专利名称：同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，属植物保护领域。
背景技术：
烟草丛顶病(tobacco bushy top disease)于1957年在津巴布韦北部的春克旺里烟 区首次发生，此后爆发流行并造成很大损失。烟草丛顶病在我国的云南早有出现，但长期 以来由于该病仅为零星发生，未对烟草生产造成重大损失而被忽视，直到1993年在云南保 山、大理等地大面积爆发流行后才逐渐受到关注。此后该病在我国云南中西部烟区大规模 流行，给部分烟区造成毁灭性损失，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉 溪、红河、思茅、文山、西双版纳及怒江等州市也有烟草丛顶病零星发生。截止2001年，云南 省累计发病面积达51300 hm2，其中8700 hm2绝收，1400 hm2改种，直接经济损失高达2. 1亿 元，烟草丛顶病已经成为云南省自20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害。烟草丛顶病由幽影病毒属的烟草丛顶病毒(TbAacco bushy top virus, TBTV)和 黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的烟草扭脉病毒(TbAacco vein distorting virus, TVDV) 复合侵染引起。另外在云南烟草丛顶病的感病烟株中常检测到一条伴随TBTV出现且其分 子量约为1000 bp的小分子RNA，根据目前的研究推测该小分子RNA为TBTV的卫星RNA， 称其为烟草丛顶病毒类似卫星 RNA (Tobacco bushy top virus satellite-like RNA, Sat-TBTV)。2010年又从感染烟草丛顶病的植株中检测到了大小为3. 0 kbp与烟草丛顶病 相关的RNA,第九次国际病毒分类报告中将其命名为TVDVaRNA (Tobacco vein distorting virus-associated RNA，TVDVaRNA)。TBTV基因组不含编码外壳蛋白的基因，它可通过摩擦 接种传播，在辅助病毒TVDV的帮助下可通过蚜虫传播。目前的研究结果表明，自然条件下 表现典型烟草丛顶病症状的烟株，都由上述4种病原物复合侵染引起，而云南烟草丛顶病 发病区很多未表现症状的烟株，也经常能够检测到TVDV及TVDVaRNA。迄今，国内外尚无特 别有效的植物病毒病防治药剂，因此除了严防蚜虫的传播外加强烟株及蚜虫中烟草丛顶病 4种病原物的检测和监测，对于准确诊断病害和防止病毒病的传播流行具有重要的现实意 义，是生产上对烟草丛顶病进行综合治理的重要措施之一。通常检测鉴定植物病毒的方法有生物学、电镜技术、血清学技术和分子生物学技 术等。生物学方法操作简单，但该方法检测周期长、灵敏度低，还受到季节、环境以及病毒种 类等方面的影响，因此很难用于烟草丛顶病4种病原物的准确诊断。由于TBTV、Sat-TBTV 和TVDVaRNA不编码外壳蛋白，没有粒体结构，电镜技术和常规血清学技术无法用于这3种 烟草丛顶病病原物的检测鉴定；电镜技术仅能观察到病毒的粒体形态，很难准确鉴定出病 毒种类，且设备昂贵，不适合作为TVDV检测的普通方法。TVDV的基因组能够编码外壳蛋白， 病毒具有完整的粒体结构，可以用来作为抗原制备抗血清，但由于TVDV的分布局限于韧皮 部，且病毒含量较低，不易直接从病株里提纯到病毒粒子，因此目前国内外尚无有关TVDV 抗血清方面的报道。分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性强、灵 敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能检测一种病毒，对于多种病原物复合侵染的情况，则 需要针对每种病毒进行单独检测，工作量大，成本高，且效率低。
本发明采用一步法RT-PCR，针对烟草丛顶病的4种病原物，分别设计4对烟草丛顶 病病原物的特异性引物，可通过一次PCR检测出4种烟草丛顶病的病原物，具有高效、快速、 特异、灵敏及节约时间和减少成本等优点。
发明内容
本发明克服了现有技术在对烟草丛顶病多种病原物复合侵染烟草和传毒介体昆虫 进行检测时的不足，提供了一种高效、灵敏、特异且低成本的检测烟草及传毒介体昆虫中 TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 4 种病原物的方法。本发明的技术方案为同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照 下面步骤进行
(1)引物设计合成
(a)分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的正向引物 TBTVdF、TVDVdF、 SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下
TBTVdF :5’ -TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，
TVDVdF :5’ -GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，
SatTBTVdF :5’ -TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，
TVDVaRNAdF :5’ -GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，
(b)分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的反向引物 TBTVdR、TVDVdR、 SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下
TBTVdR :5’ -CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，
TVDVdR :5’ -CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的 R=A 或 G，
SatTBTVdR :5’ -TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，
TVDVaRNAdR :5’ -TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’ ；
(2)CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；
(3)一步法RT-PCR扩增；
(4)电泳检测；
