专利名称：高产叶黄素转基因小球藻及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种高产叶黄素转基因小球藻及其制备方法。
背景技术：
叶黄素是一种含氧类胡萝卜素，其在生物体内起着十分重要的作用。叶黄素具有抗氧化活性，能够预防癌症、心血管疾病和年龄相关黄斑变性等疾病。此外，作为一种天然色素，叶黄素可作为食品、医药和保健品的色素添加剂。目前，叶黄素主要来源于万寿菊，然而由于劳动力和土地成本提高，从万寿菊获取叶黄素受到一定限制。小球藻中含有丰富的叶黄素，而且小球藻具有生长速度快、可异养培养、易于进行规模化培养和藻种改良的优点，利用小球藻合成叶黄素越来越受人们的关注。目前，应用于小球藻转基因的方法有电转化法、基因枪法、PEG-CaCl2介导的转化方法和根癌农杆菌介导转化的方法。其中，根癌农杆菌介导的转化方法具有转化方法简单、成本低，能够将大片段的DNA转入细胞的转录活性区，且以低拷贝的形式整合和重组等特点。根癌农杆菌介导转化的方法已经成功应用于小球藻Chlorella vulgaris、衣藻、雨生红球藻、杜氏盐藻、裂壶藻和微拟球藻等微藻中。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因小球藻的方法。本发明提供的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因以IPP异构酶编码基因表达盒的形式导入目的小球藻；所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子；所述IPP异构酶编码基因表达盒的核昔酸序列具体为序列表中的序列I。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻；所述重组载体为将所述IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ;所述重组载体具体为将序列表中序列I插入PCAMBIA2301载体的HindIII和BamH I酶切位点间得到的载体。上述方法中，所述重组载体通过重组农杆菌导入目的小球藻；所述重组农杆菌为将所述重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。上述目的小球藻为小球藻STI002CGMCC No. 6951。由上述方法得到的转基因小球藻也是本发明保护的范围。
小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo. 6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ；所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子；所述IPP异构酶编码基因表达盒的核昔酸序列具体为序列表中的序列I。本发明的第三个目的是提供一种重组菌。本发明提供的重组菌，为将上述的重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。上述的转基因小球藻、上述的重组载体或上述的重组菌在制备叶黄素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第四个目的是提供一种生产叶黄素的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)无水乙醇超声破碎由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ；2)将所述溶液 A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。上述方法具体如下I)无水乙醇超声破碎转基因小球藻30min ;再加入20% (质量百分含量)KOH水溶液超声皂化(超声功率70%，温度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；2)将溶液A加入二氯甲烷和蒸馏水萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。本发明的实验证明，本发明将IPP异构酶编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的叶黄素含量和野生型小球藻相比最高提高30. 95% ；叶黄素产量和野生型相比最高提高36. 77%，为高产叶黄素小球藻。
图1为重组质粒pCAMBIA2301_idi的构建过程示意2为基因工程小球藻的表型鉴定结果左图为小球藻原生质体与农杆菌共培养后涂布于筛选培养基有藻落长出，右图为小球藻原生质体未与农杆菌共培养涂布于筛选培养基没有藻落长出图3为基因工程小球藻在筛选培养基中进一步鉴定图4为PCR验证基因工程小球藻中idi基因的插入情况图5为PCR验证基因工程小球藻中NPTII基因的插入情况图6为基因工程小球藻和野生型小球藻的生物量示意7为基因工程小球藻和野生型小球藻的叶黄素含量示意8为基因工程小球藻和野生型小球藻的叶黄素产量示意图
