一种普洱茶发酵优势细菌dgge标准条带制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种普洱茶发酵优势细菌DGGE标准条带制作方法，在普洱茶发酵过程中检测优势细菌时，利用DGGE细菌标准条带，快速鉴定发酵过程的优势细菌，该方法通过监控普洱茶发酵过程中的优势细菌条带，控制产品的质量。
【专利说明】一种普洱茶发酵优势细菌DGGE标准条带制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种普洱茶发酵优势细菌DGGE标准条带制作方法，在普洱茶发酵过程中检测优势细菌时，利用DGGE细菌标准条带，快速鉴定发酵过程的优势细菌，该方法通过监控普洱茶发酵过程中的优势细菌条带，控制产品的质量。
【背景技术】
[0002]普洱茶是以云南省一定区域内特有的大叶茶制成的晒青毛茶为原料，经过后发酵工艺生产而成的散茶和紧压茶。普洱茶色泽呈棕红褐色，汤色红浓明亮，具独特陈香，滋味醇厚回甘，耐冲泡。经现代临床医学验证，普洱茶对人体具有多种保健作用，例如降血脂、降血压、减肥、预防心血管疾病、抗癌等功效。
[0003]在普洱茶加工过程中，渥堆发酵是普洱茶品质形成的最为关键的一道工序，渥堆过程中茶叶品质随着发酵的进行，其汤色、香气、滋味、叶底都发生了深刻的变化，其中微生物在发酵过程中起着决定性的作用。在普洱茶的渥堆过程中微生物对茶叶中许多化学物质进行了转化，最终形成了普洱茶独特的风味以及多种功效。
[0004]优势微生物指在一定的环境下，具有最适生活度、繁殖最快、数量最多的微生物种群。普洱茶发酵过程中的优势微生物菌群，是决定普洱茶品质的关键。因此，若想控制普洱茶产品的质量，就要掌握普洱茶发酵过程中的优势微生物菌群的变化。
[0005]变性梯度凝胶电泳(DenaturingGradient Gel Electrophoresis, DGGE)最早是由Fisher和Lerman于1979年首先发明用于检测DNA突变的技术，1993年Muzyer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
[0006]与传统的微生物研究方法相比，PCR-DGGE技术以基因组DNA为研究对象，能够快速、准确地鉴定在自然环境及人工环境中的微生物种群，无需对所研究的微生物进行培养，这一特性克服了传统培养方法研究微生物群落时造成的微生物信息大量丢失的缺点，可以更为真实、客观、有效的反映样品中微生物群落尤其是复杂微生物群落的组成、结构和功能。另外PCR-DGGE可快速同时对多个样品进行分析，因此非常适合研究微生物群落的时空变化。
[0007]作为一种成熟的分子生物学方法，DGGE也存在着明显的缺憾，目前，商业化的DGGE标准条带(DGGE Marker)很少，根据不同规格DGGE每块胶上可以同时进行15-20个样品的电泳，样品较多时，不同样品之间的比较受到很大的限制，而不同时间的电泳产品由于电压、电流、缓冲溶液浓度、电泳时间等不同，造成样品之间比较缺乏标志物，即DGGEMarker。
[0008]本发明利用PCR-DGGE技术监测普洱茶发酵过程中优势微生物菌群的变化，其方法是，先制作一种优势细菌标准条带(即DGGE marker)，然后从生产过程中的普洱茶提取优势细菌DGGE条带，和 上述标准条带进行比较，如果吻合说明可以保证普洱茶质量，如果不吻合，通过调整微生物的量或调整工艺方法，使达到吻合，从而保证生产出的普洱茶质量均一，有利于普洱茶质量的稳定。此方法克服了传统的开放式发酵中完全依靠经验，无法严格保证微生物的重复性,也无法抑制有害微生物的弊端。
【发明内容】
[0009]本发明提供一种普洱茶发酵优势细菌DGGE标准条带制作方法。
[0010]所述方法包括以下步骤:
[0011]步骤1，从合格的普洱茶样品中获得标准优势细菌DGGE条带；
[0012]步骤2，由标准优势细菌DGGE条带获得优势细菌标准条带。
[0013]其中步骤I的方法如下:
[0014]I)取普洱茶发酵的合格样品；
[0015]2)提取微生物总DNA ；
[0016]3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行细菌16S rDNA的PCR扩增；
[0017]4)对扩增后的DNA进行变性梯度凝胶电泳，经sybrgreen I染色后得到DGGE标准图谱；
[0018]5)将图谱中的优势条带进行切胶回收，得到标准优势细菌DGGE条带。
[0019]其中步骤2的方法如下:
[0020]I)取标准优势细菌DGGE条带；
[0021]2)以标准优势细菌DGGE条带的DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
[0022]3)将扩增产物按照一定比例混合；
[0023]4)对其进行变性梯度凝胶电泳,经sybrgreen I染色，即得DGGE优势细菌标准条带。
[0024]以上步骤I中，
[0025]其中I)所述发酵合格样品为经多次机械柜发酵后挑选出来的品评打分和理化指标检测复合普洱茶标准的茶叶样品。
[0026]其中2)所述提取微生物总DNA，包括提取待测样品中细菌16S rDNA,采用原位的提取方法提取其中的总DNA。
[0027]其中3)所述在专用引物的引导下进行细菌总DNA的PCR扩增，所述的专用引物如下:
[0028]第一步扩增采用的引物为16sl:5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16s2:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ 。
[0029]第二步扩增采用的引物为:338fGC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