(5)检测结果分析根据每对引物扩增片段大小与病毒的关系，观察感染TBTV、 TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的烟草材料或传毒介体昆虫中检测到的不同核酸带，判断发病 烟草或传毒介体昆虫中具体感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV病原物的种类。所述CTAB法提取感病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，步骤如下
第一步、样品准备
(1)感病植物组织准备将3飞片病叶叠加在一起，称取5(Tl00mg至研钵中；
(2)传毒介体昆虫准备取3(T50头蚜虫至研钵中；
第二步、加入1. 2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2 %的CTAB、2 %的 PVP-40 以及 pH 8. 0 的 100 mM 的 Tris_HCl、l. 4 M 的 NaCl 和 20 mM 的 EDTA 组成混合液， 最后根据混合溶液的体积加入0. 2%巯基乙醇；
第三步、恒温处理充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，在65°C温浴下处理15飞0
min ；
第四步、离心处理首先，将离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理15 min,取750 U L上清液至另一 1. 5 mL的离心管，加入750 iiL体积比为24 1的氯仿异戊醇，涡旋震荡混匀30 s ;然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/ min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 yL上清液至又一 1.5 mL的离心管中， 并加入600 UL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液 和异丙醇的离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出 上清液；沉淀部分加入500 uL 70 %乙醇，并放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理 10 min ；
第五步、干燥用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20°C 25°C条件下自然干燥1(T15
min ；
第六步、溶解加入100 UL 20 mmol/L pH8. 0的Tris_HCl并置于冰上10 min，用微 量移液器吹打5 10次使沉淀部分充分溶解；
第七步、保存核酸沉淀溶解液-20°C保存备用；或者将所获得的总核酸以干粉状态放 入-80°C进行长期保存备用。所述一步法RT-PCR采用宝生物工程(大连)有限公司生产的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒，反应体系为 15 ML，由 0. 6 ML 的 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7. 5 ML 的 2X1 Step Buffer、各 0.6 ML 的 10 ii M 正反向引物 TBTVdF 和 TBTVdR、各 0. 5 ML 的 10 ii M 正反向引物 TVDVaRNAdF 和 TVDVaRNAdR、各 0. 4 ML 的 10 uM 正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0. 3 ML的10 uM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、 2. 8 ML的ddH20和0. 5 ML的RNA模板混合而成。所述一步法RT-PCR的反应条件为在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度 为50°C，反应时间30 min ;然后在温度为94°C时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在 94°C进行变性30 sec，在温度55°C 60°C间进行退火处理30 sec，然后，温度控制在72°C， 延伸1 min，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72°C再延伸10 min后的PCR产物在温 度_4 °C进行保存。
在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制1. 0 %的琼脂糖凝胶，在配好的 凝胶中每100 mL加入5 ML Gold View染色剂混匀。在0. 5 X TBE缓冲液环境中，90 V稳 压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。所述的检测引物扩增片段大小与所检测病原物的对应关系如表1所示
权利要求
1.同步检测TBTV、TVDV,Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，同步检测按照下面步骤进行 (I)引物设计合成 (a)分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的正向引物 TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下TBTVdF :5’ -TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，TVDVdF :5’ -GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，SatTBTVdF :5’ -TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，TVDVaRNAdF :5’ -GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，(b)分别设计合成检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的反向引物 TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下TBTVdR :5’ -CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，TVDVdR :5’ -CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的 R=A 或 G，SatTBTVdR :5’ -TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，TVDVaRNAdR :5’ -TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’ ； (2)CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，作为RT-PCR扩增模板； (3)ー步法RT-PCR扩增； (4)电泳检测； (5)检测结果分析根据每对引物扩增片段大小与病毒的关系，观察感染TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的烟草材料或传毒介体昆虫中检测到的不同核酸带，判断发病烟草或传毒介体昆虫中具体感染的TBTV、TVDVaRNA, Sat-TBTV和TVDV病原物的种类。
2.根据权利要求I所述的同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物组织或传毒介体昆虫的总核酸，步骤如下 第一歩、样品准备 (1)感病植物组织准备将3飞片病叶叠加在一起，称取5(Tl00mg至研钵中； (2)传毒介体昆虫准备取3(T50头蚜虫至研钵中； 第二歩、加入I. 2 mL的CTAB缓冲液，该缓冲液由质量百分比为2 %的CTAB、2 %的PVP-40 以及 pH 8. O 的 100 mM 的 Tris-HCl、I. 4 M 的 NaCl 和 20 mM 的 EDTA 组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0. 2%巯基こ醇； 第三步、恒温处理充分研磨后，转入I. 5 mL的离心管中，在65°C温浴下处理15飞0min ； 第四步、离心处理首先，将离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理15min,取750 U L上清液至另ー I. 5 mL的离心管,加入750 iiL体积比为24 I的氯仿异戊醇，涡旋震荡混匀30 s ;然后，再将装有上清液的离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理10 min，接着，用微量移液器吸取600 U L上清液至又一 I. 5 mL的离心管中，并加入600 UL异丙醇，颠倒离心管充分混匀液体，室温下放置10 min，最后将装有上清液和异丙醇的离心管放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 UL 70%的こ醇，并放入离心机中1200(Tl3000 r/min离心处理 10 min ；第五步、干燥用微量移液器吸出液体，沉淀部分在20°C 25°C条件下自然干燥1(T15min ； 第六步、溶解加入100 UL 20 mmol/L pH 8. 0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5 10次使沉淀部分充分溶解； 第七步、保存核酸沉淀溶解液-20°C保存备用；或者将所获得的总核酸以干粉状态放入-80°C进行长期保存备用。
3.根据权利要求I所述的同步检测TBTV、TVDV,Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述ー步法RT-PCR采用宝生物工程大连有限公司生产的PrimeScript One StepRT-PCR Kit Ver. 2 试剂盒，反应体系为 15 ML,由 0. 6 M-L 的 PrimeScript I Step EnzymeMix,7. 5 ML 的 2X1 Step Buffer、各 0. 6 ML 的 10 y M 正反向引物 TBTVdF 和 TBTVdR、各0.5 ML的10 UM正反向弓丨物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0. 4 ML的10 u M正反向弓I物 SatTBTVdF 和 SatTBTVdR、各 0. 3 ML 的 10 u M 正反向引物 TVDVdF 和 TVDVdR、2. 8 ML 的ddH20和0. 5 ML的RNA模板混合而成。
4.根据权利要求I所述的同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述ー步法RT-PCR的反应条件为在由RNA合成cDNA的RT-PCR反应中控制温度为50°C，反应时间30 min ;然后在温度为94°C时，保持2 min，使RTase失活；温度控制在94°C进行变性30 sec，在温度55°C飞(TC间进行退火处理30 sec，然后，温度控制在72°C，延伸Imin，从变性到延伸共计进行30次循环，最后72°C再延伸10 min后的PCR产物在温度_4°C进行保存。
5.根据权利要求I所述的同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，在电泳检测中采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配制I. 0 %的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 mL加入5 ML Gold View染色剂混匀，在0.5 X TBE缓冲液环境中，90 V稳压电泳60 min，然后于凝胶成像仪观察拍照。
全文摘要
本发明涉及一种同步检测TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，属植物保护领域。通过分别设计合成TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA正反向引物，CTAB法提取染病植物组织或传毒介体昆虫总RNA，采用一步法四重RT-PCR，达到对这4种病原物的同步快速检测。所设计的引物特异性强，能同时扩增出4种病原物。用CTAB法提取染病植物组织及传毒介体昆虫的总RNA，既能保证所提RNA的质量，也能降低检测成本。反转录与多重PCR一步完成，极大地节约了检测时间。本发明具有快速、高效、特异性强、灵敏度高和成本低廉等优点，能一次实现对与烟草丛顶病相关的4种病原物的同步检测，具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/70GK102952901SQ20121049217
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者李凡, 刘芳, 陈海如, 谭冠林, 兰平秀, 王海宁, 李晓静, 朱静, 吴德喜, 蔡红 申请人:云南农业大学