专利名称：一种分离、检测黄曲霉的培养基及方法
—种分罔、检测黄曲霉的培养基及方法技术领域
本发明属于微生物分离技术领域，尤其涉及一种分离、检测黄曲霉的培养基及方法。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)产生的代谢产物， 是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的是BI毒素，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质。黄曲霉毒素既有很强的急性毒性，导致肝脏坏死出血，使免疫系统受损，引起蛋白质营养不良症并导致儿童发育受阻；也有明显的慢性毒性，具有致癌、致畸、致突变作用，对人、家畜的健康威胁极大，因此受到世界范围的广泛关注。
据世界粮农组织估计，世界范围内有25%的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是黄曲霉毒素。在我国，农产品黄曲霉毒素污染已成为影响食品安全重要隐患之一。 2006年，国家疾病预防控制中心营养与食品安全所对我国部分农产品(包括玉米、花生)中黄曲霉毒素污染情况调查发现，从江苏、上海、浙江等九省市采集市售玉米中黄曲霉毒素的检出率为70. 27%，平均含量为36. 51μ g/kg，最高为1098. 36 μ g/kg，并有14. 86%的玉米样品中BI毒素含量超出国家食品法典限量标准。花生中黄曲霉毒素的检出率为24. 24%, 平均含量为80. 27μ g/kg，最高为437. 09μ g/kg，有3. 03%的样品中黄曲霉毒素含量超出国家限量标准。
2009年，农业部饲料质量监督检验测试中心(成都)对全国采集的1013份饲料样品检测发现,99. 51%的样品中检测出黄曲霉毒素，除山东省91份饲料的黄曲霉毒素BI检出率为94. 51%，其余各省的检出率均达100%，被检测样品中有2. 27%的样品黄曲霉毒素超标。2010年中山大学对310名男生尿液进行检测发现90名同学的尿液中黄曲霉毒素Ml 呈阳性。
2011年，蒙牛牛奶中黄曲霉毒素Ml超标，其原因是奶牛在食用霉变的饲料后，原奶中黄曲霉毒素Ml超标所致。可见，控制农产品黄曲霉毒素污染已经成为粮食安全和农产品质量安全中迫切需要解决的重大问题。
由于黄曲霉毒素污染所带来的巨大经济损失和健康危害，人们一直在努力探求黄曲霉毒素产生机理及防控方法。而研究材料黄曲霉菌株的获取成为各项研究工作开展的首要前提条件。由于从各类环境中收集的样品尤其是土壤中微生物数量多、种类杂，给黄曲霉的分离带来较大困难。因此建立一种省时省力、高效专一的从各类样品中筛选黄曲霉的方法，将会对黄曲霉毒素产生机理及防控的研究有很大帮助。发明内容
本发明提供了一种分离、检测黄曲霉的培养基，能高效快速地从土壤或农产品中特异分离黄曲霉。
一种分离、检测黄曲霉的培养基，配方为酵母提取物8 12g/L、蔗糖8 12g/L、 NaCl 75 85g/L、琼脂 25 35g/L、硫酸盐 O. 01 O. 03g/L、氯硝胺 O. 01 O. 03g/L、抗生素 O.05 O. 15g/L。
更优选的配方为酵母提取物9 llg/L、鹿糖9 llg/L、NaCl 78 82g/L、琼脂 28 32g/L、硫酸盐 O. 015 O. 025g/L、氯硝胺 O. 015 O. 025g/L、抗生素 O. 08 O. 12g/ L0
所述配方中，酵母提取物和蔗糖为微生物的生长提供必不可少的氮源和碳源。黄曲霉生命力强，生长速度快，酵母提取物和蔗糖已能满足其生长必需条件。但为了能从各种微生物环境复杂的样品中特异筛选黄曲霉，本发明在酵母提取物和蔗糖的基础上添加了一系列添加剂，使培养基具有选择性，有利于黄曲霉的筛选。所述添加剂为氯化钠、抗生素、 氯硝胺和硫酸盐。
筛选过程中，样品中细菌会影响黄曲霉的生长，而培养基中氯化钠和抗生素的存在可以有效抑制细菌的生长繁殖。
培养基的渗透压对细菌生长影响较大，当环境中渗透压大于胞内渗透压时，细菌就会因失水而停止生长或死亡。由于细菌与真菌细胞壁成分的差异，高浓度的氯化钠能抑制多种细菌的生长，而对真菌无影响或影响较小。
市售的抗生素种类多样，本发明选用链霉素。
同样地，为避免其他生长较快的真菌对黄曲霉分离产生干扰，本发明的培养基中添加了适量的氯硝胺，氯硝胺能抑制除黄曲霉外大多数真菌的生长。
