专利名称：一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法
技术领域：
本发明涉及黄酒酿造技术，尤其涉及一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法。
背景技术：
黄酒在中国有着悠久的历史，是世界三大酿造酒之一，有着丰富的营养价值、药用价值及保健功效，备受人们的青睐。传统黄酒黄酒是以大米、糯米或黍米为原料，加入麦曲、 酒母边糖化边发酵而生产的一种酿造酒。由于发酵菌株种类多，黄酒香气浓郁，甘甜味美， 风味醇厚，并含有氨基酸、糖、醋、有机酸和多种维生素等。具有中国特色的黄酒一直是人们的消费热点，但是在黄酒的酿造过程中，会自发产生一种致癌物质——氨基甲酸乙酯。
氨基甲酸乙酯，又称脲烷，是一种在试验动物甚至人体内造成多位点致癌的物质， 与丙烯酰胺同等危险。研究表明，对啮齿类动物，氨基甲酸乙酯是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。国际食品法典添加剂和污染物专门委员会(CCFAC) 于1999年将氨基甲酸乙酯列入优先名单，世界卫生组织的国际癌症研究机构也在2007年将其归为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯威胁着人们的身体健康，已成为近年来社会高度关注的食品安全问题。
氨基甲酸乙酯是伴随发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等)和酒精饮料(如葡萄酒、苹果酒、啤酒、中国黄酒和日本清酒等)酿造过程中，由氨甲酰类化合物与乙醇自发反应所生成。黄酒的酿造过程中所产生的瓜氨酸、尿素、氨甲酰磷酸等氨甲酰类化合物与乙醇发生反应，生成氨基甲酸乙酯。世界上很多国家都制定了食品及酒类氨基甲酸乙酯的限量标准。早在1985年，加拿大卫生与防疫部门对氨基甲酸乙酯含量规定了强制性限量标注佐餐葡萄酒30 μ g/L,蒸馏酒150 μ g/L,烈性酒和水果白兰地400 μ g/L,日本清酒 100μ g/L。目前我国尚未制定酒精饮料和发酵食品中氨基甲酸乙酯限量标准，但随着我国人民生活水平的提高，食品安全早已成为人们关注的焦点，而频频曝出因氨基甲酸乙酯含量超标所引发的黄酒出口贸易问题，也影响了我国传统酿酒行业的持续健康发展。
现阶段，对于酒类酿造过程中氨基甲酸乙酯含量的控制主要通过低产尿素酵母菌株的选育。清酒发酵中为了达到降低精氨酸代谢的目的，采用了基因敲除原理构建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，在清酒酿制过程中未发现尿素的积累，但细胞生长速度受至丨J显著抑制(Beltran G, Novo M, Rozes N, et al. Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiaeduring wine fermentations[J]. FEMS Yeast Research,2004, 4 :625-632.)。另外，由于食品安全和生物安全性原因，基因工程菌株在食品生产中的应用越来越受到限制。
目前，使用酸性脲酶控制酒类成品中尿素含量的研究较多，周建弟等在黄酒压榨、勾兑后的成品酒中添加脲酶，经一定时间处理后在煎酒时利用高温破坏脲酶的残余活力(周建弟，丁关海，郑志强.酸性脲酶分解黄酒中尿素特性的研究.中国酿造，2006， 164(11) :45-46.) ;Liu等在黄酒成品酒中添加酸性脲酶以研究酸性脲酶对成品酒中尿素的降角军情况(Jun Liu, et al. Optimization production of acid urease by nterobacter sp. in an approach toreduce urea in Chinese rice wine. Bioprocess Biosyst Eng, 2012,35 :651-657)。这些研究都是在发酵好的黄酒成品酒中添加脲酶，以降低成品酒中尿素含量，从而可控制黄酒储藏过程中氨基甲酸乙酯的生成，但不能抑制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的生成；同时，这种处理方式在添加脲酶后，需要进行一段时间的酶解处理，工艺步骤繁琐，且费时费力。
