛋白质标准曲线(BSA standard curve)即分别取蛋白质标准品(BSA，1.41mg/ml)1、2、3、4、5、6ul于其所对应的灭菌水中，使最后体积达800ul，之后分别加入呈色剂200ul室温下反应5min，测OD595并依吸光值求出蛋白质标准曲线。将采收的样品依相同方法测得吸光值即可由标准曲线求得蛋白质含量。
酵素活性测定(liquid assay)采用RANSOD kit进行酵素活性测定利用xanthine和xanthine oxidase(XOD)反应，作为superioxide anion产生的来源，所产生的superioxide anion与2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenylterazolium chloride(INT)反应，产生一红色的formaza；SOD的活性则依据formaza生成受抑制的程度来测定。
XODXanthine---→Uric acid+·O2-INT+·O2----→formazaSOD
(a)标准曲线的建立(依据RNASOD kit说明书)取不同的稀释度(S1～S6；S1牛血Cu/Zn-SOD标准品(5.9U/mL)0.05ml，加入1.7ml的混合基质(含0.05mM xanthine，0.025mM INT，0.94mM EDTA，50mM CAPS bufferr，pH10.2)。混和均匀后，加0.25ml xanthine oxidase(0.02U)，混匀于37℃反应，分别在30sec及3min，测定其在波长595的吸光质A1及A2，依据下列公式计算出抑制百分率后，以标准品的活性取对数作为横轴，抑制百分率作为纵轴，经过线性回归后，得到标准曲线。
(A2-A1)/3＝ΔAstandard or sample/min100-(ΔAstandard or sample/min×100)/ΔAs1/min＝％inhibition(b)样品活性的测定与标准品之测定方法相同，得到反应时间30sec及3min在波长595nm吸光值的变化，并换算成抑制百分率，对照准曲线，即可求出样品的SOD活性(U/mg)。
Cu/Zn-SOD性质热稳定性(thermal stability)取20ul酵素液(6.8ug)于1.5ml试管中，5管，分别于90℃加热0、10、20、30、40min后，置于冰上，进行电泳(10％ native-gel)，gel分别作蛋白质染色(3.4ug)及活性染色(3.4ug)。
pH值的影响取10ul酵素液(3.4ug)，于1.5ml试管中，共10管，加入5ul不同pH值buffer0.2M citrate sodium buffer(pH2.3，3.0，4.0 or 5.0)，0.2M Tris-HCl buffer(pH7.0 or 9.0)，0.2M glycine NaOH buffer(pH10.0 or 11.0)，0.2M KCl-NaOHbuffer(pH12.0)，在37℃下反应1h后，加入3ul sample loading dye，每管样品分成2份分别注入胶槽中，进行电泳(10％native-gel)，分别作蛋白质染色(1.9ug)及活性染色(1.5ug)。
SDS的影响取20ul酵素液(6.8ug)，分别加入5ul不同量的20％SDS，使SDS最终浓度为0、1、2、3、4％，在37℃下反应1h后，进行电泳(10％native-gel)，分别作蛋白质染色(3.4ug)或活性染色(3.4ug)。
Imidazole的影响取20ul酵素液(6.8ug)，分别加入不同量的imidazole，使imidazole最终浓度为0、0.25、0.5、1M，在37℃下反应1h后，进行电泳(10％native-gel)，分别作蛋白质染色(3.4ug)或活性染色(3.4ug)。
蛋白酶的影响取18ul酵素液(6ug)，加入相当酵素液量1/20的trypsin或chymotrypsin于Tri-HCl buffer(pH8.5)含20mM CaCl2分别在37℃下反应1、2、3、4h，进行电泳(10％ native-gel)，分别作蛋白质染色(3ug)或活性染色(3ug)。
柠檬Cu/Zn-SOD cDNA转染于BV-2细胞，探讨对该细胞的影响，其重组DNA的构筑(g)表现型体载为pcDNA3.1/CT-GFP，其含有很强的病毒启动子(promoter)CMV(Cytomegalo virus)，能够很有效率地短时间内制造稳定且大量的蛋白质以全长cDNA当模板，与一组primer(1+2)进行PCR经TA cloning与载体连接经次选殖筛选、定序等步骤得到一正重DNA(pcDNA3.1/CT-GFP-normal)及一对照组重组DNA(pcDNA3.1/CT-GFP)，正重组DNA能表现出完整的柠檬Cu/Zn-SOD，对照组表现出载体本身的GFP，重组DNA所用的primers序列如下1.Lecu-75’-ATG GTG AAA GCA GTT GCA GTT-3’2.Lecu-85’-GGA GGC CAA TTA TGC CGC AAG-3’柠檬Cu/Zn-SOD的转染柠檬Cu/Zn-SOD的转染(transfection)与SOD表现的time course，转染前日必需将细胞分盘，并预估次日为七至八分满(*)。在细胞生长期(grow phase)下，即分盘后经过18-24h即可进行转染。细胞先以不含血清与抗生素的培养基(serum free media，SFM)冲洗一次，并取适量所欲转染的plasmid DNA加入适量的LIPOFECTMAIN(*)与SFM下进行转染复合物(transfection comple)的形成。DNA与LIPOFECTMAIN反应30min后，将形成好的转染复合物与适量的含血清培养基充分混合后加入生长期的细胞中(此时2-3h间必需常去察细胞耐受度)。转染进行3h后，移除转染液，并以只含有血清的培养基(serum onlymedia)取代之，分别在培养12，24，36，48h后采收样品，控制组为同样条件下转染vector pcDNA3.1/CT-GFP，在培养24h后采收样品，样品则以Western来进行分析。