除使用上述添加剂抑制杂菌的生长外，还可以添加适量无机盐促进黄曲霉的生长。研究表明，so42_在一定程度上能促进黄曲霉生长，因此，本发明的培养基中含有适量的硫酸盐。硫酸盐种类多样，较佳地为CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20或二者的混合物，更佳地为重量比为I : I的CuSO4 · 5H20和ZuSO4 · 7H20混合物。
由于所述的硫酸盐、杀真菌剂和抗生素均不耐高温，无法利用高温灭菌，需通过细菌滤器过滤除菌后再加入经高温灭菌的其他组分中。在一个具体实施方式
中，本发明所述培养基的配制方法为
(I)取酵母提取物，蔗糖，琼脂，氯化钠，完全溶解后定容，调节pH至7. 0，121°C灭菌 20min ；
(2)灭菌后待培养基温度降至65°C以下、未凝固前，加入经细菌滤器过滤除菌的 CuSO4 · 5H20(10g/L)溶液和 / 或 ZnSO4 · 7H20(10g/L)溶液，链霉素溶液(O. lg/mL)，氯硝胺溶液(4g/L);混匀后倒入已灭菌的培养皿中备用。
本发明还提供了一种从土壤或农作物中分离黄曲霉的方法，包括
(I)将土壤或农作物样品粉碎至细粉状；
(2)将细粉状样品分散于所述培养基中，静置培养。
为提高分离效率，优选地，在粉碎前将样品进行干燥处理。干燥处理能杀灭样品中大多数细菌。所述静置培养的温度优选为25 30°C，培养时间优选为4 7天。
待有菌落长出后，即可挑取单菌落到PDA培养基上培养，并对生长的菌落作进一步形态观察和显微鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为
(I)本发明的培养基简单易制，可从土壤或农作物样品中特异筛选黄曲霉，与现有分离曲霉的察氏培养基相比，专一性较高，大大提高了分离效率。
(2)现有技术中需先用无菌水洗涤样品获得原液，再进行黄曲霉的分离；而本发明方法将样品粉碎或研磨后直接用于黄曲霉的筛选，可同时对样品表面和内部的黄曲霉进行有效筛选，大大提闻了分尚效率。
(3)采用本发明培养基和方法获得的真菌菌落经形态鉴定、显微观察、分子水平检测证实均为黄曲霉，为后续相关研究工作的开展提供了必不可少的研究材料。
图I为土壤样品在PDA(IA)和本发明培养基(IB)上的菌落生长情况；
图2为玉米样品在PDA(2A)和本发明培养基(2B)上的菌落生长情况；
图3为挑取的单菌落在PDA培养基上的生长表型；
图4为光学显微镜(20倍)下黄曲霉分生孢子梗形态；
图5为光学显微镜(40倍)下黄曲霉分生孢子形态；
图6为黄曲霉菌株的PCR鉴定结果图。
具体实施方式
下面仅以土壤和玉米样品为例，详细说明黄曲霉的筛选方法，其他样品的黄曲霉筛选方法与土壤或玉米一致。
实施例I 土壤样品中黄曲霉的筛选
I、筛选培养基的配制
取IOg酵母提取物，IOg蔗糖，30g琼脂，80g氯化钠，溶于800mL去离子水中，调整 pH至7. 0，定容至992mL，121°C高压灭菌20min后，再加入用细菌滤器过滤除菌的10g/L硫酸铜(CuSO4 · 5H20) ImL, 10g/L 硫酸锌(ZnSO4 · 7H20) ImL, 4g/L 氯硝胺 5mL, O. lg/mL 链霉素 lmL。倒入灭菌的9cm培养皿中冷却备用。若暂时不用，可置4°C下保存。
2、黄曲霉筛选
(I)将采集土样室温晾干、在灭菌研钵中研磨至细粉状；
(2)称取O. Ig研磨好的烘干土样均匀分散在含有PDA和上述筛选培养基的培养皿中；
(3)28°C静置4-7天，观察菌落生长情况。
如图I所示,PDA培养基上布满杂菌，而在筛选培养基上出现黄曲霉的黄色放射状菌落，无细菌污染，仅有少数其它真菌生长。
实施例2玉米样品中黄曲霉的筛选
I、筛选培养基的配制
同实施例I。
2、黄曲霉筛选
(I)将玉米样品室温晾干、在粉碎仪中粉碎至细粉状；
(2)称取Ig粉碎好的样品均勻分散在含有PDA和上述筛选培养基的培养皿中；
(3) 28°C静置4-7天，观察菌落生长情况。
如图2所示，PDA培养基上虽长出黄曲霉的黄色放射状菌落，但也出现多种杂菌， 很难进行黄曲霉的分离；在筛选培养基上出现黄曲霉的黄色放射状菌落，无细菌污染，仅有少数其它真菌生长。
实施例3菌落分析
