专利名称：一种质粒型腺病毒载体pAd-IGF2及其构建方法和应用的制作方法
一种质粒型腺病毒载体pAd-1GF2及其构建方法和应用技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种质粒型腺病毒载体pAd-1GF2及其构建方法和应用，该质粒型腺病毒载体腺病毒载体的构建以及在改造种子细胞和牛IGF2 功能鉴定的应用。
背景技术：
AdEasyTM系统是由T.C.He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒:先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是:1)、腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2)、基因组过大(36kb),难于操作。
在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。 在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-Ι进行同源重组。pAdEasy-Ι缺失了 El和E3 区，其El区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(ITR，Iaverted Termined Repeats),转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。
同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此该同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重 组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无 reCA、endA活性的细菌株如DH5a等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5 a不能用于腺病毒的同源重组。
与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需I 3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5 α中扩增后转入哺乳动物细胞293Α，最后将293Α细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。 最终得到的重组腺病毒只能在提供El区功能的293Α细胞中进行增殖。
一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需I小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而 AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。
Laere等(2003)研究发现，IGF2基因内含子3的3072位点的一单碱基突变 (G-A)正好位于高度保守的调控区域，影响猪骨胳中IGF2的表达，并且对出生后的肌肉形成起重要作用；这一突变的单核苷酸与瘦肉率存在相关性，可增加的瘦肉量。这一变异位点的发现引起众多学者的重视(Jungedus et al.2004 !Braunschweig et al.2004 ；Estelle et al.2005)。鼠的纤维原细胞体外实验结果表明，在IGFs信号通路中，1GF2的高表达可以刺激下游蛋白激酶B(Akt)丝氨酸(Ser)和IGF-1R跨膜苏氨酸(Tyr)的磷酸化，从而促进成肌因子(MyoD)家族的基因表达，使单核成肌细胞融合成多核肌管，最终形成肌肉;而当IGF2水平较低或抑制时，则阻碍肌肉生成(Wilson et al.2003)。IGFs系统由一组配体、受体和结合蛋白组成。配体包括胰岛素、IGF-1和2，IGF-1和2可促进细胞的有丝分裂和分化，抑制细胞凋亡，刺激DNA合成和细胞复制，诱导GO期静止状态的细胞进入Gl期，推动细胞依次经历细胞周期的各个时期(Laviola et al.2007)。相应受体为胰岛素受体、胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)，其中，IGF-1R可分别与IGF-1和IGF-2结合，但与IGFl的亲和力大于IGF-2，而IGF-2R则与IGF-2的亲和力高于IGF-1。结合蛋白共6种，即胰岛素样生长因子结合蛋白1 6 (IGFBPf 6)，其可为位于细胞外和细胞外周间隙的IGFs提供特异结合位点并调节IGFs和相应受体之间的相互作用。IGFs系统对胚胎、神经、骨骼肌和骨骼的发育、细胞增殖和转化等具有极其重要的作用(Russoet al.2005 ；Yamaguchi et al.2006),肌肉的生长发育与IGFs系统基因的时空特异性表达密切相关(Tilley et al.2007 ;唐中林等2008)。顾以韧等(2009)采用荧光定量PCR技术，检测了长白猪和梅山猪的背最长肌组织中IGFl和2、IGF-1R和2R、胰岛素样生长因子结合蛋白3和5(IGFBP3和5)基因mRNA丰度在初生(O月龄)、1、2、3、4和5月龄间的表达变化并分析品种间和不同月龄间基因表达的差异及其对肌肉生长发育的影响。结果表明:两猪种出生后IGFl mRNA表达量均表现为逐渐上调，而IGF2则恰好相反，表现为逐渐下调。这与IGF2主要在胚胎期发挥作用，而IGFl则主要在动物个体出生后才发挥促进细胞增殖和个体发育功能的特点相符。