宝菊花在制备葡萄酒时，在发酵前的葡萄汁中添加脲酶，然后进行酿造制酒(宝菊花.氨基甲酸乙酯在葡萄酒中的含量的变化及研究.天津科技大学，2008，天津.)，但该方法针对的是葡萄酒，葡萄酒的酿造工艺与黄酒不同，两者可比性不大；同时，其使用的发酵剂是单一酵母，对于多菌株发酵的传统黄酒，可参考性不强。
传统黄酒的发酵菌株种类多，酿造时多种前体物质都会被催化，酿造过程中易产生较多的氨基己酸乙酯；且多菌株对脲酶活性影响复杂，工艺较难控制。同时，游离的酸性脲酶在发酵液中的活力不持久，难以贮存，虽然酸性脲酶的固定化技术克服了上述缺点，却存在着酶的活力损失甚至丧失的问题，造成了在生产使用过程中酸性脲酶对氨基甲酸乙酯的抑制效果不稳定等难题。发明内容
本发明提供了一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法，脲酶活性持久、对氨基甲酸乙酯抑制效果较好，能有效克服传统黄酒制备时尿素含量过高、发酵剂成分复杂激发的酿造过程氨基甲酸乙酯形成的问题。
一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭窝、加曲加水、发酵和后处理，落缸搭窝时加入酒药；落缸搭窝后第5 10天向发酵液中添加脲酶。
尿素是酒类中氨基甲酸乙酯形成是主要前体物，随着前体物含量的增加，氨基甲酸乙酯含量也很可能随之增加(Schehl B, Senn T, LachenmeierDff, et al. Contribution of the fermenting yeast strain to ethyl carbamategeneration in stone fruit spirits[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2007, 74(4) :842-850. ；Uthurry CA, SuarezLepe J, Lombardero J, et al. Ethylcarbamate production induced by selected yeasts and lactic acid bacteria in redwine[J]. Food Chemistry,2006,94 262-270.)。研究发现，精氨酸降解产生瓜氨酸、尿素或氨甲酰磷酸，这些物质能与发酵产生的乙醇作用，自发形成氨基甲酸乙酯。本发明从降低尿素含量这一思路出发，在黄酒酿造中合适的工艺阶段添加适量的脲酶作为抑制剂，以降解前体物尿素，从而降低黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的生成。
传统黄酒的酿造工艺可以采用淋饭法，具体流程见如图I所示。
所述的浸米为将米(主料)置于水中浸泡。所述的米可以为糯米、粳米和籼米中的至少一种；以每千克米计，水的用量为I. O I. 5L ;所述的浸米温度为25 30°C ;所述的浸米时间可以为I 20天，具体浸米时间可以根据米质、水温不同而有所差异，一般在 18 20天,也可短至I 2天。
所述的蒸饭为保留附着在米上的水进行蒸煮，得到米饭。
所述的淋水为用洁净的冷水从蒸熟的米饭上淋下，使其降温至适合微生物繁殖的发酵温度，一般应为26°C 32°C。
所述的落缸搭窝为将酒药和米饭在发酵缸内混合均匀，搭成凹形窝。落缸前，应先把发酵缸清洗干净并用沸水灭菌；落缸时加入酒药，使酒药与米饭充分拌匀后搭成凹形窝。其中，所述的酒药的添加量为米重量的O. 1% 0.5% ;优选为0.2%。酒药添加过多会大量消耗营养物质，以至于不足以支持微生物完成完整的发酵过程，添加过少达不到发酵效果，故优选为O. 2%。
所述的加曲加水为在落缸搭窝后30 40小时(优选36小时)向发酵缸内添加麦曲和水，搅拌均匀。落缸搭窝30 40小时后即完成来娘，此时即可添加麦曲和水开始发酵。其中，所述的麦曲的添加量为米重量的6% 18%，优选为10% ;以每千克米计，所述的水的添加量为I. O I. 5L，优选为I. 2L。麦曲的添加量优选为10%也是为了保证发酵的正常进行。