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。克隆载体pBluescript II SK+ Stratagene, Catalog Number#212205o双兀载体pCAMBIA2301 CAMBIA, Canberra, Australia。质粒pGAPZ a A :1nvitrogen, Catalog Number V205-20。农杆菌菌株LBA4404 :1nvitrogen, Catalog Number 18313-015。酶处理液由溶质和溶剂组成；溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5. 8);溶质及其浓度如下2% (质量百分比)纤维素酶,2% (质量百分比)蜗牛酶和O. 2M KCl0FC培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，牛肉浸膏 lg/L，酵母浸膏 lg/L，FeSO4 · 7H20 2mg/L。TYNG培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、O. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20，其余为水；pH7. 5。頂培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下=NaCl O. 15g/L、MgSO4 · 7H200. 25g/L、Κ2ΗΡ042· 28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4O. 0025g/L、(NH4) 2S040. 53g/L、葡萄糖1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。筛选培养基由FC培养基、KC1、G418、氨苄青霉素和头孢霉素组成，KCl的浓度为O. 2mol/L, G418的浓度为450ug/mL，氨苄青霉素的浓度为300ug/mL，头孢霉素的浓度为300ug/mL。实施例1、重组质粒pCAMBIA2301_idi的构建一、大肠杆菌idi基因的克隆及相关载体的构建1、大肠杆菌idi基因的克隆以大肠杆菌DH5 α为材料，用酚-氯仿法提取大肠杆菌DH5 α基因组；具体如下取500uL DH5a菌液，12000r离心5min，获得菌体。加650uL裂解液，振荡2min，放入65°C水浴锅直至裂解澄清。加入等体积的平衡酚氯仿异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，13000r离心15min。吸上清轻移至新管中，再用等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提一次，13000r离心15min。吸上清移至新管中，加入1/10体积的NaAcJP 2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min，13000r离心15min，弃上清。用700uL 75%的乙醇洗两次，室温开盖放置5min，让剩余的乙醇挥发完全。加20uL水溶解，后加O. 5uL RNase，放置于37°C 10分钟以除去RNA，-20°C保存。根据genebank公布的大肠杆菌idi基因序列(如序列表的序列I自5’末端第545-1093位核苷酸)，设计两端引物id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。以大肠杆菌DH5 α基因组为模板，id1-F和idi_R为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性45s，58°C退火Imin，72°C延伸lmin30s，运行32个循环后，72°C延伸15min。得到549bp的PCR产物，即为idi基因。2、重组质粒pBS-1di的构建I)用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切上述I得到的PCR产物，回收酶切产物；2)用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切克隆载体pBluescript IISK+，回收296 Ibp载体骨架；3)将步骤I)的酶切产物和步骤2)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-1di。二、重组质粒 pCAMBIA2301-1di 的构建(I)启动子CAMV35S的获得设计两端引物CAMV35S-F :5’-CCCAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCA-3’ ；CAMV35S-R :5’-GGAATTCAGTCCCCCGTGTTCTCT-3’。以质粒pCAMBIA2301为模板，以CAMV35S-F和CAMV35S-R为模板，PCR扩增，得到538bpPCR产物，即为启动子CAMV35S。PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。(2)用限制性内切酶HindIII和EcoR I双酶切(I) PCR产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶HindIII和EcoR I双酶切上述一得到的重组质粒pBS_idi，回收4372bp载体骨架。(4)将步骤(2)的酶 切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-CAMV35S-1di0(5 )终止子CYCl的获得以质粒pGAPZ a A为模板，CYCl-F和CYCl-R为引物，PCR扩增得到318bpPCR产物，即为终止子CYCl。设计两端引物CYCl-F :5’-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ;CYCl-R:5’-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3’PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，运行32个循环后，72 °C延伸15min。(6)用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切(5)得到的PCR产物，回收酶切产物。(7)用限制性内切酶Pst I和BamH I双酶切(4)得到的重组质粒pBS-CAMV35S-1di,回收 4907bp 载体骨架。