IGFRs mRNA与IGFs mRNA表达的发育性变化模式并不相似，提示背最长肌组织中IGFRs mRNA的表达可能没有受到组织局部产生的IGFs调节。长白猪的IGF-1R、IGF-2R和IGFBP_3mRNA表达量均在2月龄时达到最高峰，提示2月龄可能是长白猪IGFs系统发挥作用最为明显的生长发育阶段。在猪生长发育过程中胰岛素样生长因子系统基因表达的发育性变化模式和品种差异，为深入研究IGFs系统基因的相互调控机制提供了基础数 据。综上所述，在哺乳动物中，IGF2主要影响肌肉生长(IGF2基因内含子中的QTN位点可以提高猪肉产量提高了 3 4%)、心脏增大和脂肪沉积。通过秦川牛IGF2基因腺病毒载体的构建能够为秦川牛肉质性能、生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种提供重要的研究资料，最终为转基因动物的研究及秦川牛生长发育和牛肉品质的改善提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种质粒型腺病毒载体pAd-1GF2。本发明的第二个目的在于公开了上述质粒型腺病毒载体pAd_IGF2的制备方法。本发明的第三个目的在于公开了上述质粒型腺病毒载体pAd_IGF2的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种质粒型腺病毒载体pAd_IGF2，其中，所述质粒型腺病毒载体pAd_IGF2含有如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的秦川牛IGF2基因。
上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_IGF2，其中，所述质粒型腺病毒载体 pAd-1GF2是由秦川牛IGF2基因通过AdEasyTM系统构建所得。
上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_IGF2，其中，所述质粒型腺病毒载体 pAd-1GF2中的IGF2基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。
上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_IGF2，其中，所述质粒型腺病毒载体 pAd-1GF2中的IGF2基因起始密码子前含有Kozak序列；其中Kozak序列为GCCCACC。
上述技术方案所述的质粒型腺病毒载体pAd_IGF2，其中，所述质粒型腺病毒载体 pAd-1GF2中的IGF2基因起始密码子后含有6个His标签序列。
构建上述技术方案中任一技术方案所述质粒型腺病毒载体pAd_IGF2的方法，所述方法包括如下步骤:
(I)、将PCR扩增的IGF2基因片段连接到pGM_T载体，重组质粒pGM_T_IGF2和穿梭质粒pAdTrack-CMV分别经Kpn I和HindIII双酶切，将IGF2基因片段和pAdTrack_CMV 载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E.col i DH5 α感受态细菌，得到 pAdTrack-CMV-1GF2 重组质粒；
(2)、限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV_IGF2重组穿梭质粒，用线性化 pAdTrack-CMV-1GF2重组穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒E.col i BJ5183感受态细菌， 利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV_IGF2 和pAdEasy-Ι的同源重组，获得同源重组成功的携带IGF2基因的重组腺病毒质粒 pAd-1GF2。
上述 技术方案中所述的方法，其中，所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd_IGF2 用脂质体LIP0FECTAMINE2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。
上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体，作为秦川牛IGF2基因功能鉴定的应用。
上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体，作为细胞改造的应用。
上述技术方案中任一技术方案所述的质粒型腺病毒载体，作为肌肉生长发育调控的应用。
具体的:
PCR扩增IGF2后和pAdTrack-CMV穿梭质粒经Kpn I和Hind III双酶切，凝胶回收试剂盒回收IGF2基因片段和pAdTrack-CMV载体片段，回收的载体片段和目的基因片段T4DNA Ligase进行酶连反应。酶连产物转化E.coli DH5 α感受态细胞，纯化试剂盒抽提pAdTrack-CMV-1GF2重组穿梭质粒，Kpn I和Hind III双酶切鉴定证明获得正确的 pAdTrackCMV-1GF2 重组质粒。