(*)转染前日分盘细胞数估算如下

(*)LIPOEFCTMAIN最适剂量如下*测试样品采收细胞的采收(cell harvest)与细胞内容物(cell extract)的萃取，首先去除培养液的细胞，以PBS洗1-2次后，添加适量的lysis buffer(*)(60mm，200ul，100mm，50ul)，将整盘细胞置于-70℃冰箱中20min后移至室温下，此时细胞已能完全lysis。
收集细胞萃取液并进行总蛋白质(total protein)定量。
(*)Lysis buffer的制备0.1％Triton X-100 in 0.1M Tris-HCl(pH8.0)细胞萃取物总蛋白质(total protein)定量先制作蛋白质标准曲线(BSA standard curve)即分别取蛋白质标准品(BSA，1.41mg/mL)1、2、3、4、5、6ul于其所对应的灭菌水中，使最后体积达700ul，之后分别加入呈色剂200ul室温下反应5min后，测OD595并依吸光值求出蛋白质标准曲线。将采收的样品依相同方法测得吸光值即可由标准曲线求得蛋白质含量。
Western blotting(h)将样品定量之后取每一样品(3ug total protein)跑15％ SDS-PAGE，将跑完的SDS-PAGE进行蛋白质的转印，取一张和SDS-PAGE同等大小的transfermembrane先以transfer buffer浸湿后，依照负往正的方向依序放入gel与membrane，并在gel与membrane的前后放入浸有transfer buffer的3MM滤纸，之后放入protein transfer machine以100V及0.35A，转印60min或30V及0.09A，转印16h。转印好的membrane取出，用脱脂奶(fat free milk)进行blocking1h。blocking之后用PBS-T洗三次(15，5，5min)，接着加入primary antibody室温下反应1h，反应终止用20mlPBS-T洗三次后加入secondary antibody室温下反应1h，最后再用PBS-T洗三次后取等量的成色反应剂hydrogen peroxide A & B均匀混合后加在membrane上，于60sec内进行压片与冲片。
本发明参考文献如下(1)Brock，C.J.；Walker，J.E.Superoxide dismutase from Bacillusstearothermophilus.Complete amino acid sequence of a manganeseenzyme.Biochemistry.1980，19，2873-2882.
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权利要求
1.一种柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖、表现、纯化及性质分析方法，是由柠檬total RAN的抽取(A)、柠檬mRNA的分离(B)、cDNA的合成(C)及cDNA接上adaptor(D)选殖、表现、纯化及性质分析方法达成；Cu/Zn-SOD可抑止自由基的生成，当Cu/Zn-SOD应用于化妆品可去除黑斑、雀斑及防止皱纹，且纯化出的柠檬Cu/Zn-SOD，加于烫伤药膏可加速伤口愈合，Cu/Zn-SOD运用于整形外科的皮肤移植、人造皮移植，防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合。
2.根据权利要求1所述的柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖、表现、纯化及性质分析方法，其选殖、表现、纯化及性质分析亦可由柠檬聚合酶连锁反应(a)、胶体的制备、电泳(b)、次选殖(subcloning)(c)、与pPICZXA表现型载体的构筑(d)、与pET-20b(+)表现型载体的构筑(e)、蛋白质的诱发、纯化与样品的电泳分析(f)、与pcDNA3.1/CT-GFP(重组DNA)的构筑(g)及Westernblotting(h)程序达成。
全文摘要
本发明公开一种柠檬铜锌型超氧歧化酶的选殖、表现、纯化及性质分析方法，是由柠檬total RAN的抽取(A)、柠檬mRNA的分离(B)、cDNA的合成(C)及cDNA接上adaptor(D)选殖、表现、纯化及性质分析方法达成；Cu/Zn－SOD可抑止自由基的生成，当Cu/Zn－SOD应用于化妆品可去除黑斑、雀斑及防止皱纹，且纯化出的柠檬Cu/Zn－SOD，加于烫伤药膏可加速伤口愈合，Cu/Zn－SOD运用于整形外科的皮肤移植、人造皮移植，防止移植皮肤的组织坏死，进而加速移植皮肤的缝合。
文档编号C12N9/02GK1566336SQ0310967
公开日2005年1月19日 申请日期2003年4月11日 优先权日2003年4月11日
发明者林棋财, 林妙玟 申请人:林棋财