(8)将步骤(6)的酶切产物和步骤(7)的载体骨架连接，得到重组质粒PBS-CAMV35S -1d1-CYCl。(9)用限制性内切酶HindIII和BanH I双酶切重组质粒pBS_CAMV35S -1d1-CYCl,回收1418bp酶切产物(idi基因表达盒CAMV35S -1d1-CYCl)；(10)用限制性内切酶HindIII和BamH I双酶切双元载体pCAMBIA2301，回收11608bp载体骨架。(11)将步骤(9)的酶切产物和步骤(10)的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA2301-1di。重组质粒pCAMBIA2301-1di的结构示意图及构建流程图见图1。将重组质粒pCAMBIA2301_idi送去测序，结果该质粒为将序列表中序列I插入PCAMBIA2301载体的HindIII和BamH I酶切位点间得到的载体。序列表中序列I (idi基因表达盒CAMV35S -1d1-CYCl)自5’末端第1-538位核苷酸为启动子CAMV35S，自5’末端第545-1093位核苷酸为基因idi，自5’末端第1100-1418位核苷酸为终止子CYCl。实施例2、高产叶黄素的转idi小球藻的获得一、转idi小球藻的获得采用农杆菌介导小球藻的转化，具体如下( I)小球藻原生质体的制备小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo. 6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。挑取小球藻STI002 (CGMCC 6951 ;也称为野生型小球藻)单藻落接种于FC培养基中，28 °C摇床培养至藻体长出。以1%的接种量转接于50mL新鲜的FC培养基，28°C摇床培养至对数期。以4000rpm的转速4°C离心7min收集藻细胞，用遇冷的无菌水洗涤藻细胞一次后，用预处理剂(预处理剂由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液配制(pH5. 8);所述溶质及其浓度为50mmol/L EDTA, 25mmol/L DTT)处理 30min。
4000rpm的转速离心7min收集藻细胞，加入IOmL酶处理液，28 °C摇床消化14小时，得到小球藻原生质体。(2)重组质粒pCAMBIA2301-1di通过电转化方法转化农杆菌菌株LBA4404，得到重组农杆菌 LBA4404/pCAMBIA2301-1di (HindIII 和 BamH I 酶切，得到 1418bp 的为阳性)。(3)挑取重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA2301-1di至TYNG培养基中，28°C摇床培养至对数期。离心收集菌体，用诱导培养基頂培养基重悬，调整农杆菌浓度为0D600=0. 6-0. 8加入终浓度为150umol/L的乙酰丁香酮，25°C预诱导5小时，收集菌液。(4)离心收集步骤(I)的原生质体，用诱导培养基頂培养基重悬后，加入步骤(3)得到的菌液中，25°C侵染24小时，得到藻体与农杆菌的共培养物。(5)离心收集步骤(4)中的藻体与农杆菌的共培养物，涂布于固体的筛选培养基，28°C培养7天，有藻落长出，得到转idi小球藻。同时，以未与农杆菌共培养的小球藻原生质体做阴性对照，将其涂布于筛选培养基。与农杆菌共培养的藻体涂布于筛选培养基后有藻落(即转idi小球藻)长出(图2A),而未与农杆菌共培养的藻体涂布于筛选培养基后没有藻落长出(图2B)。采用同样的方法将空载体pCAMBIA2301转入小球藻中，得到转空载体小球藻。二、转idi小球藻鉴定及表型分析1、二次筛选和表型鉴定将获得的转idi小球藻培养后在筛选培养基中划线，同时以野生型小球藻和转空载体小球藻做阴性对照。结果如图3所示，Il至17为转idi小球藻藻株，WT为野生型小球藻藻株；可以看出，转idi小球藻能够在筛选培养基上生长，而野生型小球藻不能生长。
转空载体小球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。2、转idi小球藻分子鉴定PCR验证外源基因在转idi小球藻基因组中的整合情况，具体如下提取转idi小球藻和野生型小球藻的基因，以基因组为模板，分别用引物id1-F/id1-R 和 NPTI1-F/NPTI1-R 进行 PCR 扩增。id1-F :5’-GGAATTCATGCAAACGGAACACGTC-3’ ；id1-R :5’-AACTGCAGTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3’。NPTI1-F : 5’-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’ ；NPT' I1-R :5’-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3’。PCR反应条件为941预变性51^11，941变性458，581退火lmin，72°C延伸lmin30s，运行32个循环后，72°C延伸15min。取5uL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图4 (idi基因片段PCR鉴定)和图5 (NPTII基因片段PCR鉴定)所示，其中，Il至17为转idi小球藻藻株，WT为野生型小球藻藻株；可以看出，转idi小球藻的基因组能够扩增出约549bpidi基因片段，而野生型小球藻的基因组中不能扩增出idi基因片段；转idi小球藻的基因组能够扩增出798bpNPTII基因片段，而野生型小球藻的基因组中不能扩增出798bpNPTII基因片段。结果表明，外源 基因已经插入小球藻基因组中，进一步证明转idi小球藻构建成功。转空载体小球藻基因组中不能扩增出idi基因片段，但能够扩增出798bpNPTII基因片段。