限制性内切酶Pme I线性化pAdTrack-CMV_IGF2重组穿梭质粒，凝胶回收试剂盒回收线性化pAdTrack-CMV_IGF2重组穿梭质粒，转化含有pAdEasy-Ι质粒E.coli BJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中 pAdTrack-CMV-1GF2和pAdEasy-Ι同源重组获得携带IGF2基因的重组腺病毒质粒，将同源重组成功的重组腺病毒质粒命名为pAd-1GF2。试剂盒抽提同源重组质粒，0.7%琼脂糖凝胶电泳，选择比pAdEasy-Ι大的重组腺病毒质粒，Pac I酶切。酶切产物通过0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果与理论上同源重组质粒多克隆位点图谱吻合。pAd-1GF2重组腺病毒质粒转化E.coli DH5a感受态细胞，大量抽提质粒备用。pAd_IGF2重组腺病毒质粒用Pac I线性化暴露反向的末端重复序列，采用脂质体转染包装细胞(293A cells)进行病毒包装。转染24h后荧光显微镜直接观察，可见穿梭质粒带有的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达。重组病毒上清液感染293A细胞扩增重组腺病毒，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达。将重组腺病毒质粒pAd_IGF2感染牛原代肌肉细胞，检测过表达IGF2基因对牛肌肉细胞增殖分化和肌肉发育相关基因的表达模式的影响，是本发明质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为秦川牛IGF2基因功能鉴定的应用。牛IGF2基因的重组腺病毒质粒pAd_IGF2，可用于感染牛肌肉细胞，牛脂肪细胞，293细胞，C2C12细胞，3T3L细胞等细胞系，检测其对相应细胞结构和功能的影响，是本发明质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为细胞改造的应用。
将重组腺病毒质粒pAd_IGF2感染鼠C2C12细胞系，经过实时定量PCR和Westernbloting检测过表达IGF2基因对肌肉细胞增殖分化和肌肉发育标志基因(MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC)在牛肌肉细胞中的差异表达情况，是本发明质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为肌肉生长发育调控的应用。本发明具有以下有益效果:1、本发明构建了能够表达秦川牛IGF2基因的重组腺病毒载体，本发明所构建的载体，转染原代培养的秦川牛肌肉细胞后，可获得IGF2 mRNA的高效表达，为IGF2基因功能鉴定和改造细胞，调控代谢和生长发育奠定了基础。
:1、图1为PCR扩增的秦川牛IGF2基因；2、图2为秦川牛pGM-T-1GF2重组质粒Kpn I和Hind III双酶切鉴定；3、图3为pAdTrack-CMV_IGF2重组质粒双酶切鉴定；4、图4为pAd_IGF2重组腺病毒质粒pac I酶切鉴定；5、图5为pAd_IGF2质粒转染293A细胞5d ;6、图 6 为 pAd-1GF2 质粒转染 293A 细胞 IOd ；7、图7为pAd_IGF2质粒感染秦川牛原代肌肉细胞4d。
具体实施方式
:为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明质粒型腺病毒载体pAd-1GF2及其构建方法作进一步的说明。本发明利用质粒的体外酶切及连接技术，应用pAdEasy-Ι系统，将线性化的穿梭质粒转化含有pAdEasy-Ι质粒的E.coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,所得重组腺病毒质粒可以通过卡那霉素筛选出，并通过质粒大小和限制性内切酶分析鉴定。最后，Pac I酶切后的重组腺病毒质粒转染293A细胞包装产生重组腺病毒。实施例1:DAd-1GF2重组腺病毒质粒的构建:一、材料和方法:
1.1、仪器:
超净工作台、生化培养箱、基因扩增仪、PTC-200单槽梯度基因扩增仪、Heraeus冷冻高速离心机(德国)、Bio-Rad凝胶成像分析仪(USA)、C02培养箱、HZS-H水浴振荡器(哈尔滨)4 611(10忖移液器、0￥￥111型稳压稳流电泳仪(北京六一)、DYY-1II3IA和DYY-1II 28D 电泳槽(北京六一)、制冰仪、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋)、Eppend0rf台式高速离心机、Sartorious电子天平(德国)、常规冰箱等。
1.2、主要生化试剂和试剂盒:
Long Taq 聚合酶、PrimeSTAR DNA 聚合酶、DNA 限制性内切酶(Hind III,Pac 1、 Pme 1、Kpn I和Hind III等)、胶原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker、DNA连接酶、Trizol、反转录试剂盒、表达载体(pAdTrack-CMV、pAdEasy-Ι)、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、 胎牛血清、细胞培养基等。
1.3、培养基和抗性:
LB培养基:胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂粉；
抗性:氨苄青霉素，卡纳霉素等。
1.4、普通试剂:
肝素钠，Tris, EDTA, NaCl, NaOH，无水乙醇，醋酸钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，抗生素，溴化乙锭(EB)，溴酚蓝，二甲基苯菁FF ，乙酸，蔗糖，去离子甲酰胺，硝酸，盐酸，硝酸银， 无水碳酸钠，硫代硫酸钠，甲醒，硼酸，琼脂糖，KCl,Na2HPO4,KH2PO4,Tris饱和酚(pH = 8.0)， 氯仿，异戊醇，甘油，石蜡油。
1.5、秦川牛IGF2基因PCR引 物的设计(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成):