静置培养4 5天后，观察实施例1-2中筛选培养基上长出的菌落情况，如图I、图 2所示，培养基均无细菌污染，且有黄色放射状菌落长出。挑取单菌落，将其转移至PDA培养基上，28°C生长5天后，菌落呈黄色，表面呈粉末状(图3)。
挑取少量菌丝制片，置光学显微镜(20倍)下观察，观察结果如图4所示。视野下， 可看到分生孢子梗顶端膨大成球状，顶端着生成串的球形分生孢子，符合曲霉的形态特征。 挑取菌落表面粉末状的孢子制片，置光学显微镜(40倍)下观察，观察结果如图5所示。视野下，可观察到孢子呈球状，部分孢子仍成串。实施例4分子水平鉴定黄曲霉
黄曲霉与曲霉属中其他成员最主要的区别在于其次级代谢产物黄曲霉毒素，而黄曲霉毒素的合成则受产毒基因簇中一系列基因所调控。当该基因簇中某些基因缺失则不能正常编码黄曲霉毒素合成途径中所需要的酶，从而使黄曲霉毒素合成受阻，即成为不产毒菌株。通过研究发现，黄曲霉无论是产毒菌株还是不产毒菌株，位于产毒基因簇下游的基因glcA都不缺失。鉴于此，利用本发明的筛选培养基从土壤或玉米样品中分离得到的黄曲霉菌株中随机挑选产毒菌株与不产毒菌株各5株，提取基因组DNA，根据已报道的引物对 glcA-F 和 glcA-R 对 glcA 基因进行 PCR 扩增(Jiang et al. , 2009, Applied Microbiology and Biotechnology, 501-505),结果如图6所不，5株产毒素的菌株和5株不产毒素的菌株 PCR扩增后都能生成一条特异的754bp的条带，说明本发明培养基分离获得的菌株均为黄曲霉。
从以上分析得出本发明的筛选培养基和方法适用于从土壤、玉米等样品中特异有效地筛选得到黄曲霉，且不受细菌污染，其他真菌污染较少。为后续相关研究工作的开展提供了必不可少的研究材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种分离、检测黄曲霉的培养基，其特征在于，配方为酵母提取物8 12g/L、蔗糖8 12g/L、NaCl 75 85g/L、琼脂 25 35g/L、硫酸盐 0. 01 0. 03g/L、氯硝胺 0. 01 0.03g/L、抗生素 0. 05 0. 15g/L。
2.如权利要求I所述的培养基，其特征在于，配方为酵母提取物9 llg/L、蔗糖9 llg/L、NaCl 78 82g/L、琼脂 28 32g/L、硫酸盐 0. 015 0. 025g/L、氯硝胺 0. 015 0.025g/L、抗生素 0. 08 0. 12g/L。
3.如权利要求I 2任一所述的培养基，其特征在于，所述抗生素为链霉素。
4.如权利要求I 2任一所述的培养基，其特征在于，所述硫酸盐为CuSO4 5H20、ZuSO4 7H20或它们两者的混合物。
5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述硫酸盐为重量比I: I的CuSO4 CH2O和 ZuSO4 7H20。
6.一种从土壤或农作物中分离黄曲霉的方法，其特征在于，包括 (1)将土壤或农作物样品粉碎至细粉状； (2)将细粉状样品分散于权利要求I 5任一所述培养基中，静置培养。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，样品粉碎前进行干燥。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述静置培养的温度为25 30°C,培养时间为4 7天。
全文摘要
本发明公开了一种分离、检测黄曲霉的培养基，配方为酵母提取物8~12g/L、蔗糖8~12g/L、NaCl75~85g/L、琼脂25~35g/L、硫酸盐0.01~0.03g/L、氯硝胺0.01~0.03g/L、抗生素0.05~0.15g/L。本发明还公开了一种从土壤或农作物中分离黄曲霉的方法，包括将土壤或农作物粉碎至细粉状；将细粉状样品分散于所述培养基中，静置培养。与现有技术相比，本发明的培养基和方法简单易行，高效专一，大大提高了黄曲霉的分离效率。
文档编号C12N1/14GK102978124SQ201210525389
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者尹燕妮, 张承启, 杨倩倩, 马忠华 申请人:浙江大学