专利名称：一种植酸酶及其重组表达工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种植酸酶及其重组表达工程菌株。
背景技术：
植酸酶(Phytase)即肌醇六憐酸水解酶(Myo-i-nositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称(黄遵锡，1999，食品与发酵工业)。植酸酶是一种糖蛋白，在植物、反刍动物、许多微生物包括酵母、霉菌、细菌中都能产生植酸酶。它能够解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值。植酸酶作为一种新型饲料添加剂，在动物生产以及在环境保护中，都有重要的应用价值。然而植酸酶在天然材料中表达水平较低，加之天然植酸酶的某些生物学特性(如热 稳定性，抗蛋白酶特性等)不能完全适合饲料加工的要求。随着生物技术的飞速发展，采用基因工程的手段，使酶的高产优质成为可能，成为酸酶研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种植酸酶及其重组表达工程菌，通过构建含有植酸酶基因的表达载体，转入黑曲霉(Aspergillus niger)中，获得高效表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株。本发明重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，能有效提高养殖动物的生产性能和对磷的吸收能力，从而减少磷的排放量，增加养殖效益。本发明的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: I。用于编码上述植酸酶的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。本发明涉及一种黑曲霉工程菌，为黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-1)，该工程菌携带有能表达黑曲霉植酸酶基因的表达载体，已于2012年12月5日，保藏于位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2012502。本发明另一方面涉及上述黑曲霉工程菌的应用，用于生产植酸酶。本发明另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明重组表达的植酸酶能有效提高肉鸡生产性能。在日粮中添加本发明重组表达的植酸酶，肉鸡各期平均日增重、料肉比都优于对照组，并且优于国外某植酸酶产品。本发明的植酸酶能提高肉鸡对磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10. 7%以上，从而有利于增加养殖效益。
图I :pVL_phy 质粒图谱。图2 :黑曲霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指处即为重组表达的植酸酶。
具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例I黑曲霉植酸酶基因的克隆I. I提取黑曲霉的总基因组DNA将黑曲霉过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；力口A 400 u I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u LlOMNH 4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心IOmin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ；13000 rpm离心IOmin,弃上清；用70%乙醇洗漆2次；晾干,加入水溶解,于_20°C保存。I. 2基因克隆以I. I中提取的基因组总DNA为模板，利用如下的引物对进行扩增，引物对的上下游引物序列如下上游引物序列为GCTCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA；下游引物为GCTCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA；PCR 扩增条件为 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 个循环；72°C7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。经北京华大基因研究中心测序分析，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:3第45-146位是内含子，去掉该内含子的cDNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: I。实施例2黑曲霉工程菌的构建2. I表达载体构建对I. 2中得到的PCR产物先进行Xba I单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5 a ;然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-pPhy，质粒图谱见图I。2.2原生质体制备接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约IOOmLCMA (2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0. 1%细菌蛋白胨)的液体培养基中，30°C，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小时；取出酶解液，加入0. 8M MgSO4溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm,离心10 min;弃上清，加10 mL I. 2M山梨醇悬浮，然后3000 rpm,离心10 min ；加适量山梨醇悬浮分装(200 ML/管，IO8个/mL)。2. 3转化与验证取10吒Phy-pGAMD DNA加入到200ML原生质体中，接着加入50ML 25%PEG轻轻混匀，室温静置20 min ;然后加2mL 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(0. 059%乙酰胺，0. 152%KH2P04，0. 34%CsCl，0. 052%KC1,1%葡萄糖，21. 85%山梨醇，0. 35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板(0. 059% 乙酰胺，0. 152%KH2P04,0. 34%CsC1,0. 052%KC1,1% 葡萄糖，1% 琼脂粉)，30°C黑暗培养数天至转化子长出。按照实施例I中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例I中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30个循环；72°C 7min。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，验证阳性转化子。所获得工程菌命名为黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-I)，于2012年12月5日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO: M 2012502。实施例3发酵与酶活测定3. I摇瓶表达将黑曲霉工程菌(CCTCC NO: M 2012502)接种于50mL黑曲霉发酵培养基(1.2%NaN03，0. 05% KCl, 0. 15% KH2PO4,0. 205% MgSO4 7H20，0. 35% NaH2PO4 H20，7% 柠檬酸钠，4. 5%胰蛋白大豆肉汤，微量元素lmL，4. 1%葡萄糖)，30 0C培养4_5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析，结果如图2所示，箭头所指处即为重组表达的植酸酶，重组蛋白大小与预测的一致。3.2酶活测定酶活定义在温度为37°C、pH为5. 0的条件下，每分钟从浓度为5. Ommol/L植酸钠中释放I U mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。测定方法准确称取0. 6804g在105°C烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5. 9)于IOOml容量瓶中，用乙酸缓冲液(5. I)溶解，并定容至100ml，浓度为50. Ommol/L。按表I的比例用乙酸缓冲液(5. 2)稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax + b )。反应后的试样在水浴中静置IOmin，在离心机(6. 7)上以4000r/min离心IOmin，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6. 3)415nm波长处测定样品空白(Atl)和样品溶液(A)的吸光值，A-Atl为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。植酸酶活性按下式计算U=FXC / (mX30)式中U —试样中植酸酶的活性，U/gC -根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U。F -试样溶液反应前的总稀释倍数。m —试样质量，g。30 —反应时间，min。采用上述方法测得黑曲霉工程菌摇瓶发酵上清液酶活约为280U/mL。本发明的工程菌能够高效稳定的表达植酸酶，而且，该工程菌在多次传代后，还能保持遗传上的稳定性。因此，本发明构建的菌株具有很好的应用前景。实施例4重组表达的植酸酶对肉鸡生产性能及钙磷代谢的影响4. I 材料植酸酶本发明重组表达的植酸酶，5000U/g。国外某著名厂家植酸酶产品，每Ig含植酸酶5000U。
试验动物山东六和集团种鸡场罗斯肉鸡。4. 2试验方法试验选择健康、体重均匀的AA肉雏鸡576只，共分4个处理组，每个处理组144只肉鸡，每个处理组6个重复，每个重复24只鸡。试验分0 18d、18 35d两个饲养阶段，分别饲喂处理A (正对照组)、处理B (负对照组)、处理C(添加本发明重组表达的植酸酶)和处理D (国外某植酸酶产品)组日粮。各处理组日粮配方及营养成分见表I、表2。表I基础饲粮配方及营养水平
权利要求
1.一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:lo
2.用于编码权利要求I所述的植酸酶的核苷酸，其序列为SEQID N0:2。
3.用于表达权利要求I所述植酸酶的黑曲霉工程菌，其保藏编号为CCTCCNO: M2012502。
4.权利要求3所述的黑曲霉工程菌在生产植酸酶中的应用。
5.权利要求I所述的植酸酶作为饲料添加剂的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物工程技术领域，具体提供了一种植酸酶，并构建了重组表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株，保藏编号为CCTCC NO: M 2012502。该工程菌株能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，提高养殖动物对磷的吸收能力，增加养殖效益，同时减少磷的排放，有利于环境保护。
文档编号C12R1/685GK102978179SQ201210525629
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者黄亦钧, 许丽红, 张慧丹, 张青, 徐娟 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司