本研究参照GenBank公布的IGF2 mRNA序列(NM_174087.3)，设计引物:
上游引物:5，>CGGggtaccGCCCACCATGATGcatcatcatcatcatcacGGGATCACAGCAGGAAA G〈3，；
下游引物:5，>CCCaagcttTTAAGGTAATATTTCTTTTTCATTGC〈3，，
其中Kpn I，Hind III分别为上下游的酶切位点。
1.6、PCR扩增秦川牛的IGF2基因片段:
(I)、PCR总反应体系为50 μ L，见表1:
表I本发明的PCR反应体系
权利要求
1.一种质粒型腺病毒载体pAd-1GF2,其特征在于:所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2含有如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的秦川牛IGF2基因。
2.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2，其特征在于:所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2是由秦川牛IGF2基因通过AdEasyTM系统构建所得。
3.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2，其特征在于:所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2中的IGF2基因连接于穿梭质粒CMV启动子之下。
4.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2，其特征在于:所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2中的IGF2基因起始密码子前含有Kozak序列。
5.如权利要求1所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2，其特征在于:所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2中的IGF2基因起始密码子后含有6个His标签序列。
6.构建权利要求1至6中任一权利要求所述质粒型腺病毒载体pAd-1GF2的方法，所述方法包括如下步骤: (1)、将PCR扩增的IGF2基因片段连接到pGM-T载体，重组质粒pGM_T_IGF2和穿梭质粒pAdTrack-CMV分别经Kpn I和HindIII双酶切，将IGF2基因片段和pAdTrack-CMV载体片段利用T4DNALigase进行酶连反应，酶连产物转化E.coli DH5 α感受态细菌，得到pAdTrack-CMV-1GF2 重组质粒； (2)、限制性内切酶PmeI线性化pAdTrack-CMV-1GF2重组穿梭质粒，用线性化pAdTrack-CMV-1GF2重组穿梭质 粒转化含有pAdEasy-1质粒E.coli BJ5183感受态细菌，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-1GF2和pAdEasy-Ι的同源重组，获得同源重组成功的携带IGF2基因的重组腺病毒质粒pAd_IGF2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法还包括将重组腺病毒质粒pAd-1GF2用脂质体LIPOFECTAM INE2000转染后，在293A细胞中进行病毒包装。
8.权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为秦川牛IGF2基因功能鉴定的应用。
9.如权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为细胞改造的应用。
10.如权利要求1至5中任一权利要求所述的质粒型腺病毒载体pAd-1GF2作为肌肉生长发育调控的应用。
全文摘要
本发明一种质粒型腺病毒载体pAd-IGF2及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述质粒型腺病毒载体pAd-IGF2的构建方法包括(1)将秦川牛IGF2基因插入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒的CMV启动子之下，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-IGF2；(2)Pme Ⅰ线性化后转化含有pAdEasy-l质粒的E.col iBJ5183感受态细胞，利用E.coli BJ5183内Cre重组酶高效的同源重组系统，在细菌中完成pAdTrack-CMV-IGF2和pAdEasy-1的同源重组；将正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-IGF2；(3)pAd-IGF2经Pac Ⅰ酶切线性化后，脂质体转染293A细胞和秦川牛原代肌肉细胞，产生并获得重组病毒颗粒。本发明的质粒型腺病毒载体pAd-IGF2具有可应用于秦川牛IGF2基因功能研究、鉴定和对种子细胞进行改造，调控肌肉生长发育相关基因的代谢。
文档编号C12N15/861GK103205462SQ20121052534
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月9日 优先权日2012年12月9日
发明者陈宏 , 黄永震, 孙雨佳, 展召阳, 李密杰, 蓝贤勇, 雷初朝 申请人:西北农林科技大学