所述的发酵包括开耙发酵、主发酵和后发酵三个过程。整个发酵过程中，发酵温度控制在25°C 30°C，整个发酵时间为25 35天。
在落缸搭窝后第5 10天向发酵液中添加脲酶，即在发酵的前期添加，配合整个发酵过程，可有效降解发酵液中的尿素，抑制氨基甲酸乙酯的生成。
其中，所述的脲酶的添加量为80 800U/lkg米；优选为80 150U/lkg米或 560 640U/1 kg米；更优选为120U/1 kg米或600U/lkg米。脲酶添加量过少，达不到抑制效果；同时，试验结果表明，添加量过多，对氨基甲酸乙酯的抑制效果反而不好，且会影响黄酒的风味。
所述的脲酶的添加时间优选为落缸搭窝后第7 9天；更优选为落缸搭窝后第8 天。经过前期研究表明，在该时间添加脲酶抑制效果较好。尿素主要由酵母菌产生，而发酵初期是霉菌进行糖化作用，故不宜在发酵初期添加；发酵后期由于已产生了大量尿素，此时添加脲酶作用效果不如前期明显。
所述的后处理包括榨酒、澄清、煎酒。
所述的煎酒温度为85 90°C，煎酒时间为25 35min。由于脲酶在60°C下处理 45min即失活，采用该煎酒条件，不需额外工艺就能较好地破坏脲酶残余活力，使成品黄酒具备良好风味。
本发明中，所述脲酶的酶活定义为在25°C，pH7. O的条件下，每分钟分解尿素产生I μ mol NH3所需要的酶量定义为一个酶活单位。
本发明在传统黄酒的酿造过程中，在合适的工艺阶段添加适量的脲酶降解发酵液中的尿素，有效抑制了酿造过程中氨基甲酸乙酯的生成。
与现有技术相比较，本发明的有益效果为
(I)脲酶易于获得，使用方便，用量易控制。
(2)按照常规传统黄酒的酿造工艺，在发酵阶段添加脲酶，酶促反应与发酵过程配合即可实现对尿素的降解，不需额外的酶解工艺，操作方便，适于规模化生产。
(3)脲酶对尿素的降解效率高，能有效抑制酿造过程中氨基甲酸乙酯的产生，且由于成品酒中尿素含量降低，还能有效减少黄酒储藏中氨基甲酸乙酯的积累；同时，脲酶的添加在一定程度上还能提高乙醇含量，保证黄酒酒精度。
(4)脲酶分解尿素产生氨气和二氧化碳，安全无毒害；且脲酶用量少，残余活性也在煎酒时丧失，不会影响黄酒风味。
图I为本发明中传统黄酒的酿造工艺流程图。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。
I、以下实施例中选取糯米作为酿造原料，具体酿造工艺为
(I)浸米将糯米与水按I : I. 2的比例(即糯米I. 25kg，洁净水I. 5L)混合，在 28°C下浸米2天。
(2)蒸饭待米粒松软后，保留附着在大米上的水进行蒸煮，得到米饭。
(3)淋水取煮熟后的糯米淋水，从上到下，可重复回淋，注意控制回热温度在 30。。。
(4)落缸彳合窝待淋后品温下降到30 C后，进彳丁落缸彳合窝。落缸如，应先把发酵缸清洗干净并用沸水灭菌；落缸时加入酒药，使酒药粉与糯米充分拌匀后搭成凹形窝；其中， 酒药的添加量为糯米重量的O. 2%。
(5)加曲加水落缸36小时养窝结束后，完成来娘；此时加入麦曲和水，搅拌均匀， 开始发酵；其中，麦曲的添加量为米重量的10% ;以每千克米计，水的添加量为I. 2L。
(6)发酵随后糖化菌、酵母菌迅速繁殖，每隔一段时间开耙发酵，防止温度过高致使微生物死亡，一般4小时以后开头耙，10小时后开二耙，以后每天开耙一次，4次过后转入后发酵；整个发酵过程控制温度在28°C，发酵30天；
(7)后处理榨酒、澄清、煎酒；其中，煎酒温度为85 90°C，煎酒时间为30min。
酿造过程中，在步骤(4)落缸搭窝(即加入酒药)后第8天向发酵液中添加适量酶活的脲酶作为抑制剂。
2、氨基甲酸乙酯的测定方法如下
取等50mL体积的黄酒样品与50mL乙酸乙酯混匀，萃取后的液体于55°C旋转蒸发浓缩样品，蒸干后加入5mL 30%甲醇。取O. ImL I. 5mol/L的盐酸和O. 2mL O. 01mol/L的占吨醇正丙醇溶液与ImL上述样品混合，放置30min左右，待充分反应后进样。用高效液相色谱荧光检测(HPLC-FLD)检测氨基甲酸乙酯的含量。