3、转idi小球藻生物量的测定将转idi小球藻、转空载体小球藻和野生型小球藻以5%的量接种于含有IOOmL FC培养基的250mL三角烧瓶中，28°C、180r/min摇床培养5天，得到藻液。将藻液8000r/min离心IOmin收集藻体，除去上清液，藻体冷冻干燥后，称量干重。结果如图6所示，小球藻转化子I1、12、13、14和15的生物量与野生型无明显差异，但16和17的生物量和野生型相比有所降低。结果表明，农杆菌介导idi基因的转化对大部分小球藻的生长没有显著影响。转空载体小球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。三、转idi小球藻产生叶黄素含量的测定研磨转idi小球藻、转空载体小球藻和野生型小球藻为粉状，准确称取O. 05g转idi小球藻粉、转空载体小球藻粉和野生型小球藻藻粉，加入2. 5mL无水乙醇超声破碎30min (超声功率70%，温度35°C)，后加1. 5mL 20%K0H (质量百分含量)超声皂化(超声功率70%,温度35°C )IOmin ;得到溶液A ;用二氯甲烧、蒸懼水各20mL萃取,5000r/min离心5min,弃去上层水相，收集二氯甲烷相，40°C低压旋转蒸发干燥，提取物用色谱纯甲醇定容至5mL ；稀释5倍，过O. 22um滤膜后进行HPLC检测。HPLC检测的色谱条件为流动相为甲醇和水(体积比为95:5)，流速为O. 8mL/min，进样量10uL，检测波长为444nm。转idi小球藻为转idi 小球藻 I1、12、13、14、15、16、17。结果如图7所示，转idi小球藻I1、12、13和14的叶黄素含量与野生型的差异较大，野生型小球藻、转idi小球藻I1、12、13和14的叶黄素含量分别为O. 64mg/g、0. 75mg/g、0. 71mg/g、0. 73mg/g、0. 84mg/g, 14的叶黄素含量最高,与野生型相比提高了 30. 95%。进一步分析每升藻液(野生型和各个转idi小球藻每升藻液的干粉量不同，具体为如图6所示生物量；藻液的获取方式在实施例2的二的3。)中叶黄素的产量，结果如图8所示，转idi小球藻I1、13和14的叶黄素产量相对于野生型有一定提高，野生型小球藻、转idi 小球藻 I1、13 和 14 的叶黄素产量分别为1. 45mg/L、l. 77mg/L、l. 71mg/L、l. 98mg/L，其中14的叶黄素产量最高，比野生型提高了 36. 77%。转空载 体小球藻与野生型小球藻的结果无显著差异。
权利要求
1.一种培育转基因小球藻的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻； 所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在在于所述IPP异构酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在在于所述IPP异构酶编码基因以IPP异构酶编码基因表达盒的形式导入目的小球藻； 所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子； 所述IPP异构酶编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在在于 所述IPP异构酶编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻； 所述重组载体为将所述IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在在于 所述重组载体通过重组农杆菌导入目的小球藻；所述重组农杆菌为将所述重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。
6.由权利要求1-5所述方法得到的转基因小球藻。
7.—种重组载体，为将IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ； 所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子； 所述IPP异构酶编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。
8.—种重组菌，为将权利要求7所述的重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。
9.由权利要求6所述的转基因小球藻、权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的重组菌在制备叶黄素中的应用。
10.一种生产叶黄素的方法，包括如下步骤 1)无水乙醇超声破碎由权利要求1-5所述方法得到的转基因小球藻或由权利要求6所述的转基因小球藻，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ； 2)将所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。
全文摘要
本发明公开了一种高产叶黄素转基因小球藻的制备方法。本发明提供了一种培育转基因小球藻的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明将IPP异构酶编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的叶黄素含量和野生型小球藻相比最高提高30.95%；叶黄素产量和野生型相比最高提高36.77%，为高产叶黄素小球藻。
文档编号C12N15/63GK103045626SQ201210563819
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者林祥志, 马瑞娟, 荣辉, 林汝榕, 程汝滨, 王昭凯, 杨善军, 马勇, 陈水波, 柯秀蓉, 李惠丽 申请人:国家海洋局第三海洋研究所