[0030]PCR扩增条件为巢式PCR扩增:先加入第一步扩增引物16S1U6S2和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4 min，然后在94°C变性45s，50°C-55°C引物复性45s，72°C引物延伸1.5min，循环30次，72°C终延伸10 min ;取其产物进行100倍稀释后作为模板，以第二步扩增引物338fGC和R518进行扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4min，然后在94°C变性45s，50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸 10 min。
[0031]其中4)所述变性梯度凝胶电泳，方法是:采用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30-60%，电泳缓冲液采用IXTAE的缓冲液，电压100V，时间10h。
[0032]在步骤2中，
[0033]其中2)所述专用引物及PCR扩增条件与步骤I中所述专用引物及PCR扩增条件相同。
[0034]其中3)所述一定比例是将各条带按照等比例进行混合。
[0035]其中4)所述变性梯度凝胶电泳，方法与步骤I中变性梯度凝胶电泳方法相同。
[0036]本发明得到的DGGE优势细菌标准条带，是对合格的普洱茶样品进行测定得到的细菌DGGE条带，通过比较生产过程样品的细菌DGGE条带和本发明所得的标准条带，可以快速准确的确定每批产品的优势细菌是否一致，同时可以据此确定产品是否合格。
[0037]本发明的优点在于:
[0038]1、通过细菌DGGE标准条带可以快速鉴定发酵过程的优势细菌，减少切胶、扩增、测序鉴定等步骤，节省时间和成本。
[0039]2、该方法通过监控普洱茶发酵过程中的优势细菌条带，控制产品的质量。
【具体实施方式】
[0040]以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 [0041]实施例1
[0042]取合格的普洱茶发酵样品，首先提取该样品中微生物的总DNA，提取方法是:称取Ig样品，加入200mg玻璃珠,使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡IOmin混合均匀，70°C水浴IOmin，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min, 13000g离心5min。上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65°C水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液,混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理。加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，1000Og离心lmin，弃去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，1000Og离心lmin，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，1000Og离心lmin,弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff rash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min,将柱子放入50°C烘箱30min。把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elutionbuffer到柱子中心，65°C水浴lOmin, 13000g离心lmin。将离心洗脱液重新加入柱子中，65°C水浴lOmin，13000g离心2min，所得洗脱液即为提取好的微生物总DNA。
[0043]对于细菌16S rDNA的PCR扩±曾，第一步扩增采用的引物为16sl:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 16s2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3，。第二步扩增采用的引物为:338fGC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和R518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR扩增条件为巢式PCR扩增:先加入第一步扩增引物16S1U6S2和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4 min，然后在94°C变性45s，50 V -55 V引物复性45s，72 °C引物延伸1.5min,循环30次，72 V终延伸10 min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以第二步扩增引物进行扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4min，然后在94°C变性45s，50_55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin,循环30-35次，72°C终延伸10 min。目的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。