反相液相色谱法(HPLC)，主要步骤色谱柱为C18反相柱(250 X 4. 6mm，4 μ m)。色谱条件流动相为甲醇和水；激发波长233nm，发射波长600nm ;柱温35°C;进样量20 μ I ;跑样时间55min,梯度洗脱。准确称取3. 6mg氨基甲酸乙酯标准品,用30%甲醇定容至200mL, 配制成18 μ g/mL的标准储液。分别吸取2. 5mL、l. OmL,O. 5mL、0. ImL的标准储备液用30% 甲醇定容至IOmL,得到浓度为4. 5 μ g/mL、I. 8 μ g/mL、0. 9 μ g/mL、0. 18 μ g/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液。取配制好的标准溶液各Iml于洁净干燥的进样瓶中进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得氨基甲酸乙酯的线性回归方程为A = 12419C-1666.9(R2 = O. 9996)。
实施例I
对照组酿造过程中不添加脲酶；
实验组I :在落缸搭窝后第8天添加脲酶，脲酶的添加量为120U/lkg米；
实验组2 :在落缸搭窝后第8天添加脲酶，脲酶的添加量为600U/lkg米。
每隔2天取样分析，测定发酵液中氨基甲酸乙酯(EC)含量，结果见表I。结果可知，添加脲酶作为抑制剂的实验组中氨基甲酸乙酯含量低于自然发酵的对照组，抑制效果明显；且实验组I的抑制效果优于实验组2。
表I脲酶对黄酒发酵中氨基甲酸乙酯含量的影响
权利要求
1.一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭窝、加曲加水、发酵和后处理，落缸搭窝时加入酒药；其特征在于，落缸搭窝后第5 10天向发酵液中添加脲酶。
2.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的落缸搭窝为将酒药和米饭在发酵缸内混合均匀，搭成凹形窝。
3.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的酒药的添加量为米重量的0.1% 0. 5%。
4.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的加曲加水为在落缸搭窝后30 40小时向发酵缸内添加麦曲和水，搅拌均匀。
5.根据权利要求4所述的酿造方法，其特征在于所述的麦曲的添加量为米重量的6% 18%。
6.根据权利要求4所述的酿造方法，其特征在于以每千克米计，所述的水的添加量为1.0 I. 5L。
7.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的发酵温度为25 30°C，发酵时间为25 35天。
8.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的脲酶的添加量为80 800U/lkg 米。
9.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的脲酶的添加时间为落缸搭窝后第7 9天。
10.根据权利要求I所述的酿造方法，其特征在于所述的后处理包括榨酒、澄清、煎酒；所述的煎酒温度为85 90°C，煎酒时间为25 35min。
全文摘要
本发明公开了一种传统黄酒中抑制氨基甲酸乙酯产生的酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭窝、加曲加水、发酵和后处理，落缸搭窝时加入酒药；落缸搭窝后第5～10天向发酵液中添加脲酶。本发明方法在传统黄酒发酵阶段添加脲酶，酶促反应与发酵过程配合进行，不需额外的酶解工艺，操作方便，适于规模化生产；脲酶对尿素降解效率高，活性持久，能有效抑制酿造过程中氨基甲酸乙酯的产生，还能有效减少黄酒储藏中氨基甲酸乙酯的积累；且脲酶易获得，使用方便，用量易控制，其分解尿素产生氨气和二氧化碳，安全无毒害，残余活性也在煎酒时丧失，不会影响黄酒风味。
文档编号C12G3/02GK102978065SQ20121052550
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者陈启和, 方若思, 徐腾洋, 董亚晨, 范琳琳, 何国庆, 张俊 申请人:浙江大学