[0044]细菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析:
[0045]采用DC0DE?系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为:将获得的样品的16S扩增产物(约230bp)混合，取200ng用10%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离(丙烯酞胺浓度30-60%，电泳缓冲液1XTAE，80V，10h)，然后切下目的泳道区域，用sybrgreen I对变性聚丙烯酞胺凝胶染色，用quantity one凝胶成像扫描系统对银染条带进行照像，得到细菌的PCR-DGGE谱图。
[0046]将谱图中的优势条带进行切胶回收，以回收条带为模板进行第二次PCR扩增，扩增的体系和条件同第一次扩增。将优势条带按照1:1的体积比进行混合，以细菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行凝胶成像扫描与分析，sybrgreen I染色后进行检验，即得DGGE优势细菌标准条带。
【权利要求】
1.一种普洱茶发酵优势细菌DGGE标准条带制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤1，从合格的普洱茶样品中获得标准优势细菌DGGE条带； 步骤2，由标准优势细菌DGGE条带获得优势细菌标准条带。
2.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤I的方法如下: 1)取普洱茶发酵的合格样品； 2)提取微生物总DNA； 3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行细菌16SrDNA的PCR扩增； 4)对扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，经sybrgreenI染色后得到DGGE标准图谱； 5)将图谱中的优势条带进行切胶回收，得到标准优势细菌DGGE条带。
3.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤2的方法如下: 1)取标准优势细菌DGGE条带； 2)以标准优势细菌DGGE条带的DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增； 3)将扩增产物按照一定比例混合； 4)对其进行变性梯度凝胶电泳，经sybrgreenI染色，即得DGGE优势细菌标准条带。
4.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中I)所述合格样品，为经多次机械柜发酵后挑选出来的品评打分和理化指标检测复合普洱茶标准的茶叶样品。
5.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中2)所述提取的微生物总DNA，包括提取待测样品中细菌16S rDNA。
6.根据权利要求2或3任何一项制作方法，其特征在于，其中所述专用引物如下: 第一步扩增采用的引物为 16sl:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16s2:5’ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ 。 第二步扩增采用的引物为:338fGC:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACC GCGGCTGCTGG-3’。
7.根据权利要求2或3任何一项制作方法，其中， PCR扩增条件为巢式PCR扩增:先加入第一步扩增引物16S1U6S2和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4 min，然后在94°C变性45s，50°C _55°C引物复性45s，72°C引物延伸1.5min，循环30次，72°C终延伸10 min ;取其产物进行100倍稀释后作为模板，以第二步扩增引物338fGC和R518进行扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4min，然后在94°C变性45s，50-55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin，循环30-35次，72°C终延伸10 min。
8.根据权利要求2或3任何一项制作方法，其特征在于，其中所述变性梯度凝胶电泳，方法是:采用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30-60%，电泳缓冲液采用IXTAE的缓冲液，电压100V，时间10h。
9.根据权利要求3的制作方法，其特征在于，其中3)所述一定比例是将各条带按照等比例进行混合
10.根据权利要求1的 制作方法制作的DGGE优势细菌标准条带。
【文档编号】C12Q1/04GK103898200SQ201210583594
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】李长文, 李巍, 梁慧珍, 山其木格, 张长霞, 陈丽君, 刘冰 申请人:云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司